限制性核酸内切酶切割位点分析

限制性内切酶考点小结

限制性内切酶考点盘查限制性内切酶是基因工程中最难把握的知识点，高考中对这种酶的考察特别重视，我们有必要对相关的知识先进行归纳，才有利于解答试题。

1 限制性核酸内切酶的基本知识①来源及化学本质:主要是从原核生物中分离纯化出来的。

化学本质为蛋白质。

②作用：催化作用，可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割，切割的化学键为磷酸二酯键。

③作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。

④切割方式：错位切--产生两个相同的黏性末端，平切--形成平末端。

如果是错位切则将一个基因从DNA分子上切割下来,需要破坏4个磷酸二酯键,同时产生4个黏性末端，增加4个游离的磷酸基团。

2 限制性核酸内切酶的难点解析2.1 目的基因切割要点归纳①要把目的基因切割下来需要在目的基因的两边都进行切割，但绝对不可以破坏目的基因的结构。

②切割目的基因的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。

③切割产生的末端有三种情况：都是平末端、都是粘性末端、一边是粘性末端，一边是平末端。

2.2 质粒切割要点归纳①质粒的切割可以切一个切口，也可以切两个切口。

如果是一个切口，则连接时可能会产生一些我们不需要的连接物(如自身环化等)；如果是两个切口则质粒会丢失一段DNA片段，但可以控制连接物就是我们需要的目的基因和质粒的连接。

切割时注意不要破坏了载体上的标记基因（至少保留有一个标记基因）、终止子、启动子、复制原点等。

②切割质粒的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。

③切割产生的末端有三种情况：都是平末端，都是粘性末端，一边是粘性末端，一边是平末端。

2.3 限制性核酸内切酶的说明不同的酶识别序列一般不同，但也有识别序列相同的。

如果识别序列相同，切割点也相同则切割产生的粘性末端一样。

一种酶的识别序列中可能包含另外一种酶的识别序列，切割时可以产生相同的粘性末端。

不同的酶识别的序列一般不同，但有时也可能相同，这时切割产生的粘性末端也相同。

限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用

5.DNA 酶切位点没有甲基化
( 如 Dpn1) 6.DNA 位点上存在其它修饰 7.DNA 不存在该酶识别顺序
验证
二 . 如果 DNA 切割不完全？ 1. 内切酶活性下降 2. 内切酶稀释方法不正确 3.DNA 不纯，反应条件不佳 4. 内切酶识别的 DNA 位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰 5. 部分 DNA 溶液粘在管壁上 6. 内切酶溶液粘度大，取样不准 7. 酶切后 DNA 粘性末端退火 8. 由于反应溶液、温度使内切酶变性 9. 过度稀释使酶活性降低

应用二
利用pBR322作为载体重组人体的抑生长激素也是一个经常提到的应用例子。其过程和水稻叶绿体基因重组大同小异，只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因外，还将含有lac操纵子起始部分的片段（包括启动子，操作区，核糖体集合位点和β-半乳糖苷酶的主要部分）插在抑生长激素基因的旁边。由于有了lac操作子的控制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了
限制性核酸内切酶切割原理、
方法、结果分析及应用
PPT制作：杜雨濛、张佳佳、陈靓
课堂内容回顾：
1、定义： 1、定义：限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。 2、分类：
（根据酶的基因、蛋白质结果、依赖的辅助因子及DNA裂解的特异性，将限制性内切酶分为三种类型）
解决方法 1. 用 5-10 倍量过量消化 2. 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 3. 同上 4. 同上
5. 反应前离心数秒
6. 将内切酶稀释，增大取样体积 7. 电泳前将样品置 65 ℃保温 5-10 分钟，取出后置冰浴骤冷 8. 使用标准反应缓冲液及温度 9. 适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏 10. 使用最佳反应体系

限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验原理及步骤、注意事项

实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。

根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。

其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。

限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。

一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。

许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。

例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。

5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。

限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。

根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。

根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。

小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。

本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。

在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。

在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。

二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。

2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。

酶切位点平末端

酶切位点平末端
酶切位点平末端指的是一种特定的DNA或RNA序列结构，其中两个不同的序列在同一个平面上相互平行且相对。

这种结构通常出现在DNA或RNA的限制性内切核酸酶的切割位点处，这些酶能够识别特定的序列并切割DNA或RNA分子。

在DNA或RNA分子中，酶切位点平末端的具体示例包括：
1.EcoRI酶切位点：EcoRI是一种限制性内切核酸酶，能够识别并切割DNA
分子中的GAATTC序列。

