第七章 色谱原理(上)-(9)
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7
液相色谱（一）
Liquid chromatography
生物工程下游技术
2013-7-28
1
主要内容
概述 色谱过程理论基础 凝胶层析 离子交换层析 其它层析技术
2013-7-28
2
色谱的发展历史
In 1903，俄国植物学家Michael Tsweett’s Work(see Ber. Deut. Botan. Ges., 1906; 24: 384).
石油醚
Chromatography = (chromatus = color, graph = figure).
2013-7-28 3
It is very instructive to observe the adsorption phenomena during filtration through a powder. First a colourless, then a yellow （carotene） liquid flows out from the bottom of the funnel, while a bright green ring forms at the top of the inulin column, below which a yellow ring soon appears. On subsequent washing of the inulin column with pure ligroin, both rings, the green and the yellow, are considerably widened and move down the column. M.S. Tswett Tr. Varshav. Obshch. Estestvoispyt., Otd. Biol., 14 （1903） 20
2013-7-28
17
2
色谱分类
A、柱色谱法 B、毛细管色谱法 C、平板色谱法：硅胶板色谱、纸色谱
3)、按固定相的形状分
4)、按操作压力
A、低压色谱（＜0.5 MPa）分离的装置比较简单，操作费用低，但 流动相流动速率慢，分离时间长，常常使生物活性物质活性降低。 B、中压色谱分离（0.5～5 MPa） C、高压色谱（5～50 MPa）分离技术的特点是，流动相流动速率 高，分离时间短，分辨率高。缺点是设备费昂贵，此外在高压作用 下有些生物物质有变性的可能。
2013-7-28
13
当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发 生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异， 与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相 的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各 组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中 流出。 与适当的柱后检测方 法结合，实现混合物中各 组分的分离与检测。 两相及两相的相对运 动构成了色谱法的基础
8
• 1941年Martin和Synge提出用气体代替液体作流动相的 可能性。 • 1952年James和Martin发表了从理论到实践比较完整的 气液色谱法gas-liquid chromatography。 • 1956年Van Deemter等在前人研究的基础上发展了描述 色谱过程的速率理论。 • 1957年Golay开创了开管柱气相色谱法open-tubular column chromatography，即毛细管柱气相色谱法 capillary column chromatography • 1965年Giddings总结和发展了前人的色谱理论。
2013-7-28 10
• 20世纪60年代初，Giddings将气-液色谱理论用于液液色谱，同时把高压泵和化学键合固定相用于液相色 谱， 于60年代末出现了高效液相色谱（HPLC）。 • 20世纪80年代初毛细管超临界流体色谱（SFC）得到 发展，90年代未得到较广泛的应用。 • 20世纪80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起 来的毛细管电泳（Capillary electrophoresis， CE），在90年代得到广泛的发展和应用。 • 同时集HPLC和CE优点的毛细管电色谱在20世纪90年代 后期受到重视。
2013-7-28 23
3
色谱的名词术语
色谱术语 ： A、基线： B、峰高：色谱峰顶与基线间的垂 直距离，以h表示。 C、保留值： 死时间tm ：不被固定相吸附或溶 解的物质进入色谱柱时，从进 样到出现峰极大值所需的时间。 因为物质不被固定相吸附，故 其流动速度将与流动相的流动 速度相近：
保留时间tr：试样从进样到柱后出 现峰极大点时所经历的时间。 调整保留时间tr’：
2013-7-28
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2
色谱分类
6)、按原理分类
2013-7-28
19
3 生物工程中的色谱分离
色谱和电泳是目前所知最好的两种分离方法， 其塔板数可达百万数量级。 在基因工程产品中，色谱分离占有核心地位。 3.1色谱分离的规模 3.2分析色谱与工业色谱的比较
2013-7-28
20
3 生物工程中的色谱分离
2013-7-28
