Trizol法提取RNA实验步骤
TRIZOL法提取RNA
TRIZOL法提取细胞总RNA
(1)将制备的带有细胞沉淀的Eppendorf管中加入1ml TRIZOL溶液，用手反复摇匀至细胞碎块完全被裂解，如不易完全裂解，可用移液器带有1ml无菌吸头反复吹打、研磨，至组织细胞完全裂解，液体基本澄清为止，必要情况下，可再次加入少许TRIZOL溶液。
(2)将上述Eppendorf管置室温(25℃)静置15min后(也可置4℃较长时间)，每管加
0.2ml氯仿(02ml/ml)，在手中反复振荡摇匀，室温静置10min。
(3)将Eppendorf管置于高速台式冷冻离心机，或将普通离心机事先置4℃冰箱预冷。
在4℃12 000 g/min离心10min。
(4)小心吸取上层水相置于另一无菌的新的Eppendorf管中，内含有提取的细胞总RNA。
(5)于管中加入0.5ml异丙醇，室温沉淀10min。
(6)4℃12 000 g/min离心10min，弃上清，沉淀用75%无水乙醇洗两次。
(7) 4℃8000 g/min离心10min，
(8) 最后让沉淀的RNA在室温自然干燥，切勿抽干。
(9) 每管用20 μl无RNAase的纯水重悬干燥后的RNA，置于冰浴立即用于cDNA合成或置-70℃长期保存。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizoｌ法使用步骤一、分离纯化得基本原理研究基因得表达与调控时常常要从组织与细胞中分离与纯化ＲＮA。
ＲNA质量得高低常常影响cＤNA库,ＲT-PCＲ与Ｎorthern Ｂloｔ等分子生物学实验得成败。
Ｔrizol就是一种新型总ＲNＡ抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出得核酸酶。
二、用户需自备得试剂与材料无水乙醇、氯仿、Ｇlycｏgen(可能需要)、 1、５ｍｌ Eppeｎｄｏrf管(ＲNase-frｅe)、 Tips(ＲNase－free)三、准备工作RNａse酶非常稳定,就是导致ＲNＡ降解最主要得物质。
它在一些极端得条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。
用常规得高温高压蒸气灭菌方法与蛋白抑制剂都不能就是ＲＮase完全失活。
它广泛存在于人得皮肤上,因此,在与RＮA制备有关得分子生物学实验时,必须戴手套。
RNase得又一污染源就是取液器,根据取液器制造商得要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用ＤEPC（焦炭酸二磷脂,一种ＲＮａse抑制剂)配制得7０％乙醇擦洗取液器得内部与外部,基本达到要求。
取ＲＮａｓｅ－free得物品时必须戴手套。
1、料制品得处理尽可能使用无菌,一次性塑料制品，已标明RNasｅ-Fｒee 得塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下:1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEＰＣ使DEＰC得终浓度为０、1%。
注意:DEP Ｃ为剧毒物,活性很强，小心在通风柜中使用。
2)处理得塑料制品放入一个可以高温灭菌得容器中,注入ＤEPC水溶液,使塑料制品得所有部分都浸泡到溶液中。
3)在通风柜中室温处理过夜。
4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已ＤEＰＣ水处理过得塑料制品得烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适得温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻与金属物品250°C烘烤3小时以上。
TRIZOL试剂提取细胞RNA和蛋白步骤
TRIZOL试剂提取细胞RNA和蛋白步骤
1. 0.3-0.4 ml Trizol 加入每个6 cm皿，刮取细胞到离心管中，静置5-10分钟。
2. 加入0.1 ml氯仿，震荡，静置10分钟，4度13000 rpm 离心15分钟。
3. 取上清用于提取RNA，下层用于提取蛋白。
上清的处理(RNA)：
1、上清打入新的RNase free离心管，加等量异丙醇，震荡，静置10分钟。
2、4度12000 g离心15分钟，弃去上清（倒掉，枪头在管口吸），沉淀为RNA。
3、加入1 ml 75% 乙醇（现配，用DEPC水稀释无水乙醇）洗涤沉淀。
4、4度12000g 离心5分钟，弃去上清（倒掉，枪头在管口吸），管口倒置，在卫生纸上，晾干15分钟。
5、加入20微升DEPC水溶解沉淀，微量分光光度计测质量。
下层的处理(蛋白)：
1、把中层吸掉，下层液加200微升无水乙醇混匀，静置5分钟，4度5500rpm离心10分钟，取上清移入新的离心管。
2、往新的离心管液体里加入1毫升异丙醇，充分混匀，室温静置10分钟，4度13000rpm 离心10分钟，弃上清。
3、加入1毫升0.3 mol/L 95%乙醇盐酸胍溶液，室温静置20分钟，4度13000rpm离心10分钟，弃上清。
4、重复步骤3 2次
5、加入1毫升无水乙醇，室温静置20分钟，4度13000rpm离心10分钟，弃上清。