切割后产生的片段具有平末端。

2.BamHI酶切位点：BamHI是一种限制性内切核酸酶，能够识别并切割
DNA分子中的GGATCC序列。

切割后产生的片段同样具有平末端。

在生物实验中，酶切位点平末端的应用非常广泛。

例如，在构建基因克隆载体时，需要将目的基因与载体进行连接，通常需要在目的基因和载体之间进行限制性内切核酸酶的切割。

当使用平末端的限制性内切核酸酶进行切割时，可以获得两个平末端的DNA片段，通过连接这些片段可以实现目的基因与载体的连接。

总结来说，酶切位点平末端指的是一种特定的DNA或RNA序列结构，其中两个不同的序列在同一个平面上相互平行且相对。

这种结构通常出现在限制性内切核酸酶的切割位点处，这些酶能够识别特定的序列并切割DNA或RNA 分子。

在生物实验中，酶切位点平末端的应用非常广泛，例如在构建基因克隆载体时需要进行限制性内切核酸酶的切割和连接。

限制性内切酶小知识

限制性核酸内切酶
制作人：*** 日期：*****
简介
限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease):识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。 [别名] Endodeoxyribonuclease [酶反应] 限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA 并将其降解。 [单位定义] 在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中， 1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
特征和种类
1．限制与修饰现象早在 50 年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主控制的专一性（host controlled specificity）。 l 噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题（表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。 E.coli 菌株 λ噬菌体感染率 lK lB lC E.coli K 1 10-4 10-4 E.coli B 10-4 1 10-4 E.coli C 1 1 1 说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统，可排除外来的 DNA 。 104 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限制酶降解外源 DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成为 5' 甲基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。
3．限制酶切割的位置限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单侧之别。切点在两端的有 Sau3AⅠ（↓GATC）、 NlaⅢ（CATG↓）和 EcoRⅡ（↓CCWGG）等；在两侧的有 BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和 TspRⅠ （CASTGNN↓）， BcgⅠ 酶的切割特性与其它酶不同，它们在识别位点的两端各切开一个断点，而不是只产生一个断点。切点在识别位点外侧的还有 BbvⅠ[GCAGC（8/12）] 和 BspMⅠ[ACCTGC（4/8）] 等。 BcgⅠ ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓； ↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑ TspRⅠ NNCAC（G）TGNN↓ ↑NNGTG（C）ACNN

限制性内切酶酶切位点保护碱基

寡核苷酸近末端位点的酶切
(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。

在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

单位的寡实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A
260
核苷酸。

取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别
, 反应2小时和20小时。

反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl
2
5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。

20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。

本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。

若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。

实验五 DNA的限制性内切酶酶切反应(定稿)

实验五DNA的限制性内切酶酶切反应DNA restriction enzyme digestion一、实验目的通过本实验掌握DNA的限制性内切酶酶切反应的基本原理与实验过程。

二、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。

它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP 的存在。

Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。

Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。

绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4 至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。

Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段(如Sma:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3' →5'…G AATTC…3' ；3'…CTTAA↑G …5' →3'…CTTAA G…5' 。

Pvu I 的识别序列5'…ＣＧＡＴ↓ＣＧ…3' →5'…ＣＧＡＴＣＧ…3'三、实验仪器与设备水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉,紫外透射仪,凝胶成像系统四、实验材料与试剂pUC18质粒：2686bp，0.5μg/μl，40μl/管（日本东洋纺织株式会社） Pvu I 酶及其酶切缓冲液：10U/μl，200U/管（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），在pUC18质粒上有两个酶切位点，分别为酶切第一个碱基位是276（896bp）、2066（1790bp)10X的酶切反应体系（使用时酶切反应体系为1X）琼脂糖(Agarose) 溴化乙锭：5×TBE 电泳缓冲液：（使用时稀释10倍）6×电泳载样缓冲液：五、实验步骤1.将清洁干燥并经灭菌的eppendorf 管(最好0.2ml)编号,用微量移液枪分别加入pUC18质粒2μl（1μg）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水15μl（使总体积为19μl）, 用手指轻弹管壁使溶液混匀,然后加入1μl 酶液,用吸头轻轻抽吸数次混匀酶切反应物，用微量离心机2000rpm数秒,使溶液集中在管底。

DNA的限制性酶切实验原理

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1
一、DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型
根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制
与修饰酶，则以罗马数字表示，如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
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由 pUC18改造而来，大小为 3162bp 。相当于在 pUC18中增加了带有 M13
噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。
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二、琼脂糖凝胶电泳实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。
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11
琼脂糖电泳的优点
（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。

