分离工程双水相萃取法
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➢ 萃取法的应用
在生物转化、蛋白质、核酸、病毒、甲酸 脱氢酶、红霉素、头孢霉素C等方面应用 价格较贵(原料成本占85％),未广泛工业化
11.1 双水相体系 11.1.1 双水相的形成
亲水性 聚合物
亲水性 聚合物
分 相
葡聚糖(2.2%)溶液 甲基纤维素(0.72%)溶液 混合静止后产生两相，
上相 甲基纤维素 90.3％
λ—系统的表面特性系数；
k—波尔兹曼常数； T—温度
11.2.2 表面电荷的影响
如粒子带有电荷，两相中分配不相等时， 就会在相间产生电位。称为道南电位 (Donnan Potential)。可用下式表示：
U2U1(Z RZT )FlnK KB A Z Z
式中: U2,U1—分别表示相2和相1的电位；
Z+，Z- —分别表示一种盐的正、负离子的离子价；
Kz+AKz-B—正、负离子不带电时两相间的分配系数； F—法拉第常数，F; R—气体常数，J/(mol.K)；
一种盐正、负离子对两相有不同亲和力， 即Kz+A≠Kz-B时,就会产生电位差;
(Z++Z-)↑电位差↓对分配系数产生影响 影响分配系数的因素,用Gerson公式表示：
产物分离和纯化,直接从细胞破碎萃取蛋 白质无需碎片分离。改变pH和电解质浓度 反萃取。
11.3.1 聚合物及其分子量的影响
重要性：聚合物类型决定了是否能萃取 聚合物溶液混合时的情况： ①完全混溶性(匀相溶液)； ②相分离； ③复杂凝聚(聚合物在同一相,水另一相 离子和非离子聚合物都可构成，当同为
离子电荷相反时，互相吸引发生复杂的凝 聚。
➢ 同一聚合物分子量不同
同一聚合物的疏水性随分子量增加而增 加，其大小的选择依赖于萃取过程的目的 方向
在上相(PEG聚合物)获得较高的蛋白质收 率，应降低→平均分子量
在下相获得较高的蛋白质收率则平均分 子量→增加
PEG平均分子量对分配平衡的影响
系统
分配 系数
产率
KY
相体 积R
PEG400(31.36%)-(NH4)2SO4(14.05%) 6.28 4.75 96.8
聚合物 2 或盐
甲基聚丙二醇 聚乙二醇 聚乙烯醇 聚乙烯吡咯烷酮 羟丙基葡聚糖 葡聚糖 聚乙烯醇 聚乙烯吡咯烷酮 葡聚糖 聚蔗糖 甲基纤维素 羟丙基葡聚糖 葡聚糖
羟丙基葡聚糖 葡聚糖
聚合物 1 乙基羟乙基纤维素 羟丙基葡聚糖
聚蔗糖
聚丙二醇 甲氧基聚乙二醇 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮
聚乙二醇
聚合物 2 或盐 葡聚糖 葡聚糖
11.3.2 系线长度对分配平衡的影响
相图中系线长度由组成总浓度决定，
临界点(K)附近，长度 零，
上相组成＝下相，K0 =1， 聚合物和盐浓度↑,系线长度↑,上相和下相相
对组成差别↑
T
M
B K
11.3.3 盐缓冲液的影响
在水溶液中，离子影响溶质两相分配。 在含水混合物中引入盐,盐的阳阴离子不均 匀分配,影响荷电大分子蛋白质、核酸分配
下相 葡聚糖
71.8％
➢ 双水相形成原因：
分子之间作用力 聚乙二醇（PEG）/ 葡聚糖 (Dextran） (1) A-A >A-B 相分离 (2) A-A<A-B 混合 (3) A-B>>A-A 凝聚复合
成相是由于高聚物之间的不溶性，无法 相互渗透，不能形成均一相，具有相分离 倾向，在一定条件下即可分为两相。
PEGl000(21.77%)-(NH4)2SO4(12.76% 0.26 3.0 43.5
PEG4000(12.67%)-(NH4)2SO4(12.14% 0.30 4.1 59.8
PEG6000(15.76%)-(NH4)2SO4(12.34% 0.03 1.2 2.1
分子量↑K0↑
PEG分子对不同分子量蛋白质分配系数的影响 分子量↑K0↓
60年代瑞典Lund大学的Albertson最先提出双 水相萃取技术;
70年代中西德从细胞匀浆液提取酶,蛋白质 1989年, Diamond等以Flory-Huggins理论为基础， 推导出生物分子在双水相体系中的分配模型
➢ 双水相萃取特点
(1) 保留生物分子活性 (2) 除细胞碎片(与离心和膜分离比成本低) (3) 表面张力低，耗 能少 (4) 成本高 (5) 大分子及小分子萃取
