冷冻电镜技术

冷冻电镜技术

或冷冻电子显微学(Cryo-electron microscopy) (Cryo electron microscopy)

梁毅

(武汉大学生命科学学院)

生物分子的结构分析现代生物学仪器分析中的“四大谱”和“三大法”●传统上最有效的方法是“四大谱”：

●紫外-可见光谱、红外光谱、核磁共振波谱和质谱

生物大分子（蛋白质和核酸等）结构测定●的最重要和应用最广泛的三大方法：

●

X 射线晶体衍射分析、核磁共振波谱分析

和冷冻电镜

什么是电镜？

电子显微镜，简称电镜，是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器

●电镜用于生物样品的结构研究是众所周

高分辨率的电镜可以达到0.l 知的，目前0l 乃至水平，这是指在特定条件下nm3Å

可分辨的两点的距离。

●虽然这已接近原子分辨水平，但由于种种原因要看到构成生物大分子的碳、氢、氧原子的三维排布仍是很困难的。

●首先，构成生物物质的碳、氢、氧、氮等元素对电子的散射能力较弱；

●其次高速电子的轰击会对生物样品造成辐射损伤，后者在生物样品的高分辨率结构分析中是最严重的问题。

●损伤机制包括非弹性散射引起的化学键断裂，也包括电子轰击引起离子、自由基和分子碎片扩散，从而造成生物样品的质量损失。

●因此利用电子显微镜对生物大分子进行研究必须首先把观察对象制备成特殊的样品。

●电镜的样品制备方法有许多种，在有关生物大分子结构研究中，负染、葡萄糖包埋以及冰冻含水（正染）等方法是常

用的。

电镜载网

●电镜观察的样品需要在特制的金属载网上才能送入电镜镜筒中进

行观察。载网的直径通常为4mm，可以用铜、银、铂、镍等金属或铜镍、银镍合金等制成。最常用的载网为铜制的，所以电镜载网一般又称作电镜铜网。

铜网网孔的形状多样，有圆形的、方形的、单孔形和狭缝形；网●

孔的数目有50目、100目、200目、300目和400目等多种规格。网孔越大，观察的有效面积越大，但同时对样品的支持稳定性也越差。在电子晶体学电镜观察中最常用的是100目和200目的铜网铜网在使用前要经过预处理，先用丙酮，后用无水乙醇清洗，以●

除去铜网上的油污。清洁后的铜网要真空干燥后才能制备覆盖的支撑膜。

理想中我们希望能够获得一个生物大分子完整的、具负染

●有尽可能高分辨率的三维结构，而样品制备技术就是开始的第一步。

●生物大分子大都含水，要将水化的大分子尽可能地稳定保持使它可以在电子显微镜高真空的镜筒中保持原有结构。

●

同时，生物大分子样品主要是由碳、氢、氧、氮等轻元素原子组成，对电子散射能力很弱，因此样品本身可以提供的衬度很低，一般很难直接观察到，于是人们发展了一些衬度增强技术来加强样品的衬度。

●负染法是最常用的衬度增强技术。

●负染技术就是用一些重金属盐，如醋酸铀来加强样品的衬度，保护分子结构不被电子束损伤。

当用重金属盐溶液染色生物样品时，重金属盐沉淀在●

样品四周，如果样品本身表面有凹凸，溶液还能积存在凹陷的部分。

●在重金属盐沉淀的区域，电子的散射能力强，使样品四周出现暗环，而在有样品的区域，电子的散射能力弱，表现为亮区。这样就把样品的外形及表面结构衬托出来。

样品包埋

随着高分辨率电镜技术的发展，人们可以从衬度很弱的图像中读出分子本身的信息。但是这种生物学意义上的信息都必须在使用一些特殊的样品支持介质后才能获取。这些样品支持介质是一些和生物大分子自身水化环境十分接近的包埋物质，如葡萄糖、单宁酸和无序冰。

葡萄糖包埋

葡萄糖包埋方法的过程与负染方法十分近似，生物大分子样品包埋在1%的葡萄糖溶液中蒸发。葡萄糖分子中的羟基可以取代水分子与蛋白质分子形成氢键而保持生物大分子的结构。除了葡萄糖外，其他的碳水化合物如蔗糖、核糖、环己六醇也具有同样的效应。

单宁酸包埋

●与负染和葡萄糖包埋相近似，单宁酸包埋是用

0.5%的单宁酸溶液（KOH调节pH6.0）来漂洗05%H60

样品铜网。

●单宁酸、葡萄糖和无序冰作为支持介质，在保护样品结构的高分辨率方面并无太大差别，但是单宁酸对于样品晶格稳定性的保护要优于其他两种介质。

样品包埋-冰冻含水方法

●水是所有生物大分子的重要组成，生物大分子都是高

度水化的，蛋白质体积的50％是水。当蛋白质脱水时，分子会变性而失去活性，结构也会被破坏。

世纪年代出现的低温电镜技术，使保持生物大分●2080

子在含水状态进行电镜观察成为可能，用冰冻含水方法制备样品进行冷冻电镜(低温电镜)观察（Cryo-microscopy or electron cryomicroscopy,冷冻electron cryomicroscopy

电子显微镜）代表了电子晶体学的最新潮流，在最近

15年取得飞速发展。

生物样品中通常含有生物大分子、水分子以及缓冲溶液中的其他溶质分子。当水分子低速冷冻时，缓慢结冰形成有序结晶态冰，在结晶冰形成的过程中，溶质会从水中析出而成为悬浮颗粒，溶质的析出导致溶液浓度的改变会严重影响生物大分子的结构。而当水分子被快速冷冻时，会形成无序态冰，避免溶质析出的方法就是快速冷冻使得水保持在无序状态结冰。由于水分子对电子散射能力和蛋白质有较大差别，这样在低分辨情况下，样品图像也有较好的衬度。冰冻含水（正染）是一种最佳的样品包埋方法。

所谓电镜图像的三维重构是指由样品（单颗粒）的一个电镜图像的三维重构

或多个投影图得到样品中各组成部分之间的三维关系。