第八章 印迹技术

免疫印迹（Western blotting)
将待测蛋白质 （抗原）变性
电泳
转移到 NC膜上
封闭
加入 抗体
加入标记 的二体
显示 区带
检测
检测分析
应用举例
• 基因芯片与中医寒证的7类相关基因 对典型寒证而且用热药有明显疗效者， 尝试用基因芯片筛选出59条差异表达基因 表达谱（涉及到7类基因），探索寒证所涉 及的相关基因类别。
末端标记法
• DNA末端末端标记法只是将DNA片段的一 端（5’端或3’端）进行部分标记。由于标记 活性不高，标记物掺入率低，一般极少用 做核酸分子杂交探针标记。
末端标记法
探针的纯化
• 目的：除去游离的标记dNTP • 方法：乙醇沉淀、凝胶过滤
核酸印迹杂交技术原理和流程
（a）
基因组DNA
技术过程
原位杂交
蛋白质印迹法
• Western 印迹法（Western bloting）分析 蛋白质的化学基础是其免疫原性，又称为 免疫印迹法或酶联免疫电转移印斑法 • 用途： 鉴定一个蛋白质样品中的目的蛋白，检 测一目的蛋白在不同组织细胞的相对含量。
• 典型的印迹过程包括三个步骤 ①蛋白质的电泳分离； ②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜 上，用非特异性，非反应活性分子封闭固 体膜上未吸附蛋白质区域； ③免疫学检测。
滤纸
凝胶
支持物
上行毛细管转移
（2）电转移
①一般用尼龙膜作电转移的载体（NC膜不行） ②单链DNA和RNA可进行转移，双链DNA先在原位进行碱 变性，随后中和，再转移 ③特点：转移快，2-3小时即可；
（3）真空转移
使用真空转移装置，较毛细管转移更为有效，快捷。
电转移法
真空转移法
预杂交
• 固相膜可结合DNA，包括探针。 • 封闭固相膜上多余的结合位点。 • 常用非特异性的DNA或蛋白质。
低成本（相对于同时进行大量分子研究而言）
生物芯片的分类：
DNA芯片（基因芯片） 蛋白质芯片 组织芯片 细胞芯片
微阵列芯片
生物芯片
正处于研 芯片实验室（Lab-on-a-chip） 究阶段 芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。
基因芯片（Gene chip）
又称为DNA微阵列（DNA Microarray）或DNA芯片 （DNA chip）。
第八章
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节
印迹杂交技术
核酸分子杂交 探针与标记 固相支持物与印迹 常用核酸印迹杂交技术 影响杂交的因素 蛋白质印迹法 生物芯片
目的要求
掌握基本概念（印迹杂交技术 、探针等） 核酸分子杂交基本原理，核酸探针应具有 的条件，核酸探针的种类， DNA 印迹杂交 的主要步骤。 熟悉常用印迹杂交技术和芯片技术
• 方法： 精选对其治疗有明显疗效的典型寒证 病例，在治疗前后分别采外周血，提取血 液中的mRNA，再逆转录为cDNA以备检 测。采用2035条人的靶基因cDNA制备成 基因表达谱芯片。用两种荧光物质分别标 记治疗前与治疗后cDNA，用其制备成探 针与表达谱芯片进行杂交。
结果：
初步筛选出了差异表达基因59条，涉 及到与能量代谢、糖代谢、脂类代谢、蛋 白质代谢、核酸代谢、免疫和内分泌等7类 基因。
生物芯片（biochips）
——指通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构 建微型生物化学分析系统，以实现对生命机体的 组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其它生物 组分进行准确、快速、大信息量的检测。
生物芯片的特点：
① 高通量（一张芯片同时可分析千上万的分子）
② ③
④
微型化（可装入口袋） 自动化（技术自动化；结果分析自动化）
将大量的基因探针分子固定于支持物上，然后与经过标 记的样品DNA进行杂交，探针能够在基因混合物中识别出 特定基因，最后通过检测杂交信号的强度及分布来对特定 基因进行分析。
表达谱芯片（最常用） 诊断芯片 基因芯片用途 指纹图谱芯片 测序芯片 毒理芯片
2. 基因芯片技术流程
Affymetrix基因芯片的实验流程
核酸探针应具有的条件： • 带有标记物； • 单链； • 高度特异性； • 检测方法应简单，灵敏度；
核酸探针的种类