6、室温干燥15分钟，用现配1% sds溶液溶解蛋白，不溶物以4度12000rpm离心10分钟去除。
7、上清液与5x loading buffer混匀，煮沸10分钟，存于-20度冰箱待用。
trizol组织提取rna步骤
trizol组织提取rna步骤Trizol组织提取RNA步骤引言：RNA是一种重要的生物大分子，它在生物体内起着基因表达和调控的重要作用。
为了研究RNA的结构和功能，科学家们经过不断的探索和研究，发展出了一系列有效的RNA提取方法。
其中，Trizol 组织提取RNA方法是目前应用较广泛的一种方法，本文将详细介绍Trizol组织提取RNA的步骤。
步骤一：样品准备需要准备好待提取RNA的组织样品。
样品可以是动植物组织，也可以是细胞。
样品应该新鲜、完整，并且需要在提取RNA前保存在液氮中，以保持RNA的完整性。
步骤二：组织破碎将样品从液氮中取出，放入细胞破碎液中。
细胞破碎液可以是Trizol试剂，也可以是其他适用的细胞破碎液。
然后，使用离心机将样品离心，以破碎组织细胞，并释放RNA。
步骤三：加入氯仿将破碎的组织样品转移到离心管中，加入适量的氯仿。
氯仿可以与Trizol试剂中的异丙醇和酚形成两相体系，用于分离RNA。
步骤四：离心分离将离心管盖紧，并放入离心机中进行高速离心。
离心的目的是将样品中的RNA分离到上清液中，底物中会残留DNA和蛋白质。
步骤五：收集上清液将离心管从离心机中取出，小心地将上清液转移到一个新的离心管中。
上清液中含有RNA，可以继续进行后续的提取。
步骤六：沉淀RNA向上清液中加入等体积的异丙醇，使其浓度达到70%。
然后，轻轻地摇晃离心管，使RNA与异丙醇充分混合。
接下来，将混合液放置在-20°C的冰箱中，使RNA沉淀。
步骤七：离心沉淀将离心管放入高速离心机中，进行高速离心。
离心的目的是使RNA 沉淀到离心管底部。
步骤八：去除上清液小心地将上清液倒出，注意不要损坏沉淀的RNA。
可以使用70%乙醇进行洗涤，以去除残留的盐和污染物。
步骤九：干燥RNA将离心管中的RNA沉淀放置在室温下，使其自然干燥。
注意不要过度干燥，以免影响RNA的质量。
步骤十：溶解RNA在干燥的RNA沉淀中加入适量的去离子水或RNase-free水，轻轻摇晃或振荡离心管，使RNA溶解。
RNA提取步骤trizol法
Trizol-RNA提取步骤
1；取1.5ml去核酸酶EP管，分别加入250ul样品和750Trizol裂解液剧烈震荡30S，室温静置10min。
；
2；直接往EP管中再加入200ul三氯甲烷（氯仿），剧烈震荡混匀30S 直至无分相出现，室温静置5min。
3；把样品放入事先预冷的离心机中，12000rpm,4℃离心15Min。
小心将样品取出。
4；另取干净的去核酸酶EP管，分别往EP管中加入600ul异丙醇。
将离心完后的样品管中的上清液（约600ul左右）小心转移到装有异丙醇的管子中并轻轻上下颠倒混匀，4℃静置10min.（注意：吸取上清液时严禁吸到中间蛋白层或下层液。
）
5；将样品放入预冷的离心机中12000rpm,4℃离心10Min.小心把样品管取出并轻轻倒掉上清液。
6；往样品管中加入1ml 75%乙醇溶液（DEPC水配制）。
轻轻上下颠倒几次，12000rpm,4℃离心5Min。
小心把样品管取出并轻轻倒掉上清液。
7；把样品放入抽干机中60℃抽干5-7分钟。
（或者尽量把乙醇去除干净后室温晾干10-15min直至乙醇挥发干净）。
此步骤勿关闭管盖。
8；将抽干好的样品取出，并根据需要加入20-50ul DEPC水（或Elution Buffer）溶解沉淀物。
此溶液即为总RNA溶液。
Trizol法提取RNA步骤
1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。
注：此时可放入-70℃长期保持。
2、按200ul氯仿ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后冰上放置15min。
注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
3、4℃16,000g离心15min。
4、吸取上层水相，至另一离心管中。
注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下
层酚相。
5、按0.5ml异丙醇ml Trizol 加入异丙醇混匀，冰上放置5-10min。
6、4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。
7、按1ml 75%乙醇ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
8、4℃75000g离心5min，尽量弃上清。
重复洗一次。
9、室温晾干或真空干燥5-10min。
注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
10、可用30ul H2O，TE buffer溶解RNA样品。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)一、实验步骤1. 涂布区域准备- 确保实验室台面干净整洁，并消毒工作区域。