24
3
色谱的名词术语
tr的表达：时间单位(如s, d, h), 距离单位 (如cm)，体积(ml, l)表示。 tr 意义：色谱法定性的基本依据，但同一 组份的tr常受到流动相流速的影响，因 此色谱工作者有时用保留体积等参数进 行定性检定。 D、死体积VM：指色谱柱内固定相颗粒间 所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头 间的空间以及检测器的空间的总和，当 后两项很小而可忽略不计时， VM可由 tm与流动相体积流速F0(ml/min)计算： E、保留体积VR：指从进样开始到被测组 份在柱后出现浓度极大点时所通过的流 动相体积。保留体积与tr的关系如下： F、调整保留体积V’R ：某组份VR 扣除VM 后，称该组份的V’R ，即
2013-7-28
4
• 然而，在20多年时间里，他的新分离方法并没有受 到科学界的重视。其中一个重要原因是德国著名化 学家R. Willstätter对色谱法的排斥和不信任。 • Willstätter（1915年获诺贝尔化学奖获得者） 1913年在其名著“叶绿素的研究”中，称色谱法是 一种“离奇的方法”，认为它不适用于制备工作， 在吸附过程中，试样组分可能发生化学变化。他写 道：“色谱法只能在试样很少的情况下使用，似乎 不适合于制备目的……” • Willstätter的观点，即过分强调制备工作，也反 映出当时有机化学家的一种普遍态度。因此，茨维 特的技术是超越其时代的。
2013-7-28 14
色谱一般过程(P118)
组件及过程：
A B C D E F 色谱柱(column)： 固定相(stationary phase)： 流动相(flow phase)： 洗脱液(elution)： 检测器(detector)： 部分收集器(portion collector)
2013-7-28
2Leabharlann Baidu13-7-28
25
3
色谱的名词术语
由于 2,1只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、 柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色 谱法中，如GC、HPLC中，广泛使用的定性数据。 注意：2,1绝不是两个组份保留时间或保留体积之比
G、相对保留值2,1：某组份2与组份1的调整保留值之比， 即：
2013-7-28 5
• 1930年12月，奥地利22岁研究生E.Lederer到海得 堡R. Kuhn领导的化学研究所研究类胡萝卜素。他 对文献进行了仔细考察，从文献中了解到茨维特 的色谱技术。在Kuhn的指导下，他用碳酸钙作吸 附剂，在一小色柱中，成功地分离了-、-、胡萝卜素，并发表了三篇论文，公布了他们的研 究成果。这标志着色谱法的复兴。 • Karrer在1937年，Kuhn在1938年，Ruzicka在1939 年相继获诺贝尔化学奖。从此以后，色谱法得到 普遍的公认，成为最有效的分离提纯手段。
2013-7-28 6
• 1931年，Kuhn、Lederer用氧化铝和碳酸钙分离了-、 -、-胡萝卜素后才引起重视。Tswett的方法是借 助于各组分在固定相中吸附能力的强弱不同而进行 分离的，称为吸咐色谱adsorption chromatography。 • 1935年，Adams和Holmes 合成了离子交换树脂，并 用于色谱分离，从而诞生了离子交换色谱法。
2013-7-28
11
一 概述
1、一般过程 2、分类 3、名词术语
2013-7-28
12
1
色谱一般过程
色谱法是根据混合物中各组分在互不相溶的
两相中分配系数的差异进行物质分离的技术，是 混合物最有效的分离、分析方法。
试样混合物的分离过程也就是试样中各组分 在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分 配过程。 其中的一相固定不动，称为固定相； 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流 体（气体或液体），称为流动相。
2013-7-28
7
• 1941年A. J. P. Martin和R. L. M. Synge发明了 分配色谱法（partition chromatography）。 1952年获诺贝尔化学奖。
Archer John Porter Martin
2013-7-28
Richard Laurence Millington Synge
2013-7-28
9
• 1944年R. Consden、A. H. Gorden和Martin等发展了 纸色谱。 • 1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄 层板使薄层色谱法（thin layer chromatography）得 以实际应用，1956年E. Stahl对TLC的标准化、规范化 及应用面做了大量工作并开发出薄层色谱板涂布器之 后，才使TLC得到广泛地应用。 • 1959年Porath和Flodin提出了凝胶色谱法（ gel chromatography ）。 • 1967年Porath、Axen和Ernback成功地创立了亲和色谱 法（ affinity chromatography ）。
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2
色谱分类
1)、按应用的目的 A、分析性色谱(analytical Chromatography)：GC、 LC、HPLC、TLC等。 B、制备性色谱(preparation Chromatography)： 工业规模，实验室规模。