葡聚糖
磷酸钾
硫酸镁 硫酸铵 硫酸钠 甲酸钠 酒石酸钾钠
混溶性疏水梯度
11.1.2 双水相体系相图
➢ 双节线 ➢ 系线 ➢ 节点 T、B ➢ 临界点 K ➢ 杠杆规则
PEG
T
M
质
量
分
数
B
K
Dextran质量分数
Βιβλιοθήκη Baidu
11.2 双水相萃取过程的理论基础
11.2.1 表面自由能的影响
蛋白质等生物大分子物质在两相中的分
第十一章 双水相萃取法
Two-aqueous phase extraction
第十一章 双水相萃取法
双水相萃取技术(Two-aqueous phase extraction ) 又称水溶液两相分配技术,是近年出现的、极有前 途的新型分离技术，可用于生物化学、细胞生物 学和生物化工等领域 历史:1896年Beijernek 琼脂-明胶形成双水相
配也服从Nernst分配定律
K＝ct/cb 式中:ct,cb上、下相中溶质浓度
相系统固定时,分配系数K为常数,与溶质
浓度无关。溶质的分配，总是选择两相中
相互作用最充分或系统能量最低的相，根
据平衡时化学位相等原则， K 由Brownstedt
方程式求得
与表面自由
式中:M—物质分子量；能有关
lnK M kT
-lgK＝ ＋
式中：—表面积； —两相表面自由能之差；δ—电荷数；
—电位差； —由标准化学位和活度系数组成的常数。
K和表面自由能与电位差成指数关系。影 响K因素很多,各因素间影响
目前无定量关联K与蛋白质分子性质关系。 最佳操作条件，实验得到
11.3 影响物质分配平衡的因素
➢ 聚合物及成相盐种类及浓度 ➢ 聚合物平均分子量 ➢ 菌体或细胞种类及含量 ➢ 其他盐种类及浓度 ➢ 体系pH值、温度。 目的：选择最适条件,提高分配系数选择性
11.1.2 双水相体系类型
(1) 高聚物-高聚物 (PEG-Dextran) 易于与后续处理
近年来出现聚合物—无机盐 形成两相 (2) 高聚物-盐 (PEG-(NH4)2SO4 ) 盐浓度高，蛋白质易盐析， 废水处理困难
各种双水相系统
聚合物 1
聚丙二醇
聚乙二醇 聚乙烯醇或 聚乙烯吡咯烷酮 甲基纤维素
在生物转化、蛋白质、核酸、病毒、甲酸 脱氢酶、红霉素、头孢霉素C等方面应用 价格较贵(原料成本占85％),未广泛工业化
11.1 双水相体系 11.1.1 双水相的形成
亲水性 聚合物
亲水性 聚合物
分 相
葡聚糖(2.2%)溶液 甲基纤维素(0.72%)溶液 混合静止后产生两相，
上相 甲基纤维素 90.3％
λ—系统的表面特性系数；
k—波尔兹曼常数； T—温度
11.2.2 表面电荷的影响
如粒子带有电荷，两相中分配不相等时， 就会在相间产生电位。称为道南电位 (Donnan Potential)。可用下式表示：
U2U1(Z RZT )FlnK KB A Z Z
式中: U2,U1—分别表示相2和相1的电位；
Z+，Z- —分别表示一种盐的正、负离子的离子价；
Kz+AKz-B—正、负离子不带电时两相间的分配系数； F—法拉第常数，F; R—气体常数，J/(mol.K)；
一种盐正、负离子对两相有不同亲和力， 即Kz+A≠Kz-B时,就会产生电位差;
(Z++Z-)↑电位差↓对分配系数产生影响 影响分配系数的因素,用Gerson公式表示：
产物分离和纯化,直接从细胞破碎萃取蛋 白质无需碎片分离。改变pH和电解质浓度 反萃取。
11.3.1 聚合物及其分子量的影响
重要性：聚合物类型决定了是否能萃取 聚合物溶液混合时的情况： ①完全混溶性(匀相溶液)； ②相分离； ③复杂凝聚(聚合物在同一相,水另一相 离子和非离子聚合物都可构成，当同为
离子电荷相反时，互相吸引发生复杂的凝 聚。
➢ 同一聚合物分子量不同
同一聚合物的疏水性随分子量增加而增 加，其大小的选择依赖于萃取过程的目的 方向
在上相(PEG聚合物)获得较高的蛋白质收 率，应降低→平均分子量
在下相获得较高的蛋白质收率则平均分 子量→增加
PEG平均分子量对分配平衡的影响
系统
分配 系数
产率
KY
相体 积R
PEG400(31.36%)-(NH4)2SO4(14.05%) 6.28 4.75 96.8
聚合物 2 或盐
