分离工程双水相萃取法
双水相萃取技术
高等分离工程课程论文双水相萃取技术的发展与应用随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新生物技术研究工作的广泛展开，各种生化新产品不断涌现，对生化分离技术也提出了越来越高的要求。
但由于大部分的生物产品原液是具有低浓度和生物活性的，对分离条件以及环境要求及其苛刻，使得传统的液液萃取已不能适应分离要求，因此一种新型的液液分离技术-双水相萃取技术应运而生，双水相萃取技术是利用组分在两水相间分配的差异而进行组分的分离提纯的技术。
由于双水相萃取分离过程条件温和、可调节因素多、易于放大和操作，并可借助传统溶剂萃取的相关理论和经验，不存在有机溶剂残留问题，特别适用于生物物质的分离和提纯。
目前，双水相萃取技术已被广泛地应用于医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域，被认为是生物工程中一种具有广阔应用前景的分离技术，在电化学生物传感器中生物活性分子的制备中至关重要。
1 双水相萃取的基本要点1.1 双水相萃取的原理双水相萃取是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化之目的。
将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这就是双水相体系。
双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。
一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异，混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就越大。
1.2 双水相的种类双水相萃取中使用的双水相是由两种互不相溶的高分子溶液或者互不相溶的盐溶液和高分子溶液组成。
最常见的就是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dextran)和PEG/无机盐(硫酸盐、磷酸盐等)体系,其次是聚合物/低分子量组分、离子液体体系和高分子电解质/高分子表面活性剂体系。
分离工程-双水相萃取铬
铬及其应用的双水相萃取以铬的等离子形态分析王志华，宋清，马泉丽，马慧敏，蜀川良中国北京100080，化学研究所，中心分子科学，中国院士（CAS）摘要：这项工作为铬基于所述两相含水体系异丙醇 - 硫酸铵硫氰酸铵（ⅰ-PrOH-（NH4）2 SO4-NH4SCN）提出了一种新的提取方法，以及对相关的实验条件进行了优化。
结果显示该铬（III），可以定量地提取在选定的条件下：4mL异丙醇，200mL的2mol/ L的硫酸，1mL 4mol/L NH4SCN和3mL饱和（NH4）2SO4溶液（V =10毫升）中，所提出的方法，以应用等离子铬的形态分析进行了研究，并获得满意的结果。
关键词：双水相萃取;形态分析;铬;血浆。
铬在其三价形式被称为是必需的微量元素，它被认为是在碳水化合物，脂蛋白代谢[1]中发挥关键作用。
然而铬在六价已知是有毒和致癌。
随着形态技术具有了足够的选择性，使高灵敏度的铬成为分析化学一项长期挑战。
除了通过色谱法[2-5]，流动注射分析在线选择性测定这两个物种的[6]和电喷雾质谱[7]；由于溶剂萃取的简单，快速和广泛的范围[8]，它仍然是最广泛使用的一种进行分离和富集的方法。
与二苯卡巴肼选择性反应后，用甲基异丁基酮萃取的通常都用于六价类[9]。
Cr（Ⅲ）的提取困难似乎是由于它的惰性和它通常是被萃取转换成铬（VI）并且由总量[10]来确定。
近年来，加入无机盐水溶性聚合物的水溶液双水相萃取已经获得了极大的关注，它的优点：更少毒试剂，快速分离，操作简便，清晰相界，也没有乳化[11-21]。
由于其温和和不会使脆弱的生物分子变性的特点，这种方法已被广泛应用在分离和提纯蛋白质中[12-15]，并且它可以作为提取金属离子的技术[16-18]。
除了可溶性聚合物，某些水溶性有机溶剂和水也可以通过添加无机盐[20-21]形成两相含水体系。
这项工作检查铬在两相含水系统iPrOH-（NH4）2SO4-NH4SCN的提取特征，并提出对铬在血浆中的形态分析更好的样品制备方法。
双水相萃取技术
双⽔相萃取技术双⽔相萃取技术（two-aqueous phase extraction）⼀、前⾔近年来，随着基因⼯程、蛋⽩质⼯程、细胞培养⼯程、代谢⼯程等⾼新⽣物技术研究⼯作的⼴泛展开，各种⾼附加值的⽣化新产品不断涌现，对⽣化分离技术也提出了越来越⾼的要求。