2013-7-28
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2
色谱分类
2)、按流动相 A、GC: 气-固色谱法(固定相为固体) 气-液色谱法(将不挥发的液体固定在适当的固体载体上作为固定相) B 、LC 液-固色谱(固定相为固体) 液-液色谱(液体固定相固定在适当的固体上)
3.2分析色谱与工业色谱的比较
3.2.1应用色谱技术范围的不同 分析色谱的流动相包括气相和液相，固定相形状包括柱、 纸和薄板，而制备和工业色谱主要是采用以液相为流动 相的柱色谱。 3.2.2操作上的不同 在分析色谱中，进样量愈小愈好，因此出现了当今的微 型毛细管柱色谱；在制备和工业色谱中，则要求进样量 越多越好，色谱柱也应适当大些，从而出现了大直径的 径向色谱柱（radial flow chromatographic column， RFCC）。
3.1色谱分离的规模 与一般分离技术相比，色谱分离的规模是相当小的。 根据分离时一次进样量的多少，色谱分离的规 模可分为如下4类： 色谱分析：＜10 mg 半制备（或称中等规模制备）：10～50 mg 制备（或称样品制备）：0.1～10 g 工业生产：＞20 g
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3 生物工程中的色谱分离
2013-7-28
22
3
色谱的名词术语
分配系数m：
m cs cm 式中，cs 和cm 分别为组份在固定相 和流动相中的浓度。 m类型：A、B型曲线是一条典型的 吸附等温线，吸附色谱法属于这 类曲线。C和D型吸附等温线很 少遇到。C曲线为线性分配等温 线。 线性色谱：溶质浓度低时，m为常 数时的色谱 意义：容易理解，溶质流过色谱柱 时，m大的组份通过色谱柱所需 要的时间长，m小的组份需要的 时间短；当样品中各组份在两相 的m不同时，就能实现差速迁移， 达到分离的目的。
液相色谱（一）
Liquid chromatography
生物工程下游技术
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主要内容
概述 色谱过程理论基础 凝胶层析 离子交换层析 其它层析技术
2013-7-28
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色谱的发展历史
In 1903，俄国植物学家Michael Tsweett’s Work(see Ber. Deut. Botan. Ges., 1906; 24: 384).
石油醚
Chromatography = (chromatus = color, graph = figure).
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It is very instructive to observe the adsorption phenomena during filtration through a powder. First a colourless, then a yellow （carotene） liquid flows out from the bottom of the funnel, while a bright green ring forms at the top of the inulin column, below which a yellow ring soon appears. On subsequent washing of the inulin column with pure ligroin, both rings, the green and the yellow, are considerably widened and move down the column. M.S. Tswett Tr. Varshav. Obshch. Estestvoispyt., Otd. Biol., 14 （1903） 20
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色谱分类
A、柱色谱法 B、毛细管色谱法 C、平板色谱法：硅胶板色谱、纸色谱
3)、按固定相的形状分
4)、按操作压力
A、低压色谱（＜0.5 MPa）分离的装置比较简单，操作费用低，但 流动相流动速率慢，分离时间长，常常使生物活性物质活性降低。 B、中压色谱分离（0.5～5 MPa） C、高压色谱（5～50 MPa）分离技术的特点是，流动相流动速率 高，分离时间短，分辨率高。缺点是设备费昂贵，此外在高压作用 下有些生物物质有变性的可能。
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当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发 生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异， 与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相 的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各 组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中 流出。 与适当的柱后检测方 法结合，实现混合物中各 组分的分离与检测。 两相及两相的相对运 动构成了色谱法的基础