- 准备所需的试剂和材料，包括Trizol试剂、异丙醇、70%乙醇、无菌乙酸纯水等。
2. 细胞样本处理- 从培养皿中收集所需的细胞样本，注意避免污染。
- 使用无菌PBS缓冲液洗涤细胞，以去除培养基和细胞碎片。
- 加入适量的Trizol试剂至细胞样本中，充分悬浮细胞。
- 注意：为了保护RNA的完整性，在细胞样本处理过程中尽量迅速操作，避免长时间接触Trizol试剂。
3. 提取RNA- 将含有细胞样本和Trizol试剂的混合物转移到无菌离心管中。
- 加入适量的氯仿，摇匀混合，并静置15分钟，使混合物体相分离。
- 低速离心10分钟，将上层的无色透明液体转移到新的无菌离心管中。
4. 分离RNA- 加入等体积的异丙醇，轻轻倾斜离心管，使RNA沉淀形成。
- 低速离心10分钟以沉淀RNA，上清液中通常含有DNA。
- 倒掉上清液，并加入70%乙醇洗涤RNA沉淀，轻轻颠倒离心管以洗涤RNA。
- 低速离心5分钟，倒掉乙醇。
5. 干燥RNA- 用洗涤过的无菌乙酸纯水溶解RNA沉淀，轻轻颠倒离心管以溶解RNA。
- 将溶解的RNA转移至无菌离心管中。
- 在室温或37摄氏度下迅速干燥RNA，避免长时间曝露。
6. 储存RNA- 使用RNase-free水溶解RNA沉淀，测定RNA的浓度和纯度。
- 分配等量的RNA至多个RNase-free离心管中，储存在-80摄氏度的冰箱中。
二、实验原理Trizol法是一种常用于提取RNA的方法，其原理如下：1. 细胞破裂- Trizol试剂能够迅速破坏细胞膜，使细胞释放出RNA。
- Trizol试剂中含有酚和氯仿，酚用于破坏脂质，氯仿用于改变混合物的密度，从而使RNA与其他细胞成分分离。
2. 分离RNA- 经过破裂后，细胞内的DNA、RNA和蛋白质等成分被混合在一起，形成上清液。
TRIzol法提取步骤
TRIzol法提取步骤1、研磨：不多于0.1g植物材料。
2、抽提:向离心管中加人l ml TRizol，充分混匀，室温放置5min。
3、4℃12000rpm，离心10min。
取上清，转移到新的无RNase的新离心管中，加人0.2mL氯仿，盖好盖后，用手剧烈震荡15s，室温放置3min。
4℃11000rpm离心15min，样品分层，把水相约600ul转移至新管中。
5、沉淀:在得到的水相中加人500μl异丙醇，混匀，室温放置10min，4℃11000rpm离心10min，去上清。
6、洗涤:加人lml75%乙醇洗涤沉淀，4℃7500rpm离心5min将75%乙醇用移液枪吸净，将离心管在超净工作台中吹干(大约3min)时间过长，RNA不易溶解，加人30μl无RNase水混匀溶解沉淀。
方法二：(1)取小于0.2g的小麦黄花苗尽快液氮研磨成粉末状后移人1．5ml小指管；(2)立即加lml TRIzolReagent，轻弹管底，尽快混合样品至重悬；(3)水平放置小指管室温孵育20min；(4)4 C，12000rpm，离心10min；(5)移澄清上清液人一新的1．5ml小指管中，加人0．2ml氯仿，盖紧管盖，用力摇动1．5ml小指管15s，室温孵育2min-3min；(6)4 C，12000rpm，离心15min；(7)移最上层水相到新的1．5ml小指管中，加入0．25ml异丙醇、0．25ml 高盐混合液(O.8mol/l 柠檬酸钠+1.2mol/l NaCl)混匀，室温孵育30min；(8)4℃，12000rpm，离心10min；(9)弃上清，用lml 75％乙醇(用DEPC水来配)洗沉淀，涡旋混合样品，4℃，12000rpm离心5min；(1O)弃上清，短暂干燥RNA沉淀5min-10min，用RNase-free(DEPC处理过的)水溶解沉淀，-70℃保存，供以下实验使用。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)RNA提取是一种常用的实验技术，它可以用于研究基因表达、蛋白质合成等方面。
而Trizol法是一种常用的RNA提取方法，下面我将详细介绍该方法的实验步骤及原理。
一、实验材料和设备1. 细胞样本：如洋葱、酵母等植物或动物细胞；2. Trizol试剂盒：包括Trizol reagent、DMEM/F12培养基、异丙醇、氯仿等试剂。
3. 离心机：用于分离细胞和RNA;4. 紫外分光光度计：用于测定RNA的浓度和纯度。
二、实验步骤1. 取适量的细胞样本，加入适量的DMEM/F12培养基中，用离心机离心去除细胞碎片和杂质。
2. 将上清液转移到新的管子中，加入2 mL异丙醇，轻轻摇匀，使其与细胞充分混合。
3. 加入1 mL Trizol reagent,混匀后室温下静置10 min;4. 离心管中液体分为4层，从上往下分别是黄色(含有RNA)、白色(含有蛋白质)、透明(上清液)和红色(含有DNA)。
取出黄色层进行下一步处理。
5. 用吸头将黄色层的RNA吸取到一个新的试管中，加入适量的氯仿，轻轻摇匀。
6. 离心试管，将RNA和氯仿分离。
7. 用吸头将上层的白色RNA溶液吸出一部分，加入等量的异丙醇，混匀后离心。
8. 将上清液倒掉，留下含RNA的沉淀物。
9. 用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度。