与上游过程相⽐，⽬前作为下游过程的⽣化分离纯化技术往往存在步骤多，收得率低，处理时间长，重复性差等缺点，这样便严重阻碍了⽣物技术的⼯业化发展。
因此，就迫切需要⼀种分离步骤少，收得率⾼，处理时间短，并且易于放⼤的⽣化分离纯化技术，双⽔相萃取技术就满⾜了这⼀需要。
特别是基因⼯程技术的发展，需要从细胞中提取⾼质量的遗传物质，由于细胞破碎后，在溶液中存在⼤量的轻质细胞碎⽚，给遗传物质的提取形成了很⼤的⼲扰，通常通过离⼼分离和溶剂萃取难以得到⾼纯度⾼活性的遗传物质，⽽通过双⽔相初步提取，可以使⽬标物和轻质碎⽚得到很好的分离，且⽬标物的活性⼏乎没有损失。
因此双⽔相萃取技术得到了很⼤的重视，并且在近20年⾥取得了较⼤的发展。
⼆、发展史双⽔相萃取技术⼜称之为⽔溶液两相分配技术（Partition of two aqueous phase system）1、1896年，Beijernek 在琼脂和可溶性淀粉或明胶混合时，发现这种混合溶液能较快地分为两层，他把这种现象称之为聚合物的“不相容性”（incompatibility）――――体系的发现2、1956年瑞典伦得（Luhd）⼤学的Albertson发现双⽔相萃取技术可⽤于蛋⽩质的选择分离，但⽬标蛋⽩同成相⾼聚物的分离是影响了其⼤规模⼯业应⽤。
――――――――――发现可以⽤于分离提纯3、20世纪70年代中期西德的Kula和Kroner等⼈⾸先将双⽔相技术应⽤于从细胞匀浆液中提取酶和蛋⽩质，从⽽⼤⼤改善了胞内酶的提取过程，提⾼了酶的收得率。
―――――――利⽤于活性物质的提取4、1989年，Diamond等⼈以Flory－Huggins理论为基础，推导出⽣物分⼦在双⽔相体系中的分配模型，但有局限性，仍需继续探索，不断完善。
两水相萃取法
（六）、荷电PEG作为成相聚合物
在聚合物上引入电荷可以增大两相间的电位差。可以在 PEG或聚葡糖上引入带电荷的基团。但从式(19—19)来看， 相间电位差与电荷数成反比，而每一葡聚糖分子上可以引入 很多带电荷的基团，故效果较差。相反每一分子PEG只含两 个羟基，只能引入两个荷电基团，故使电场增大的效果较好。
如果产品是蛋白质，并且分配在盐相，则盐可以在错流 过程操作方法下，用超滤或渗析的膜过滤回收。
膜分离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物 的最佳方法。
如果蛋白质积聚在聚乙二醇中，可以通过加入盐来精 制，加入的盐导致蛋白质在盐相中重新分配。
PEG的分离同样可以用膜分离来实现，即用选择性孔 径较大的半透膜来截留蛋白质，同时排除PEG进行回收。
（三）、盐类的影响
各种无机离子在PEG – Dx 两相中的分配系数如表19— 2所示：
由于各相应保持电中性，因而 在两相间形成电位差，这对带电生 物大分子，如蛋白质和核酸等的分 配，产生根大影响，参见式(19— 10)。
例如：加入NaCl对卵蛋白和溶 菌酶分配系数的影响见图19－4。
由此可见，加入适当的盐类， 会大大促进带相反电荷的两种蛋白 质的分离。
通常将蛋白质分配在上相(PEG)，而细胞碎片分配在下 相(盐)。反过来的情况对相的分离不利，因为当上相含固量 高时，分离机的性能会受到影响。
从表19—3可见，在大多数场合下收率都能达到90％， 分配系数在1—20之间，多数场合大于3；很多杂蛋白也能 同时除去。
PEG／盐系统用得很广，主要由于PEG价廉和其选择 性高于PEG／粗葡聚糖系统的缘故。
二、相 图
对于由P, Q两种聚合物和水组成的系统，当P、Q达到 一定浓度时才会形成两相。图中曲线把均匀区域和两相区 域分隔开来, 称为双节线。
制药分离工程：第五章 反胶团萃取与双水相萃取
基本术语
胶束(micelles):
在药剂学中是指: 向水中加入表面活性剂，其分子 则转入溶液中，因其亲油基团的存在，水分子与 表面活性剂分子相互间的排斥力远大于吸引力，
导致表面活性剂分子自身依赖范德华力相互聚集,
形成亲油基向内，亲水基向外，在水中稳定分散， 大小在胶体级别的粒子。
3
水溶液的表面张力随[S]增大而下降。当[S]达 到一定值后，S缔合形成水溶性胶束, 溶液的 表面张力不再随表面活性剂浓度的增大而降低。 胶团形成均是S分子自聚集的结果，是热力学 稳定体系。
表面活性剂在非极性的有机相中超过临界胶团浓度而聚集
形成反胶团,在有机相内形成分散的亲水微环境。
许多生物分子如蛋白质是亲水憎油的,一般仅微溶于有机