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• 1941年Martin和Synge提出用气体代替液体作流动相的 可能性。 • 1952年James和Martin发表了从理论到实践比较完整的 气液色谱法gas-liquid chromatography。 • 1956年Van Deemter等在前人研究的基础上发展了描述 色谱过程的速率理论。 • 1957年Golay开创了开管柱气相色谱法open-tubular column chromatography，即毛细管柱气相色谱法 capillary column chromatography • 1965年Giddings总结和发展了前人的色谱理论。
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• 20世纪60年代初，Giddings将气-液色谱理论用于液液色谱，同时把高压泵和化学键合固定相用于液相色 谱， 于60年代末出现了高效液相色谱（HPLC）。 • 20世纪80年代初毛细管超临界流体色谱（SFC）得到 发展，90年代未得到较广泛的应用。 • 20世纪80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起 来的毛细管电泳（Capillary electrophoresis， CE），在90年代得到广泛的发展和应用。 • 同时集HPLC和CE优点的毛细管电色谱在20世纪90年代 后期受到重视。
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色谱的名词术语
色谱术语 ： A、基线： B、峰高：色谱峰顶与基线间的垂 直距离，以h表示。 C、保留值： 死时间tm ：不被固定相吸附或溶 解的物质进入色谱柱时，从进 样到出现峰极大值所需的时间。 因为物质不被固定相吸附，故 其流动速度将与流动相的流动 速度相近：
保留时间tr：试样从进样到柱后出 现峰极大点时所经历的时间。 调整保留时间tr’：
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色谱分类
6)、按原理分类
2013-7-28
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3 生物工程中的色谱分离
色谱和电泳是目前所知最好的两种分离方法， 其塔板数可达百万数量级。 在基因工程产品中，色谱分离占有核心地位。 3.1色谱分离的规模 3.2分析色谱与工业色谱的比较
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3 生物工程中的色谱分离
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色谱的名词术语
tr的表达：时间单位(如s, d, h), 距离单位 (如cm)，体积(ml, l)表示。 tr 意义：色谱法定性的基本依据，但同一 组份的tr常受到流动相流速的影响，因 此色谱工作者有时用保留体积等参数进 行定性检定。 D、死体积VM：指色谱柱内固定相颗粒间 所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头 间的空间以及检测器的空间的总和，当 后两项很小而可忽略不计时， VM可由 tm与流动相体积流速F0(ml/min)计算： E、保留体积VR：指从进样开始到被测组 份在柱后出现浓度极大点时所通过的流 动相体积。保留体积与tr的关系如下： F、调整保留体积V’R ：某组份VR 扣除VM 后，称该组份的V’R ，即
2013-7-28
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• 然而，在20多年时间里，他的新分离方法并没有受 到科学界的重视。其中一个重要原因是德国著名化 学家R. Willstätter对色谱法的排斥和不信任。 • Willstätter（1915年获诺贝尔化学奖获得者） 1913年在其名著“叶绿素的研究”中，称色谱法是 一种“离奇的方法”，认为它不适用于制备工作， 在吸附过程中，试样组分可能发生化学变化。他写 道：“色谱法只能在试样很少的情况下使用，似乎 不适合于制备目的……” • Willstätter的观点，即过分强调制备工作，也反 映出当时有机化学家的一种普遍态度。因此，茨维 特的技术是超越其时代的。
2013-7-28 14
色谱一般过程(P118)
组件及过程：
A B C D E F 色谱柱(column)： 固定相(stationary phase)： 流动相(flow phase)： 洗脱液(elution)： 检测器(detector)： 部分收集器(portion collector)
2013-7-28
2Leabharlann Baidu13-7-28
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色谱的名词术语
由于 2,1只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、 柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色 谱法中，如GC、HPLC中，广泛使用的定性数据。 注意：2,1绝不是两个组份保留时间或保留体积之比
G、相对保留值2,1：某组份2与组份1的调整保留值之比， 即：
2013-7-28 5