• • • • 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
核酸探针标记物 分为放射性标记探针和非放射性标记探针两 大类
1、放射性同位素 应用广泛，以32P应用最普遍，放射自显影。 优点：灵敏度高； 缺点：放射性污染，半衰期短、不稳定等。
DNA凝 胶电泳
blotting
毛细管作用 使DNA单链转 电转移
真空吸引
变性
移到硝酸纤维 素膜（NC） 显出杂 交区带
与探针进 行杂交
放射自 显影
Southern印迹杂交法
内切酶
基因组DNA
重物 纸巾 10×SSC 转移缓冲液 500g
1 2 M
DNA酶切片段
玻璃板 Whatman滤纸 NC膜或尼龙膜 凝胶 Whatman滤纸
原位合成法和直接点样法的比较
② 样品制备
——与一般的核酸提取比较类似，只不过为了降低污 染和提高检测灵敏度增加了纯化、扩增（PCR）和标记。
常用标记物： 生物素 荧光素 对照样品（Cy5-dUTP） 待测样品（用Cy3-dUTP 标记）
待测样品用 Cy3，发射 562nm红色 荧光
1 2
支持物
NC或尼龙膜
与探针同源杂交的 基因DNA片段
放 射 Βιβλιοθήκη Baidu 显 影 照 片
二、RNA印迹法（Northern bloting）
操作：与DNA印迹相似 RNA经变性后再电泳， 凝胶中加甲醛保持RNA单链。
用途：检测mRNA、检测基因表达情况
Northern印迹杂交
• 是一项用于检测特异性RNA的技术。
RNA凝 胶电泳
毛细管作用 使DNA单链转 电转移
真空吸引
移到硝酸纤维 素膜（NC） 显出杂 交区带
与探针进 行杂交
放射自 显影
Northern Blot
β-1，4糖基转移酶在损伤坐骨神经中的表达(Northern
杂交)
三、斑点印迹 操作：不做电泳分离，将DNA、RNA样品 变性后点在干的NC上，与探针杂交。 用途：检测DNA样品同源性、细胞内特 定基因拷贝数；mRNA的相对含 量。
切口平移法
反应成分： Dnase I，E coli pol I, dATP,dGTP, dTTP, 32P-dCTP,待标记的DNA片段 标记结果： 两条链都均匀标记。
5’ 3’ 5’ 3’
Dnase I Mg2+
3’ 5’ 双链DNA
3’ 带切口的 5’ 双链DNA
E coli pol I α-32P-dNTP 5’ 3’ 变性
四、菌落杂交法和噬菌斑杂交法 操作： NC膜拓印培养的菌落 原位裂解菌落，释放DNA 预杂交 杂交 结果分析 从原培养皿筛选含目的DNA的阳性菌落
用途：筛选含有特异DNA序列的阳性菌落 或噬菌斑
菌落杂交
检测重组体克隆的菌落杂交技术
菌 落 杂 交
五、核酸原位杂交（组织原位杂交） 概念：在细胞或组织切片中进行核酸杂交并 对其实行检测的方法，称为核酸原位 杂交（nucleic acid hybridization in situ) 用途：研究核酸序列在染色体中的精确定位； 研究细胞特定基因表达水平；确定组织 有无病原体感染等。
2、非放射性标记物
生物素：
一种小分子水溶性维生素，
连接在碱基上，
和抗生物素蛋白（avidin）特异结合， 抗生物素蛋白上连接有显色物质(酶、荧光素等) 。 地高辛： 一种类固醇半抗原分子， 可利用其抗体进行免疫检测， 原理类似于生物素的检测。
核酸探针的制备
• 常将标记物连接到某种脱氧核糖核苷三磷 酸(dNTP)上，然后可通过切口平移法、随 机引物法、PCR标记法、末端标记法等方法 标记探针
(双向电泳蛋白质印迹技术)
Southern blotting 用于分析DNA
核酸分子杂交基本原理
• 核酸分子杂交是指来源不同、具有互补序列 的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补配 对原则形成双链的过程。 （固相和液相杂交）
变性
复性







探针(probe)
杂交的一方是待测核酸序列，另一方是已知核酸序 列，通常把已知的核酸序列称作探针（probe）。 • 探针(probe)，是指与待测的分子发生特异性相互 作用，并可被特殊的方法探知的分子。 • 除了核酸探针外，探针利用抗体-抗原、生物素抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用的原理 与靶分子结合。
32P部分标记的
3’ 5’ 切口原始位置