溶剂,而且如果使蛋白质直接与有机溶剂相接触,
往往会导致蛋白质的变性失活
因此萃取过程中所用的溶剂必须既能溶解蛋白质又能与水
分层,同时不破坏蛋白质的生物活性。
反胶团萃取技术正是适应上述需要而出现的。
d、pro疏水区与几个反胶团的S疏水尾发生相
互作用，被几个小反胶团所“溶解”。
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5.1.4
反胶束萃取的操作
A 萃取的基本方法 B 反萃取
C
分级萃取
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5.1.5 反胶束萃取的影响因素 1) pH value
AOT = 二-(2-已基已基) 琥珀酸酯磺酸钠
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静电作用：
理论上,当溶质所带电荷与表面活性剂相反时,由 于静电引力的作用,溶质易溶于反胶团,溶解率或 分配系数较大,反之,则不能溶解到反胶团相中。 上图为pH值对不同蛋白质的溶解率急剧变化,当
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5.1.3 反胶束的溶解作用
微水池溶解和分离作用：
生物分离工程-第5章-萃取技术
单级萃取
假定：两相中的分配很快达到平衡； 两相完全不互溶，完全分离。
X S VS CS VS 1 ★ 萃取因素： E 萃取液溶质总量 ＝ ＝K K 萃余液溶质总量 XF VF CF VF m
单级萃取
单级萃取：只包括一个混合器和一个分离器
分离因素（β）
分离因素表示有效成分A与杂质B的分离程度。
KA KB
β=1 KA = KB 分离效果不好；
β>1 KA > KB 分离效果好；
β越大，KA 越大于KB，分离效果越好。
弱电解质在有机溶剂-水相的分配平衡
分配系数中CO和CW 必须是同一种分子类型，即不发生缔合或离解。对 于弱电解质，在水中发生解离，则只有两相中的单分子化合物的浓度才 符合分配定律。 例如青霉素在水中部分离解成负离子（青COO－），而在有机溶剂相 中则仅以游离酸（青COOH）的形式存在，则只有两相中的游离酸分子 才符合分配定律。
多级逆流萃取
在多级逆流萃取中，在第一级中连续加入料液，并 逐渐向下一级移动，而在最后一级中连续加入萃取 剂，并逐渐向前一级移动。
料液移动的方向和萃取剂移动的方向相反，故称为 逆流萃取。 在逆流萃取中，只在最后一级中加入萃取剂，故和 错流萃取相比，萃取剂之消耗量较少，因而萃取液 平均浓度较高。
有机溶剂萃取的影响因素
pH的影响
pH对表观分配系数的影响（pH-K）
pH低有利于酸性物质分配在有机相，碱性物质分 配在水相。 对弱酸随pH↓，K↑, 当pH << pK时，K→K0
由萃取机理和K～pH的关系式可得出如下结论
酸性物质 萃取 反萃取 pH<pK pH>pK 碱性物质 pH>pK pH<pK
两水相萃取
混均
浑浊 澄清 记录(NH4)2SO4 记录 ml数 数
PEG400%
按表格重复操作… 按表格重复操作
(NH4)2SO4%
两水相系统中蛋白质分配系数的测定
一. 实验原理
1. 糖化酶为生物大分子蛋白，在双水相系统中不同程度地分 糖化酶为生物大分子蛋白， 配，分配系数 K = C上/ C下。 相比R 相比 = V上/ V下
系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组 成相同而体积不同的两相。两相的体积近似服 从杠杆规则。
如点M为整个系统的组成，该系统实际上由T、 B所代表的两相组成，vT表示上相体积，vB表 示下相体积，则：
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系 线越长，两相间的性质差别越大。当点M 线越长，两相间的性质差别越大。当点M向下 移动时，系线长度缩短，两相差别减小，到达 K点时，系线长度为0，两相间差别消失而成 点时，系线长度为0 为一相，因此K点为系统临界点(critical point) 为一相，因此K点为系统临界点(critical point)。 双节线的位置和形状与聚合物的相对分子质量 有关。聚合物Dex的相对分子质量越高， 有关。聚合物Dex的相对分子质量越高，相分 离所需的浓度越低；两种聚合物相对分子质量 相差越大，双节线的形状越不对称，见图。 相差越大，双节线的形状越不对称，见图。
11.4 影响分配的因素