三、实验原理Trizol法提取RNA的原理是利用Trizol reagent中的Trizol和氯仿对细胞进行裂解，使RNA释放出来。
具体来说，Trizol reagent中的Trizol是一种有机溶剂，它能够破坏细胞膜并将细胞内的RNA溶解在水中。
而氯仿则是一种脂溶性溶剂，它能够与RNA结合形成复合物，使得RNA更容易被提取出来。
在实验过程中，首先加入异丙醇的作用是破坏细胞膜，使RNA更容易释放出来。
然后加入Trizol reagent,使其与细胞充分混合并裂解细胞。
Trizol法提取RNA-电子版
Trizol法提取RNA步骤
1．胰酶消化六孔板细胞（每孔相当于3.5cm皿），每孔细胞收于EP管中，PBS洗一遍（或弃旧培养基，1ml PBSA洗2遍，直接向孔中加入600ul Trizol，吹打细胞，并吸入EP 管中即可，无需胰酶消化）；
2．向细胞沉淀中加入600ul Trizol裂解细胞5min；
3．加入三氯甲烷（氯仿）120ul（V三氯甲烷：V Trizol=1:5）提取核酸；
4．振荡10s至粉红色出现时停止，室温静置2~3min后分层；
5．4℃，12000×g，离心15min，离心后，底部为细胞碎片，中间为DNA，上层为RNA产物；
6．吸取上层液相RNA提取液，置另一个EP管中（小心勿吸到沉淀，约为250~300ul）；7．每管加入异丙醇300ul（V异丙醇：V TRIZOL=1:2）（异丙醇为有机溶剂，根据相似相溶原理，RNA不溶于其中，其他杂质溶于其中）；
8．上下颠倒，轻轻混匀，室温下静置10分钟；
9．4℃，12000×g，离心10分钟，弃上清；
10．用800ul 75%乙醇（用1‰DEPC处理水配制）洗沉淀，振荡器振荡15秒钟；11．4℃，12000×g，离心5分钟，弃上清（挥发乙醇2分钟）；
12．每管加入20~60ul DEPC处理水（示沉淀量而定），金属浴60℃溶解5分钟；13．4℃，12000×g，离心5分钟，吸取上清置于新的EP管中，-80℃冻存；
注意：EP管、移液器头用1‰DEPC水（不能高压灭菌）浸泡过夜，甩干后高压灭菌。
DEPC 处理水配制：999ul+1ul DEPC，高压灭菌。
Trizol法提取组织总RNA步骤
1.研磨制样：先向研钵中加入少量液氮，等液氮挥发使研钵预冷。
再向研钵内倒入适量液氮。
从-70度冰箱取出组织，用镊子从冻存管中夹取一小块放入研钵中。
迅速研磨组织块，成粉末时加入1ml的trizol，继续研磨，可看到粉末成浆，由浓变稀，直至组织样全部溶解，用移液枪吸到无酶EP管。
2. Trizol法提取RNA
1) 室温静置3-10min，使蛋白质变性；
2) 加入1/4~1/5体积的氯仿，颠倒震荡1min，室温静置3-5min，静置分层，然后4℃离心，12000rpm，5min。
（核蛋白复合体彻底裂解）
3) 吸取上清至无酶的EP管中，加入等体积的酚：氯仿，颠倒震荡1min，室温静置3-5min，静置分层，然后4℃离心，12000rpm，5min，取上清。
若是细胞RNA提取可只加等体积氯仿抽提一次，但对于组织一般都要重复该步骤，至没有蛋白层为止，一般抽提两次。
（离心后会分为三次：上层：水相，中间层：DNA，下层：蛋白。
为了降低水相和有机相分界处DNA污染，不要吸取水相的最下层）4) 加入等体积的预冷的异丙醇，颠倒混匀，冰上静置30min，然后4℃离心12000rpm，30min，弃上清。
（此步骤主要是充分沉淀RNA，然后收集。
故步骤中的冰置30min,也可以是在-20°放置半小时以上，甚至过夜）
5) 加入100ul 70%乙醇，将沉淀吹起来，注意不要吹散，然后4℃12000rpm，5min。
6) 弃上清，空气中挥发乙醇，至壁上无液滴。
7) 加入适量DEPC水，（一般为20ul）溶解。
8) 分光光度计检测RNA浓度和OD值，将Total RNA稀释至1ug/ul，备用。
trizol提RNA步骤
3. 本实验cDNA文库的构建（一步法）3.1 提取mRNA（1）用液氮将蜘蛛研磨成粉末状，然后放入EP管中（2）取0.8mL动物组织悬液，于2.0m L离心管加1.0μL Trizol 轻轻混匀，室温静置15min（3）加0.2mL氯仿，漩涡振荡15s，室温静置10min。
4℃，12000g 离心15min。
（4）吸取上层水相至2.0mL离心管中，加入1.0mL异丙醇轻轻颠倒混匀，-20℃沉淀20min。
4℃，12000g离心15min，倒掉上清。
（5）沉淀中加入1mL 75%乙醇，10000g离心5min，弃乙醇。
（6）沉淀自然干燥后溶于25μL DEPC水中（-70℃冻存）3.2 电泳测定RNA提取是否成功（1）选择孔径大小合适的点样梳，垂直架在胶板的一端，使点样梳底部离电泳槽水平面的距离为0.5~1mm。
（2）用电子称称取0.25g琼脂糖（2.5%琼脂糖），小心移入三角瓶中，加入10μL ddH2O，稍稍混匀后加热至沸腾，然后保温于65℃水浴中。
（3）量取3.4mL甲醛，4mL 5×MOPS，2.6mL ddH2O，混匀后于65℃水浴中保温。
（4）将步骤（2）和（3）中的溶液在65℃水浴中混匀，并将混合液保温在65℃水浴中备用。
（5）加入1μL Goldviewma II，轻轻摇匀，倒入装配好的制胶槽中，胶厚3~5mm，小心将气泡赶走或吸出。
（6）待凝胶凝固后，小心取出点样梳。
