常用定量分析方法(精)

2、定量方法 常用的定量方法有外标法、内标法、追加法（叠 加法）及回归曲线定量法。 （1）外标法 外标法是薄层色谱扫描最常用的定量方法，方法 简便，但点样必须准确。 ①外标一点法 工作曲线通过原点（截距为零）时可用外标一点 法定量。只需点一种浓度的标准品溶液，与供试液同 板展开，对比，测定组分含量，其计算公式为： C=F1·A 式中：C为组分的重量或浓度，A为测得该组分的 峰面积，F1为直线的斜率或比例常数。
2、薄层荧光扫描法 基本原理：F=2.3K’I。ECL或F=KC 光源：氙灯或汞灯。 灵敏度：最低可测到10-50pg。 适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当处理 后可产生荧光的物质的测定。 Kubelka-Munk理论不适用于薄层荧光扫描，无需 进行曲线校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时，用 斑点荧光强度的积分值（色谱峰峰面积）与斑点中组 分的含量代替上式中F与C 进行运算。

（二）薄层色谱的规范化操作 1、仪器与材料 ①薄层板；②涂布器；③点样器材；④展开箱 （层析缸）⑤显色与检测仪器 2、操作方法 ①薄层板的制备；②点样；③展开；④检测；
（三）定量分析方法
1、方法学考察 新建薄层扫描定量方法必须进行方 法考察，以说明新建方法的可靠性，考 察的内容有工作曲线、定量结果的精密 度及准确度、统计检验等内容。
（1）工作曲线
①检查所选择的散射参数SX值是否适宜。SX值适宜则 工作曲线被校直为直线，否则，调整SX值再校正，直至在一 定点样量范围内工作曲线成直线为止。 ②考察工作曲线是否过原点，以便确定采用一点法或二 点法定量。 ③确定点样量的线性范围。既使采用曲线校直，也只是 在一定点样量范围内工作曲线为直线，因此需确定点样量的 上、下限。 为降低定量误差，最好调整点样量，使供试品与对照品 的峰面积相接近。 为了克服薄层板间差异，外标法及内标法均应采用随行 标准法，即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一块薄层板上。
（2）精密度考察
取同一供试品溶液，在同一块薄层板上以 相同点样量平行点5点以上，展开后测定其峰 面积，求算相对标准差（RSD），作为衡量定 量分析结果精密度的指标。RSD应小于4%。
S RSD(%) 100% X
式中：为n次测量的平均值，S为标准差。
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（3）准确度考察 回收率是衡量定量方法准确度的指标，常用 加样回收率（R）来衡量，其值应在95-105%之间， 测量数据一般为5-6个。 将加入纯品的试样溶液、供试品溶液及标准 溶液点于同一块薄层板上，展开后进行薄层扫描， 测定各斑点的峰面积，计算各溶液中组分的量， 计算回收率（R）。
（一）基本原理 薄层扫描法是指薄层色谱斑点的色谱扫 描，薄层色谱扫描是指固定波长，斑点移动， 测定A-l或F-l曲线。根据薄层扫描的测定方 式分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法二 种方法。
1、薄层吸收扫描法 基本原理：Kubelka-Munk理论及曲线。由于薄层板存在 明显的散射现象，斑点中物质的浓度与吸光度的关系需用 Kubelka-Munk理论及曲线来描述。Kubelka-Munk理论以斑点 的相对反射率和相对透光率计算薄层色谱斑点的吸光度，说 明了固定相的散射参数SX对斑点中物质的浓度与吸光度间关 系的影响，获得不同散射参数SX时斑点的A-KX理论曲线，即 Kubelka-Munk曲线。 光源：钨灯和氘灯； 灵敏度：在200-800nm波长范围内选择合适波长进行测 定，其灵敏度可达ng级； 适用范围：适用于在可见、紫外区有吸收的物质，及通 过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分。
第八节 常用定量分析方法 三、薄层扫描法
薄层扫描法是以薄层色谱法为基础发展起来 的薄层色谱组分原位分析方法及薄层色谱的记录 方法，又称薄层色谱扫描法（TLCS），相应仪 器称为薄层扫描仪（Thin Layer Chromatogram Scanner）。 薄层扫描法是用一定波长的光照射在薄层板 上，对薄层色谱中吸收紫外光或可见光的斑点， 或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫 描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、杂质 检查或含量测定。
（2）内标法 内标法是选一个纯物质作为内标物，并准确称 取一定量内标物加至供试液及标准液中，计算供试 品溶液中某组分含量的定量方法。
内标物的选择要求是： 纯度合乎要求，展开后不得有杂质斑点，否则内 标斑点的峰面积将不能代表内标物的量。 内标物须为样品中所不含有的成分。 内标物不与其它斑点相重叠，分离度合乎要求。 为简化计算，内标物在标准溶液及供试品溶液中 的浓度应相等。
加入纯品后测得总量 供试品中被测组分量 R% 100 ％ 加入纯品量
（4）统计检验 统计检验是检验两种方法、两台仪器或两个人测量 的两组实验数据的精密度或准确度（偶然误差或系统误 差）间是否存在显著性差异，说明新建定量方法可否代 替旧方法或优于旧方法。 统计检验包括F检验与t检验。 F检验即精密度差别检验，用以检验两组数据的精 密度或偶然误差是否存在显著性差异，一般为单侧检验。 t检验即准确度差别检验，用以检验两组测量数据 的平均值或系统误差是否存在显著性差异。若t检验证 明两种方法测得的均值不存在显著性差异时，则新方法 可以代替旧方法，t检验一般为双侧检验。 t检验与F检验的具体方法参见分析化学的有关论著， 此从略。
特点： 1）在一定点样量范围内，内标法定量准确度与点样量无关。 2）不易找到适宜Rf值的纯品内标物，且溶液配制等操作较 麻烦。 方法： 1）内标一点法：当工作曲线通过原点时采用内标一点法。 C A 内标一点法公式： F
②外标二点法 工作曲线不通过原点时，只能用外标二点法定量， 至少需点二种不同浓度的标准溶液（或一种浓度两种点 样量），才能决定一直线,其计算公式为： C=F1A+F2 式中：C、A同前，F1为直线的斜率或比例常数，F2 为纵坐标的截距，F1和F2值由仪器自动算出。
外标一点法、二点法只是指用一种或二种浓度的标准溶液对比 定量，为减小误差，同一薄板上供试品点样不得少于4个，对照品 每一浓度不得少于2个；并调整标淮溶液的浓度或供试品与标准溶 液的点样量，使其峰面积相接近；且点样量必须准确，宜用定量毛 细管点样。