(1) 聚合物组成的影响 Dextran 分子量（粘度高，价格）。 PEG分子量 PEG分子量 (2) 聚合物浓度影响 密度，密度差，粘度，粘度差，表面张力。 上述参数随聚合物浓度变化。 （3）盐与缓冲液 A 盐离子的不均匀分配改变两相间电位差 B 高盐浓度引起盐析效应 （4） pH lgKi*=lgKi+γZi , 等电点测定 （5） 温度的影响(离开临界点远，不太敏感，粘度) 温度的影响(离开临界点远，不太敏感，粘度两水相萃取
生物分离工程工艺原理6
• 2.温度的影响 • 不同温度条件下，制得的相图略有 差别。在临界点附近温度对两相系 统的形成比较敏感。 • 3.时间的影响 • 两相的形成需要有一定的时间。 • 4.低分子物质能调节系统的平衡。
• • • •
五、影响分配的因素 1.盐类的影响 （1）种类 加入适当的盐类,会大大促进带相反电荷的 两种蛋白质的分离。 • （2）浓度 • 当盐类浓度很大时（1-5M，NaCl），则由 于盐析作用，蛋白质易分配于上相，logK几 乎随NaCl浓度增大，而线性地增大。 • 2.聚合物的影响
• 二、双水相萃取技术同其他分离技术结 合，提高分离效率。 • 1.双水相体系同生物转化相结合 • 可解决在许多生物转化中存在的两个问 题： • （1）是由于双水相体系对菌体及酶没 有毒性，同时又可将产物萃入上相，所 以可消除产物抑制效应； • （2）是使分布在下相的细胞（酶）循 环使用从而为固定化细胞及酶的应用开 辟了新路。 • 2.双水相萃取同膜分离技术结合 • 3.双水相萃取同亲和层析相结合-亲和 双水相
• 第一节 双水相分离理论 • 一、双水相的形成 • 当两种聚合物溶液互相混合时，究竟是否 分层或混合成一相，决定于两种因素：
• 一为体系熵的增加；另一为分子间作 用力。两种物质混合时熵的增加与涉 及的分子数目有关。因而，如以摩尔 计算，则小分子间与大分子间的混合， 熵的增加是相同的。但分子间的作用 力，可看作分子中各基团间相互作用 力之和，分子越大，当然作用力也越 大。因此，对大分子而言，如以摩尔 为单位，则分子间的作用力与分子间 的混合熵相比占主要地位，因而主要 由前者决定混合的结果。 •
Separation engineering of Biotechnology
E-mail: 刘树中 Liushuzhong@
双水相萃取法
双水相萃取法的应用及研究进展摘要:双水相萃取技术作为一项新的分离技术日益受到重视，它与传统的萃取及其它分离技术相比具有操作条件温和、处理、量大、易于连续操作等优点，从而使其能广泛应用于生物分离工程中。
本文介绍了双水相的形成、双水相萃取技术的基本原理以及影响物质分配系数的因素。
同时对双水相萃取技术的研究进展及其应用进行了综述。
关键词：双水相萃取分离纯化进展一：方法随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新技术研究工作的广泛开展，各种高附加值的生化新产品不断涌现，对生化分离技术也提出了越来越高的要求。
包括精馏、吸收、萃取、蒸发、结晶在内传统的分离技术有三大特点:分离过程伴随有相的变化;筛分过程不能实现分子级别的分离;精制过程成本极高，这些特征对于节约能源、生物分离、环境保护、资源开发、替代能源、高纯材料等当代化学工程与科学技术发展不相适应。
围绕以上几个问题的讨论就构成了分离技术研究与发展的主流，即新型分离技术产生的背景。
双水相萃取技术始于20世纪60年代，从1956年瑞典伦德大学Albertsson发现双水相体系[2]到1979年德国GBF的Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离，虽然只有20多年的历史，但由于其条件温和，容易放大，可连续操作，目前，已成功的应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离和纯化，双水相体系也已被成功的应用到生物转化及生物分析中。
双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相溶性，使得聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不相溶的两相，因使用的溶剂是水，因此称为双水相原则上，无论是天然的还是合成的亲水聚合物，绝大多数在与另一种聚合物水溶液混合时都可分成两相，构成双水相体系。
双水相萃取与水一有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