切口最终位置
32P标记的DNA
单链DNA片段
DNA切口平移标记法
随机引物法（random
priming )
随机寡核苷酸引物（random primer)： 含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段 的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交， 起到聚合酶反应引物的作用 • E.coli DNA聚合酶I的Klenow大片段（仅具 有5-3多聚酶的活性，而无外切酶的活性）
DNA限制片段
（b）
（ c）
（d）
硝酸纤维素滤膜
同探针同源杂交的 基因DNA片段 X光底片
（ e）
DNA印迹杂交的主要步骤
• • • • 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 印迹（转膜）： – 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 – 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 预杂交（封闭） 探针的制备 固相膜上杂交（控制温度） 洗膜：除去游离的探针 杂交信号的检测
• • • • •
印迹杂交过程
⒈ 样品制备→⒉ 电泳分离→⒊ 印迹→⒋ 预杂交→ ⒌ 杂交→⒍ 洗膜→⒎ 分析
固相支持物
• • • • 电泳用的凝胶不能直接做支持物 将核酸分子结合于表面 有较好的机械强度 常用硝酸纤维膜和尼龙膜
几种转膜方法：
（1）毛细管虹吸转移法
吸水纸 NC膜或尼龙膜 滤纸 转移缓冲液 玻璃板 重物（500g）
5’ 3’ 变性 3’ 随机引物 3’ Klenow片段α-32P-dNTP 3’
3’ 5’ 双链DNA
5’ 单链DNA 5’
5’
变性
32P标记的单链
DNA探针
DNA的随机引物标记法
PCR标记法
• 在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标
记的dNTP，这样标记的dNTP就可在PCR反应的 同时掺入到新合成的DNA链上。
印迹杂交技术
• 印迹技术(blotting)是指将样品（核 酸或蛋白质）电泳分离并转移到固相 载体上，然后在载体上利用特异性的 反应来检测样品的一种方法。
印迹技术(blotting)
Northern blotting 用于分析RNA
Western blotting 用于分析蛋白质
Eastern blotting 用于分析蛋白质
Northern印迹
斑点杂交
菌落杂交和噬斑杂交
原位杂交
检测细胞或组织中的DNA或RNA分子
一、DNA印迹法（Southern bloting ） 将电泳分离的待测DNA片段转移并结 合到一定的固相支持物上，然后用标记的 DNA探针检测待测DNA的一种方法。 用途：检测目的DNA的存在，基因突变
Southern
影响杂交的因素
• • • • • 杂交温度， 离子强度 DNA和探针浓度 杂交促进剂，聚乙二醇 杂交时间
常用核酸杂交分类 杂交方法
Southern印迹
适用范围
检测经凝胶电泳分开的DNA分子, 需转印到膜上 检测经凝胶电泳分开的RNA分子, 需转移到膜上 检测未经分离的,固定在膜上的 DNA或RNA分子 检测固定在膜上的,经裂解后从细菌和 噬菌体中释放的DNA分子
微量点样法 原位合成法
探针设计与制备 支持物预处理
探针打印
探针固化 DNA芯片 杂 交 与 漂 洗 扫 描 与 分 析
显微光蚀刻/压电打印/分子印章
样品准备
核酸提纯
扩增与标记
标记核酸纯化
① 基因芯片制备
就是根据实验目的和要求，将设计好的检测探针， 通过一定的方法固定到固相支持物上。
主要有两种：原位合成法和直接点样法
• • • •
与能量代谢相关的5条基因都为表达下调。 与糖代谢有关的2条基因也表现为下调。 与脂及酯类代谢相关的2条基因均下调。 与核酸代谢相关的基因10条以下调为主， 上调为辅。
生物芯片技术（biochips）
传统核酸印迹杂交的缺点：
• 传统核酸印迹杂交：Southern Blotting 和Northern Blotting等 • 技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、 低通量(low through-put)等