（7）在电泳槽中加入1×MOPS电泳缓冲液，将胶板放入电泳槽中（点样孔一端靠近电泳槽的负极），使电泳缓冲液没过胶面。
（8）取待测样品各0.5μL ，以5:1的比例各加入3μL 点样缓冲液，用移液枪反复吹吸混匀。
混合后，移液枪点样，记录样品点样顺序及样量。
（9）连接电泳槽与电泳仪之间的电源线，正极为红色，负极为黑色。
（10）开启电源，开始电泳，最高电压不超过5V/cm。
（11）当指示剂跑过胶板的2/3，可终止电泳；切断电源后，戴好一次性塑料手套，小心取出电泳槽，滑出凝胶，置于凝胶成像仪中观察，拍照，保存照片。
Trizol法提取RNA
Trizol 法提取RNA实验步骤一、需要的试剂：1.氯仿2.异丙醇3.75%乙醇（in DEPC-treated water)4.RNase free水或者0.5% SDS溶液[准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。
静置过夜，然后高压灭菌。
0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]1、组织匀浆(1) 取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。
(2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。
(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。
2、相分离加入0.2 ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离心12,000×g，15 minutes ，2 - 8°C。
离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。
RNA只存在于水相中。
水相占总TRIZOL的60%。
3、RNA沉淀将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离心12,000 ×g ，10 minutes，2 - 8°C。
离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。
4、RNA洗涤去上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500 ×g ，5 minutes，2 -8°C。
5、RNA再溶解去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。
注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理
Trizol法提取RNA实验步骤及原理实验原理：Trizol法是一种常用的RNA提取方法，其原理是利用三种有机物（TRIzol、氯仿和异丙醇）的混合物，使细胞或组织中的RNA在低温下与TRIzol发生相互作用，形成RNA-TRIzol复合物。
加入氯仿后，RNA-TRIzol复合物会转移到有机相中，而DNA和蛋白质则留在水相中。
通过离心分离有机相和水相，可将RNA从有机相中分离出来。
最后，加入丙醇沉淀RNA，即可得到纯度较高的RNA。
实验步骤：1. 细胞或组织样品的收集：将细胞或组织样品收集到离心管中。
2. 加入Trizol试剂：向离心管中加入适量的Trizol试剂，按比例加入的量为1mL Trizol/100mg组织或1×10^7个细胞。
3. 细胞或组织样品的破碎：使用超声波或均质器等方法将细胞或组织样品破碎。
4. 加入氯仿：向离心管中加入适量的氯仿，按比例加入的量为0.2mL氯仿/1mL Trizol。
5. 混合离心：将离心管中的混合物混合均匀后，离心分离有机相和水相。
6. 收集RNA：将有机相转移到新的离心管中，加入适量的异丙醇，沉淀RNA。
7. 洗涤RNA：用75%乙酸酒精洗涤RNA。
8. 溶解RNA：用RNase-free水或DEPC水溶解RNA。
9. 检测RNA：使用比色法或琼脂糖凝胶电泳等方法检测RNA的纯度和浓度。
注意事项：1. Trizol试剂应保存在4℃下，避免阳光直射和冰冻。
2. 操作过程中要注意RNA的保护，避免RNA的降解。
3. 操作过程中要使用无菌技术，避免污染。
4. 操作过程中要注意个人防护，避免接触到有害物质。
5. 实验前要准备好所有所需试剂和设备，确保实验顺利进行。
6. 实验后要及时清洗和消毒实验器材，避免交叉污染。
trizol法提取rna步骤
trizol法提取rna步骤TRIzol法提取RNA步骤RNA是一种重要的生物大分子，具有多种功能。
在研究生物学、医学等领域中，需要从细胞或组织中提取RNA。
TRIzol法是一种常用的RNA提取方法，其原理是利用TRIzol试剂将细胞或组织中的RNA溶解，并与其他生物大分子分离。
本文将详细介绍TRIzol法提取RNA 的步骤。
材料准备- TRIzol试剂- 高纯度异丙醇- DEPC水- RNase-free微量离心管和移液器- 1.5 mL离心管- 无菌手套和口罩- 冰桶和冰块步骤一：样品采集首先需要采集样品，可以是细胞或组织。
对于细胞，可以使用离心机将其沉淀；对于组织，则需要切碎并加入适当量的PBS缓冲液。