07双水相萃取法
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由于高聚物对生物活性物质有稳 定作用，在大规模生产中多采用常 温操作，从而节省冷冻费用。但适 当提高操作温度，体系黏度较低， 有利于分离。
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2.2 双水相萃取过程
双水相萃取过程包括以下几个步 骤：
双水相的形成； 溶质在双水相中的分配； 双水相的分离。
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2.2 双水相萃取过程
在实际操作中，经常将固状(或浓 缩的)聚合物和盐直接加入到细胞匀 浆液中，同时进行机械搅拌使成相 物质溶解，形成双水相。
溶质在两相中发生物质传递，达 到分配平衡。
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聚合物和盐的溶解多为萃取过程 的速率控制步骤。达到分配平衡后 的两相分离可采用重力沉降(静置分 层)或离心沉降法。
易定量控制； 水溶性的高聚物难以挥发，使反萃
必不可少发展
1．双水相萃取与细胞破碎过程相结合 2．亲和双水相萃取 3．双水相萃取与膜分离相结合 4．使用带配基的吸附剂微粒特异性地吸附待
分离的生物大分子，利用微粒与杂蛋白分配系 数的差别，分离某些难以分离的生物大分子。 5．双水相萃取与生物转化过程结合
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1.2 相图
把双水相体系中的组成成分，分 别以不同的浓度相混，然后观察其 成相过程，把此过程以图的形式描 绘下来，即称为此种双水相体系的 相图。
不同的双水相体系，其成相条件 是不同的，相图常被用于研究不同 双水相体系中的成相现象。
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用A点代表体系总组成，B点和C点分别代 表互相平衡的上相和下相组成，称为节点。
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2.3 双水相萃取的优点▲
双水相萃取对于生物物质的分离和 纯化表现出特有的优点和独有的技 术优势，具体表现在以下方面： ①易于放大。各种参数可以按比 例放大而产物收率并不降低。
双水相萃取技术的研究进展及应用
述———————瓦丽而矿垒盟双水相荸取技永的研舞进展及硅用ｉ江咏。
李晓玺，李琳，胡松青（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州５ｌｏ“ｏ）摘要：夼绍了双水相革取技术（ＡＴＰＥ）的应用现状，综述了近年来取水相萃取技术的相关研完进展。
针对双水相系统（ＡＴ鸭）的经济适用性问题，对新型ＡＴＰｓ相组成材料的研究取得了极大的发展；为了提高双水相萃取技术的选择性争分毒效率，在组成传统Ⅳｌ＿皓的聚合物上偶联亲和配基的亲和Ａ什ｓ也得到关注；越水相萃取技术的发展趋势还体现在与其他生物分离技术的结合以厦革职机理和鹅力学模型的优化上。
美羹词：双水相革卑．蛋白质，分离纯化＾ｂｓ打ａｄ：Ｔｈｅａｐｐ｜ｉｃａｔｉｏｎｓ。
ｆｔｈｅａｑｕｅｏｕｓｔｗ０一ｐｈａｓｅｅｘｔｒａｃｔｌｏｎ（ＡＴＰＥ）ｍｔｈｅ８ｅｙｅａｒｓｗｅｒｅｓｕｍｍａｎｚｅｄ，ａｎｄ廿１ｅａｄｖａｎｃｅｓＯｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈ０ｆＡＴＰＥｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄＴｈｅｎｄｖｅｌａｑｕｅｏｕｓｔｗｏ—ｐｈ船ｅｓｙｓｔｅｍｓｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｂｙｕｓｌｎｇｔｈｅｃｈｅａｐｅｒｐｈａｓｅｆＯｒｍＩｎｇｐＯｌｙｍｅｒｌｎＯｒｄｅｒｔｏｉｍｐｒｏｖｅｆｈｅ∞ｌｅｃｔｌｖ时ａｎｄｓｅｐａｒａｔｌｏｎｅ衔ｃＩｅｎｃｙ，ｉｈｅａ卅Ｉｎ时ｅｘｔｒａｃｔｂｎｕｄｎｇａｑｕｏｏｕｓｎⅣ０一ｐｈａｓｅｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＴＰｓ）ｗｈｌｃｈ呲ｓ甜ｌｎｉ【ｙ¨ｇａｎｄｔ。