甲基聚丙二醇 聚乙二醇 聚乙烯醇 聚乙烯吡咯烷酮 羟丙基葡聚糖 葡聚糖 聚乙烯醇 聚乙烯吡咯烷酮 葡聚糖 聚蔗糖 甲基纤维素 羟丙基葡聚糖 葡聚糖
羟丙基葡聚糖 葡聚糖
聚合物 1 乙基羟乙基纤维素 羟丙基葡聚糖
聚蔗糖
聚丙二醇 甲氧基聚乙二醇 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮
聚乙二醇
聚合物 2 或盐 葡聚糖 葡聚糖
11.3.2 系线长度对分配平衡的影响
相图中系线长度由组成总浓度决定，
临界点(K)附近，长度 零，
上相组成＝下相，K0 =1， 聚合物和盐浓度↑,系线长度↑,上相和下相相
对组成差别↑
T
M
B K
11.3.3 盐缓冲液的影响
在水溶液中，离子影响溶质两相分配。 在含水混合物中引入盐,盐的阳阴离子不均 匀分配,影响荷电大分子蛋白质、核酸分配
下相 葡聚糖
71.8％
➢ 双水相形成原因：
分子之间作用力 聚乙二醇（PEG）/ 葡聚糖 (Dextran） (1) A-A >A-B 相分离 (2) A-A<A-B 混合 (3) A-B>>A-A 凝聚复合
成相是由于高聚物之间的不溶性，无法 相互渗透，不能形成均一相，具有相分离 倾向，在一定条件下即可分为两相。
PEGl000(21.77%)-(NH4)2SO4(12.76% 0.26 3.0 43.5
PEG4000(12.67%)-(NH4)2SO4(12.14% 0.30 4.1 59.8
PEG6000(15.76%)-(NH4)2SO4(12.34% 0.03 1.2 2.1
分子量↑K0↑
PEG分子对不同分子量蛋白质分配系数的影响 分子量↑K0↓
60年代瑞典Lund大学的Albertson最先提出双 水相萃取技术;
70年代中西德从细胞匀浆液提取酶,蛋白质 1989年, Diamond等以Flory-Huggins理论为基础， 推导出生物分子在双水相体系中的分配模型
➢ 双水相萃取特点
(1) 保留生物分子活性 (2) 除细胞碎片(与离心和膜分离比成本低) (3) 表面张力低，耗 能少 (4) 成本高 (5) 大分子及小分子萃取
葡聚糖
磷酸钾
硫酸镁 硫酸铵 硫酸钠 甲酸钠 酒石酸钾钠
混溶性疏水梯度
11.1.2 双水相体系相图
➢ 双节线 ➢ 系线 ➢ 节点 T、B ➢ 临界点 K ➢ 杠杆规则
PEG
T
M
质
量
分
数
B
K
Dextran质量分数
Βιβλιοθήκη Baidu
11.2 双水相萃取过程的理论基础
11.2.1 表面自由能的影响
蛋白质等生物大分子物质在两相中的分
第十一章 双水相萃取法
Two-aqueous phase extraction
第十一章 双水相萃取法
双水相萃取技术(Two-aqueous phase extraction ) 又称水溶液两相分配技术,是近年出现的、极有前 途的新型分离技术，可用于生物化学、细胞生物 学和生物化工等领域 历史:1896年Beijernek 琼脂-明胶形成双水相
配也服从Nernst分配定律
K＝ct/cb 式中:ct,cb上、下相中溶质浓度
相系统固定时,分配系数K为常数,与溶质
浓度无关。溶质的分配，总是选择两相中
相互作用最充分或系统能量最低的相，根
据平衡时化学位相等原则， K 由Brownstedt
方程式求得
与表面自由
式中:M—物质分子量；能有关
lnK M kT
-lgK＝ ＋
式中：—表面积； —两相表面自由能之差；δ—电荷数；
—电位差； —由标准化学位和活度系数组成的常数。
K和表面自由能与电位差成指数关系。影 响K因素很多,各因素间影响
目前无定量关联K与蛋白质分子性质关系。 最佳操作条件，实验得到
11.3 影响物质分配平衡的因素
➢ 聚合物及成相盐种类及浓度 ➢ 聚合物平均分子量 ➢ 菌体或细胞种类及含量 ➢ 其他盐种类及浓度 ➢ 体系pH值、温度。 目的：选择最适条件,提高分配系数选择性
11.1.2 双水相体系类型
(1) 高聚物-高聚物 (PEG-Dextran) 易于与后续处理
近年来出现聚合物—无机盐 形成两相 (2) 高聚物-盐 (PEG-(NH4)2SO4 ) 盐浓度高，蛋白质易盐析， 废水处理困难
各种双水相系统
聚合物 1
聚丙二醇
聚乙二醇 聚乙烯醇或 聚乙烯吡咯烷酮 甲基纤维素