步骤二：样品裂解将采集到的样品加入适量的TRIzol试剂，并使用移液器充分混合。
然后使用高速离心机将样品离心10分钟，使其裂解。
步骤三：RNA分离将上述裂解物转移至新的离心管中，并加入等体积的异丙醇。
充分混合后，使用高速离心机离心10分钟，使RNA沉淀到底部。
步骤四：RNA洗涤将上述沉淀物转移至新的离心管中，并加入75%的乙醇。
充分混合后，使用高速离心机离心5分钟，去除残留的TRIzol试剂和异丙醇。
步骤五：RNA溶解将上述沉淀物转移至新的离心管中，并加入适量的DEPC水。
充分混合后，在65℃下孵育10分钟，使RNA完全溶解。
步骤六：RNA保存将溶解后的RNA转移至RNase-free微量离心管中，并存放在-80℃冰箱中保存。
注意事项- 在操作过程中要穿戴无菌手套和口罩，以避免污染。
- TRIzol试剂具有强烈腐蚀性，需注意安全操作。
- 所有使用到的器材和试剂都要事先消毒处理。
- 操作过程中需保持低温环境，以避免RNA降解。
- RNA提取后需立即存放在-80℃冰箱中，以避免RNA降解。
trizol试剂法
Trizol试剂法是一种用于提取RNA的常用方法，其操作简单，可以同时处理多个样品，且提取的RNA无DNA 和蛋白质污染。
以下是其基本步骤：
1. 将细胞或组织样本磨碎，具体操作方法是将细胞或组织样本放入匀浆器中，加入Trizol试剂，通过反复
研磨来破碎细胞。
2. 加入氯仿，用力震荡后离心。
此步操作可使不同物质分相，将RNA留在水相中。
3. 将水相转移至新的EP管中，加入异丙醇后再次离心。
这一步可促进RNA沉淀。
4. 去除上清液，用75%乙醇洗涤RNA沉淀，最后让RNA在室温下自然干燥。
5. 用无RNA酶的水溶解RNA沉淀。
此外，Trizol试剂法提取RNA时，需注意以下几点：
1. 在收集到生物材料后应尽快进行RNA制备工作，以避免RNA降解。
2. 提取RNA时，每50~100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细
胞，每5~106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞。
3. 提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于 Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase 保护分
析等。
请注意，对于不同类型和状态的材料，可能需要调整Trizol试剂法的具体步骤和参数。
因此，在实验过程中应根据实际情况进行调整。
RNA 提取(Trizol法)
定位克隆实验室 2010-12-27 胡文波修订- 1 - Trizol 法提取 RNA操作步骤：1. 准备镊子剪刀等材料、试剂，注意取材环境的消毒。
2. 加300ul Trizol 溶液至装有材料的无RNase 的1.5ml 离心管中。
3. 研磨材料，另加700ul Trizol ，涡旋1min 。
4. 离心：15000g 4℃ 10min 。
5. 吸取上清液至新的离心管中，注意不要接触沉淀。
6. 加200ul （1/5 Trizol 体积）氯仿，用手剧烈振动离心管2-5min,然后涡旋15s,室温下孵育样品10min 。
7. 离心：15000g 4℃ 10min 。
8. 转移水相至新的离心管，加500ul （1/2 Trizol 体积）异丙醇，混匀，室温下孵育样品10min 。
9. 离心：15000g 4℃ 5min 。
10. 移除上清液，用1ml （1倍Trizol 体积）75%乙醇上下颠倒洗涤RNA 团块，涡旋混匀样品。
11. 离心：7500g 4℃ 5min 。
12. 移除上清液，泄放离心管，吸取剩余溶液，使RNA 干燥2-3min(RNA 不宜太干)。
13. 加100ul 20mM NaAc/0.5% SDS 溶液，完全溶解RNA 团块(RNA 可保存于此溶液中，-80℃)。
14. 取2ul RNA 进行琼脂糖凝胶（w/v = 2%）电泳，检测其完整性。
15. 取1ul RNA 测浓度，调节RNA 至终浓度为1ug/ul 。
RNA 纯化16. 取5ul 1ug/ul RNA 至新的离心管，加5ul （等体积） 3M NaAc 溶液和15ul （3倍体积） ddH2O ，混匀，17. 然后加50ul （2.5倍体积）无水乙醇，颠倒离心管，混匀，冰上放置30min 。
18. 离心：15000g 4℃ 5min 。
19. 移除上清液，用500ul 75%乙醇上下颠倒洗涤RNA 团块，涡旋混匀样品。
Trizol_法提取细菌RNA的实验步骤
Trizol_法提取细菌RNA的实验步骤Trizol 法提取RNA实验步骤需要的试剂：氯仿异丙醇75%⼄醇（in DEPC-treated water)RNase free⽔或者0.5% SDS溶液[准备不含RNase的⽔，将其装⼊不含RNase的玻璃瓶中，加⼊diethylpyrocarbonate (DEPC 是为了减少RNase 的降解) to 0.01% (v/v)。
静置过夜，然后⾼压灭菌。