ｐｏＩｙｍｅｒｍｔｒａｄｎｌｏｎａｌＡＴＰｓｇｏｔｐｒＯｇｒｅｓｓｅｄＴｈｅｉｎｔｅｇｒａｔＩｏ几ｗ胁ｒｅｌａｔｅｄＩｅｃｈｎＩ口ｕｅｓｗａｓａＩｓｏｔｈｅｄｅｖｅ帅ｍｅｎＣｄｊｒｅｃｔｉｏｎｏｆＡＴＰＥ，ｗｈｌｃｈｏｖｅｒｃａｍｅｓｏｍｅｓｈｏｎｃｏｍＩｎ９８ｍ８ｉｎ９１ｅＡ丁尸ＥＡ｜ｔｈｏｕｇｈｔｈｅａｐｐｌｌｃａｔｌｏｎ０ｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｆＩｏｎｅｑｕｌｐｍｅｎｆｓ钔ｄｃＯｎｆｌｎｕｏｕｓＯｐｅｒａｔＩｏｎｔｅｃｈｎ旧ｕｅｍＡＴＰＥｌｎｄＩｃａＩｅｄｆｈａｔｔｈｅｍｄｕＳｔｒｌ纠ＥａｔｌｏｎｓｏｆＡＰＴＥｗｅｒｅｇ删ｎｇｕｐ．ｅｓｔａｂｌｌｓｈｉｎｇｌｈｅｔｈｅｒｍＯｄｙｎａｍｉｃｍｏｄｅｌｓａｎｄｔｈｏｏｎｅｓａｂｏｕｔｔｈｅｐａｎｈｌＤｎｌｎｇｏｆｓｏｌｕｔｅｎＡＴＰＳｎ∞ｄｔｏｂｅｏＤｔｌｍＩｚｅｄＫｅｙｗｏｒｄ８：ａｑｕｅｏｕｓ帅一ｐｈａｓｅｅ巾ａｃｔ吣“；ｐｒｏｔｅ…；８ｅｐａｒａｔＩｏｎａｎｄ０ｕｒｉｆｉｃａｆｌＯｎ中图分类等：础１１文献标识码：Ａ文章编号：１００２一０３０６（２００７）ｌＯ一０２３５—０４分离纯化出高纯度有生物活性的蛋白质一直是项艰巨的工作。
双水相萃取技术详解
4.3 在医药行业的应用
双水相体系不仅可以用于分离医药行业需要的细胞，还 可以用来高效的提取抗生素。抗生素不仅能杀灭细菌，而且 对支原体、衣原体等致病微生物也具有良好的抑制及杀灭效 果。所以双水相萃取技术在医药行业得到广泛认可。 如： ①利用免疫亲和性PEG/Dextran 双水相体系从脐带血中分离 造血干细胞/源细胞。 ②亲水性离子液体 1-丁基-3- 甲基咪唑四氟硼 BF₄和 NaH₂PO₄形成的双水相体系能够快速从青霉素水溶液中萃取 青霉素G。 ③用亲水性离子液体四氟硼酸 1-丁基-3- 甲基咪唑四氟硼 BF4 和 NaH2PO₄组成的双水相体系萃取分离四环素。
2.1.4 相图
图1是典型的高聚物-高聚 物-水双水相体系的直角坐标 相图。两种聚合物A、B以适 当比例溶于水就会分别形成 有不同组成密度的两相。轻 相组成用T点表示，重相组成 用B点表示。曲线ＴＣＢ称为 结线，直线ＴＭＢ称为系线 。结线上方是两相区，下方 为单相区。
●
其中上下相组成分别为T和B， T和B量的遵循杠杆定律: 即T和B相质量之比等于系线 上MB与MT的线段长度之比。
⑤为降低成本和保证安全操作，应将成本高的和易燃易爆的液
体作为分散相。
产生分散相的动 力 重力差
微分接触式 喷啉塔、填料塔
逐级接触式 筛板塔、流动混合 器
机械搅拌
转盘萃取塔、搅拌 萃取塔、振动筛板 塔 脉冲填料塔、脉冲 筛板塔 连续式离心萃取器
混合澄清器
脉冲
离心力作用
脉冲混合澄清器
逐级式离心萃取器
3.5.2 脉动填料塔
3.3进行两水相生物转化反应需满足以下条件
● 催化剂应单侧分配； ● 底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分配 在另
一相中；要有合适的相比。如产物分配在上相中，则
双水相萃取法
双水相萃取技术twoaqueous phaseextraction : 利用不同的高分子溶液相互混合可产生两相或多相系
统;静置平衡后;分成互不相溶的两个水相;利用物质在互 不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法;称 为双水相萃取法;
特点：能保留产物的活性;操作可连续化;可纯化蛋白质 2~5倍;
pH对酶的分配系数也有很大关系;特别是在系统中含有磷酸盐时;由于 pH的变化会影响磷酸盐是一氢化物还是二氢化物磷酸盐的存在;而一 氢化物磷酸盐对界面电位有明显的影响
四 双水相萃取的应用
应用特点: 双水相系统平衡时间短;含水量高;界面张力低; 为生物活性物质提供了温和的分离环境; 它还具备操作简 便 经济省时 易于放大; 据报道;系统可从10ml直接放大到 1m3规模105倍;而各种试验参数均可按比例放大;产物收率 并不降低;
c 吸附于反胶团内壁；
d 疏水区与几个反胶团的S疏水 尾发生相互作用;被几个小反胶 团所溶解;
四 影响因素
1 表面活性剂的种类：早期用一种表面活性剂;现在混合体系的研究较多
2 水相pH值：决定蛋白质表面带电基团的离子化状态;与表面活性剂的头部 基团有相互作用
3 温度：提高温度可使反胶束排斥水;起浓缩作用
二分配系数
影响分配系数的因素包括很多;如粒子大小 疏水性 表面电荷 粒子或大分子的构象等;这些 因素微小的变化可导致分配系数较大的变化; 因而双水相萃取有较好的选择性;