• 1930年12月，奥地利22岁研究生E.Lederer到海得 堡R. Kuhn领导的化学研究所研究类胡萝卜素。他 对文献进行了仔细考察，从文献中了解到茨维特 的色谱技术。在Kuhn的指导下，他用碳酸钙作吸 附剂，在一小色柱中，成功地分离了-、-、胡萝卜素，并发表了三篇论文，公布了他们的研 究成果。这标志着色谱法的复兴。 • Karrer在1937年，Kuhn在1938年，Ruzicka在1939 年相继获诺贝尔化学奖。从此以后，色谱法得到 普遍的公认，成为最有效的分离提纯手段。
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• 1931年，Kuhn、Lederer用氧化铝和碳酸钙分离了-、 -、-胡萝卜素后才引起重视。Tswett的方法是借 助于各组分在固定相中吸附能力的强弱不同而进行 分离的，称为吸咐色谱adsorption chromatography。 • 1935年，Adams和Holmes 合成了离子交换树脂，并 用于色谱分离，从而诞生了离子交换色谱法。
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一 概述
1、一般过程 2、分类 3、名词术语
2013-7-28
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色谱一般过程
色谱法是根据混合物中各组分在互不相溶的
两相中分配系数的差异进行物质分离的技术，是 混合物最有效的分离、分析方法。
试样混合物的分离过程也就是试样中各组分 在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分 配过程。 其中的一相固定不动，称为固定相； 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流 体（气体或液体），称为流动相。
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• 1941年A. J. P. Martin和R. L. M. Synge发明了 分配色谱法（partition chromatography）。 1952年获诺贝尔化学奖。
Archer John Porter Martin
2013-7-28
Richard Laurence Millington Synge
2013-7-28
9
• 1944年R. Consden、A. H. Gorden和Martin等发展了 纸色谱。 • 1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄 层板使薄层色谱法（thin layer chromatography）得 以实际应用，1956年E. Stahl对TLC的标准化、规范化 及应用面做了大量工作并开发出薄层色谱板涂布器之 后，才使TLC得到广泛地应用。 • 1959年Porath和Flodin提出了凝胶色谱法（ gel chromatography ）。 • 1967年Porath、Axen和Ernback成功地创立了亲和色谱 法（ affinity chromatography ）。
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色谱分类
1)、按应用的目的 A、分析性色谱(analytical Chromatography)：GC、 LC、HPLC、TLC等。 B、制备性色谱(preparation Chromatography)： 工业规模，实验室规模。
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色谱分类
2)、按流动相 A、GC: 气-固色谱法(固定相为固体) 气-液色谱法(将不挥发的液体固定在适当的固体载体上作为固定相) B 、LC 液-固色谱(固定相为固体) 液-液色谱(液体固定相固定在适当的固体上)
3.2分析色谱与工业色谱的比较
3.2.1应用色谱技术范围的不同 分析色谱的流动相包括气相和液相，固定相形状包括柱、 纸和薄板，而制备和工业色谱主要是采用以液相为流动 相的柱色谱。 3.2.2操作上的不同 在分析色谱中，进样量愈小愈好，因此出现了当今的微 型毛细管柱色谱；在制备和工业色谱中，则要求进样量 越多越好，色谱柱也应适当大些，从而出现了大直径的 径向色谱柱（radial flow chromatographic column， RFCC）。
3.1色谱分离的规模 与一般分离技术相比，色谱分离的规模是相当小的。 根据分离时一次进样量的多少，色谱分离的规 模可分为如下4类： 色谱分析：＜10 mg 半制备（或称中等规模制备）：10～50 mg 制备（或称样品制备）：0.1～10 g 工业生产：＞20 g
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3 生物工程中的色谱分离
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色谱的名词术语
分配系数m：
m cs cm 式中，cs 和cm 分别为组份在固定相 和流动相中的浓度。 m类型：A、B型曲线是一条典型的 吸附等温线，吸附色谱法属于这 类曲线。C和D型吸附等温线很 少遇到。C曲线为线性分配等温 线。 线性色谱：溶质浓度低时，m为常 数时的色谱 意义：容易理解，溶质流过色谱柱 时，m大的组份通过色谱柱所需 要的时间长，m小的组份需要的 时间短；当样品中各组份在两相 的m不同时，就能实现差速迁移， 达到分离的目的。