0.5% SDS溶液必须⽤DEPC预处理、⾼压灭菌的⽔]1、组织匀浆(1) 取出⾼温⾼压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒⼊液氮，研碎。
(2) 每50-100mg均浆组织标本中加⼊1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。
(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋⽩复合体。
2、相分离加⼊0.2 ml的氯仿，加盖好后⽤⼿剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离⼼12,000× g，15 minutes ，2 - 8°C。
离⼼后分成三层，下⾯的红⾊为酚-氯仿相，⼀个中间层，⼀⾯是⽆⾊的⽔相。
RNA 只存在于⽔相中。
⽔相占总TRIZOL的60%。
3、RNA沉淀将上层⽔相转移到另⼀⼲净的EP管中，加⼊0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离⼼12,000 rpm ，10 minutes，2 - 8°C。
离⼼前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。
4、RNA洗涤去上清，加⼊1ml 75%⼄醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离⼼7,500 × g ，5 minutes，2 -8°C。
5、RNA再溶解去上清，置真空或空⽓中5-10分钟，⼲燥RNA沉淀，（不能在真空中离⼼⼲燥）。
Trizol法提取RNA实验步骤
Trizol法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA质量的高低常常影响c D NA库，RT-PCR和Nor thernBlot等分子生物学实验的成败。
Trizol是一种新型总R N A抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycoge n（可能需要）、 1.5ml Eppendo rf管（RNase-free）、 Tips（RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是R N ase完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNas e-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。
注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已D EPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
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T r i z o l法提取R N A实验
步骤
Prepared on 22 November 2020
Trizol法使用步骤
一、分离纯化的基本原理
研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和NorthernBlot等分子生物学实验的成败。
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料
无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、管（RNase-free）、Tips（RNase-free）
三、准备工作
RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理
尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为%。
注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品
250°C烘烤3小时以上。
四、从组织中提取总RNA
1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织
/mlTrizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。
2)匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizol加入Trizol。
另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。
五、从细胞中提取总RNA
1)培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml比例加入。
2)悬浮细胞可直接收集、裂解，每1mlTrizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。
六、操作步骤
1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。
注：此时可放入-70℃长期保持。