三 影响双水相萃取的因素
一 成相高聚物的分子量
一般原则:对于给定的相系统;如果一种高聚物被低分子量的同种高聚 物所代替;被萃取的大分子物质;如蛋白质 核酸 细胞粒子等;将有利于 在低分子量高聚物一侧分配
一 基本原理
工业双水相萃取工艺流程
1、配制一系列不同浓度、pH及离子强度的双水相，每个双水相改变一个参数。
2、加入料液，再加水使整个系统质量达到5~10g。
离心管封口后充分混合。
3、1800－2000g下离心3－5min，使两相完全分离。
4、用吸管或移液管将上相和下相分别吸出，测定上、下相中目标产物的浓度或生物活性，计算分配系数。
5、上、下两相中目标产物的总量应与加入量对比，以检验是否存在沉淀或界面吸附现象，并可确认浓度或活性测定中产生的系统误差。
6、分析目标产物的收率和纯化倍数，确定最佳双水相系统。
双水相萃取全解
PEG = 聚乙二醇(polyethylene glycol) Kpi = 磷酸钾
DX = 葡聚糖(dextran)
2、双水相体系的特点
优点：
• 操作条件温和，在常温常压 下进行。 • 两相的界面张力小，一般在 10-4N/cm 量级，两相易分散。 • 两相的相比随操作条件而变 化。
• 易于连续操作，处理量大，适合工 业应用。 • 两相的溶剂都是水，上相和下相的 含水量高达70%～ 90%，不存在有机 溶剂残留问题。
聚乙二醇
非离子型聚合物/ 非离子型聚 合物
聚丙二醇
聚乙烯醇 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮
高分子电解质/非离子型聚合物
羧甲基纤维素钠
聚乙二醇
高分子电解质/高分子电解质
聚合物/ 低分子量化合物
葡聚糖硫酸钠
葡聚糖
羧甲基纤维素钠
丙醇
磷酸钾
聚合物/ 无机盐 聚乙二醇 硫酸铵
双水相的形成
在聚合物∕盐或聚合物∕聚合物系统混合时， 会出现两个不相混溶的水相
接着在混合液中加入一定量的去离子 水至浑浊变澄清，再次逐滴加入硫酸铵 溶液至出现浑浊且半分钟内浑浊不变化， 重复上述步骤。根据测量数据作出 PEG4000∕硫酸铵溶液的双水相相图。
图中的曲线为双结线 (Binodal)，双结线 以下的区域为均相区， 以上的区域为两相区， 也称为工作区。连接 双结线上两点的直线 称为系线(Tie一line， 简称TL)，表示了双 水相体系达到相平衡 时上、下相组成和总 组成的关系。
双水相体系的双结线模型
系线上的各点上 下相的组成相同，而 体积不同，上下相的 体积比近似服从杠杆 原理，即： Vt/Vb=Ab/At 其中， Vt/Vb分 别为上相和下相体积， Ab/At分别为A点与B 点和A点与T点之间的 距离。
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11.1.2 双水相体系类型
(1) 高聚物-高聚物 (PEG-Dextran) 易于与后续处理
近年来出现聚合物—无机盐 形成两相 (2) 高聚物-盐 (PEG-(NH4)2SO4 ) 盐浓度高，蛋白质易盐析， 废水处理困难
各种双水相系统
聚合物 1
聚丙二醇
聚乙二醇 聚乙烯醇或 聚乙烯吡咯烷酮 甲基纤维素
PEGl000(21.77%)-(NH4)2SO4(12.76% 0.26 3.0 43.5
PEG4000(12.67%)-(NH4)2SO4(12.14% 0.30 4.1 59.8
PEG6000(15.76%)-(NH4)2SO4(12.34% 0.03 1.2 2.1
分子量↑K0↑
PEG分子对不同分子量蛋白质分配系数的影响 分子量↑K0↓
➢ 萃取法的应用
在生物转化、蛋白质、核酸、病毒、甲酸 脱氢酶、红霉素、头孢霉素C等方面应用 价格较贵(原料成本占85％),未广泛工业化
11.1 双水相体系 11.1.1 双水相的形成
亲水性 聚合物
亲水性 聚合物
分 相
葡聚糖(2.2%)溶液 甲基纤维素(0.72%)溶液 混合静止后产生两相，
上相 甲基纤维素 90.3％
第十一章 双水相萃取法
Two-aqueous phase extraction
第十一章 双水相萃取法
双水相萃取技术(Two-aqueous phase extraction ) 又称水溶液两相分配技术,是近年出现的、极有前 途的新型分离技术，可用于生物化学、细胞生物 学和生物化工等领域 历史:1896年Beijernek 琼脂-明胶形成双水相
➢ 同一聚合物分子量不同
同一聚合物的疏水性随分子量增加而增 加，其大小的选择依赖于萃取过程的目的 方向
在上相(PEG聚合物)获得较高的蛋白质收 率，应降低→平均分子量
在下相获得较高的蛋白质收率则平均分 子量→增加
PEG平均分子量对分配平衡的影响
系统
分配 系数
产率
KY
相体 积R
PEG400(31.36%)-(NH4)2SO4(14.05%) 6.28 4.75 96.8
配也服从Nernst分配定律
K＝ct/cb 式中:ct,cb上、下相中溶质浓度
相系统固定时,分配系数K为常数,与溶质
浓度无关。溶质的分配，总是选择两相中
相互作用最充分或系统能量最低的相，根
据平衡时化学位相等原则， K 由Brownstedt
方程式求得
与表面自由
式中:M—物质分子量；能有关
lnK M kT
60年代瑞典Lund大学的Albertson最先提出双 水相萃取技术;
70年代中西德从细胞匀浆液提取酶,蛋白质 1989年, Diamond等以Flory-Huggins理论为基础， 推导出生物分子在双水相体系中的分配模型
➢ 双水相萃取特点
(1) 保留生物分子活性 (2) 除细胞碎片(与离心和膜分离比成本低) (3) 表面张力低，耗 能少 (4) 成本高 (5) 大分子及小分子萃取
11.3.2 系线长度对分配平衡的影响
相图中系线长度由组成总浓度决定，
临界点(K)附近，长度 零，
上相组成＝下相，K0 =1， 聚合物和盐浓度↑,系线长度↑,上相和下相相
对组成差别↑
T
M
B K
11.3.3 盐缓冲液的影响
在水溶液中，离子影响溶质两相分配。 在含水混合物中引入盐,盐的阳阴离子不均 匀分配,影响荷电大分子蛋白质、核酸分配
产物分离和纯化,直接从细胞破碎萃取蛋 白质无需碎片分离。改变pH和电解质浓度 反萃取。
11.3.1 聚合物及其分子量的影响
重要性：聚合物类型决定了是否能萃取 聚合物溶液混合时的情况： ①完全混溶性(匀相溶液)； ②相分离； ③复杂凝聚(聚合物在同一相,水另一相 离子和非离子聚合物都可构成，当同为
离子电荷相反时，互相吸引发生复杂的凝 聚。
Z+，Z- —分别表示一种盐的正、负离子的离子价；
Kz+AKz-B—正、负离子不带电时两相间的分配系数； F—法拉第常数，F; R—气体常数，J/(mol.K)；
一种盐正、负离子对两相有不同亲和力， 即Kz+A≠Kz-B时,就会产生电位差;
(Z++Z-)↑电位差↓对分配系数产生影响 影响分配系数的因素,用Gerson公式表示：
下相 葡聚糖
71.8％
➢ 双水相形成原因：
分子之间作用力 聚乙二醇（PEG）/ 葡聚糖 (Dextran） (1) A-A >A-B 相分离 (2) A-A<A-B 混合 (3) A-B>>A-A 凝聚复合
成相是由于高聚物之间的不溶性，无法 相互渗透，不能形成均一相，具有相分离 倾向，在一定条件下即可分为两相。
λ—系统的表面特性系数；
k—波尔兹曼常数； T—温度
11.2.2 表面电荷的影响
如粒子带有电荷，两相中分配不相等时， 就会在相间产生电位。称为道南电位 (Donnan Potential)。可用下式表示：
U2U1(Z RZT )FlnK KB A Z Z
式中: U2,U1—分别表示相2和相1的电位；
-lgK＝ ＋
式中：—表面积； —两相表面自由能之差；δ—电荷数；
—电位差； —由标准化学位和活度系数组成的常数。
K和表面自由能与电位差成指数关系。影 响K因素很多,各因素间影响
目前无定量关联K与蛋白质分子性质关系。 最佳操作条件，实验得到
11.3 影响物质分配平衡的因素
➢ 聚合物及成相盐种类及浓度 ➢ 聚合物平均分子量 ➢ 菌体或细胞种类及含量 ➢ 其他盐种类及浓度 ➢ 体系pH值、温度。 目的：选择最适条件,提高分配系数选择性
葡聚糖
磷酸钾
硫酸镁 硫酸铵 硫酸钠 甲酸钠 酒石酸钾钠
混溶性疏水梯度
11.1.2 双水相体系相图
➢ 双节线 ➢ 系线 ➢ 节点 T、B ➢ 临界点 K ➢ 杠杆规则
PEG
T
M
质
量
分
数
B
K
Dextran质量分数
11.2 双水相萃取过程的理论基础
11.2.1 表面自由能的影响
蛋白质等生物大分子物质在两相中的分
聚合物 2 或盐
甲烯醇 聚乙烯吡咯烷酮 葡聚糖 聚蔗糖 甲基纤维素 羟丙基葡聚糖 葡聚糖
羟丙基葡聚糖 葡聚糖
聚合物 1 乙基羟乙基纤维素 羟丙基葡聚糖
聚蔗糖
聚丙二醇 甲氧基聚乙二醇 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮
聚乙二醇
聚合物 2 或盐 葡聚糖 葡聚糖