2、12,000rpm离心5min，弃沉淀。
3、按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。
注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
4、4℃12,000g离心15min。
5、吸取上层水相，至另一离心管中。
注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。
6、按异丙醇/mlTrizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。
7、4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。
8、按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
9、4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。
10、室温晾干或真空干燥5-10min。
注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
11、可用50ulH
2
O，TEbuffer或%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。
注：H
2
O、TE或%SDS均须用DEPC处理并高压。
12、测值定量RNA浓度。
注：此方法提取RNAA
260/A
280
值在之间；产率
估计：组织标本：（ugRNA/mg组织）1-10ug，培养细胞
（ugRNA/106Cell）：5-15ug。
注：组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量；组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染；
高蛋白、脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨后须4℃12,000g离心10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉；
热天提RNA，带手套是必须的，手是RNase的主要来源；
组织块用液氮研磨，效果最好，若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，此时组织块不宜过大，且需先用眼科剪刀将组织碱碱剪碎，然后再充分研磨。
肝脏、肠道、肌肉总RNA提取方法
①使用已高温蒸汽灭菌的手术刀和镊子从鱼的腹部解剖开，从中取出完整的肝脏、肠、肌肉等组织，置于离心管后立即放入液氮中；
②组织在液氮下研磨成粉，取少量至加有1mLTrizol的离心管中，充分混合后于4℃，12,000rpm离心15min；
③取上清移至新离心管中，加入200ul氯仿，剧烈震荡直至呈乳白色，于4℃，12,000rpm离心15min；
④取上清移至新离心管中，加入500ul异丙醇，轻轻颠倒10次，冰上放置
20mins，于4℃，12,000rpm离心15min；
⑤弃上清，加入1ml75%乙醇（用DEPC水现配现用），于4℃，12000rpm离心
5min，重复此步骤一次；
⑥弃上清后，室温干燥5-7mins；
⑦加入适量（20-30ul）的DEPC水溶解沉淀65℃溶解，-20℃（最好-80℃）保存，检测RNA浓度，并电泳检测。
RNA浓度测定和电泳检测
取2ul提取好的RNA溶液，于Nanodrop2000Spectrophptpmeter测定RNA浓度及A260/A280的相对吸光度，纯净RNA的A260/A280应在之间。
电泳检测：1%琼脂糖，1×ATE缓冲液，90V电泳30min，凝胶成像系统观察，分析结果。
肝脏、肌肉、肠道样品cDNA的合成
反应按照TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitWithgDNAEraser （PerfectRealTime)反转录试剂盒说明书进行，合成cDNA模板。
①基因组DNA的除去反应，在PCR管中配置如下缓冲液。
试剂用量
5×gDNAEraserBuffer μl
gDNAEraser μl
TotalRNA X*ul
RNaseFreedH2O upto10μl
X*：根据检测到的RNA浓度来配置；
混合均匀后，室温放置20-30min
②反转录反应，在PCR管中配置如下缓冲液（20ulsystem），反应液配制在冰上进行。
为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，先按反应数+1的量配制MasterMix，然后再分装到每个反应管中。
试剂使用量
5×PrimeScriptBuffer2
（forRealTime）
PrimeScriptRTEnzymeMixI μl
RTPrimerMix μl
①的反应液
RNaseFreedH2O upto20μl
③混合均匀后，在PCR仪上进行逆转录反应，反应条件为：
37℃15min
85℃5sec
然后将得到的cDNA存放于-20℃冰箱保存待用。