生物化学与分子生物学实验技术-实验四限制性内切酶分析

GGATCC CCTAGG
回文结构(Palindrome)
产生黏性末端（sticky end）或平头末端（blunt end）
实验原理
➢ Hin d III 是应用最广泛的限制性内切酶之一，酶切位点和切割位点如下：
➢ DNA采用PCR法获得内参基因GAPDH（815bp）。 ➢ GAPDH片段中含有一个Hin d III酶切位点，酶切
➢ 凝胶完全凝固后，移去梳子，将凝胶放入电泳槽，点样端置于负极。TAE缓冲液使恰好没胶面约1mm。
StepⅣ 酶切结束后，加入4 µl 6×loading buffer，
混匀备用。
StepⅤ 20µl Loading ：
-
M
未酶切
DNA
酶切样品
+
StepⅥ 电泳： 120V ，30- 40 min
分类： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类
命名：
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d strain Ⅲ 流感嗜血杆菌d株的第三种酶属系株序
第一个字母取自产生该酶的细胞属名，用大写；第二、第三个字母是该细胞的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。
识别和切割位点
配置酶切体系，混匀
ddH2O 10×buffer DNA（PCR产物） Hin d III
5 µl 2.5 µl 10 µl 2.5 µl 20 µl
漩涡离心机瞬时离心。
StepⅡ 37℃保温1h。
StepⅢ 1.0%琼脂糖凝胶制备：
➢ 使用微波炉（中高火）加热agarose（1~2min），待溶液冷却至60℃； ➢ 将琼脂糖溶液倒入胶模中，厚度约3-5mm，避免产生气泡；
StepⅦ 染色、观察：

生物化学--实验十五DNA的限制性内切酶酶切分析

实验十五 DNA的限制性内切酶酶切分析【目的要求】1.掌握限制性核酸内切酶的基本概念、作用特点及作用原理2.熟悉DNA的限制性内切酶酶切分析操作技术及其影响因素3.了解DNA酶解技术生物研究领域的应用【实验原理】限制性内切酶(restriction endonuclease，RE)是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸顺序(一般具有双重对称的回文结构)，并以内切方式水解水解双链DNA的核酸水解酶。

它主要分布于细菌体内，目前已发现1800多种。

根据酶的组成、辅助因子及水解DNA的方式不同，可将限制性内切酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型，而Ⅱ型限制性内切酶是重组DNA技术中常用的限制性内切酶，如Eco RⅠ、BamHⅠ等，它们被誉为分子生物学家的手术刀。

临床上某些遗传病由于基因突变发生在限制性内切酶切割位点，因此当用一定的限制性内切酶切割时，产生的酶切DNA片段大小就会与正常人酶切DNA片段发生差异，因而发生DNA限制性酶切图谱改变，据此可达到基因诊断的目的。

实验选用价格低廉、酶切效果较好的Eco RⅠ(识别位点G↓AATTC)对λDNA进行酶切分析，观察限制性内切酶的特定切割作用及其限制性图谱，理论上可产生21226bp，7421bp，5804bp，5604bp，4878bp和3530bp等不同分子量的DNA片段。

经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外扫描仪下摄影即可观察到λDNA的Eco RⅠ限制性酶切图谱。

【实验准备】一、器材1.恒温水浴箱2.电泳仪和电泳槽3.紫外扫描分析仪4.台式高速离心机5.微波炉6.加样枪、EP管及试管架等二、试剂1．DNA底物λDNA或质粒DNA或制备的肝组织DNA。

2．限制性内切酶Eco RⅠ及其缓冲液购自华美生物工程公司，每种限制性内切酶均配有2种缓冲液，在配套的缓冲液中该限制性内切酶均可获得100%酶切活性。

3．10×TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml，加蒸馏水至500ml。

酶切分析实验报告

一、实验目的1. 理解限制性核酸内切酶的原理及其在基因工程中的应用。

2. 掌握质粒DNA的提取方法。

3. 学习使用限制性核酸内切酶进行DNA片段的切割。

4. 通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，鉴定目的DNA片段。

二、实验原理限制性核酸内切酶（Restriction Endonucleases）是一类能够识别特定DNA序列并在该序列的特定位置切割双链DNA的酶。

在基因工程中，限制性核酸内切酶用于切割DNA分子，以便进行进一步的克隆、测序或分子标记等操作。

本实验中，我们使用限制性核酸内切酶切割质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。

根据酶切位点的不同，质粒DNA会被切割成不同长度的片段。

通过比较酶切前后的DNA片段，可以鉴定目的DNA片段。

三、实验材料1. 质粒DNA2. 限制性核酸内切酶3. 琼脂糖4. 电泳缓冲液5. 标准DNA分子量标记6. 琼脂糖凝胶电泳仪7. 凝胶成像系统四、实验步骤1. 质粒DNA提取：根据试剂盒说明书提取质粒DNA。

2. 酶切反应：将提取的质粒DNA与限制性核酸内切酶混合，加入缓冲液，进行酶切反应。

3. 琼脂糖凝胶电泳：- 准备琼脂糖凝胶，加入电泳缓冲液。

- 在凝胶孔中加入标准DNA分子量标记和酶切后的质粒DNA。

- 连接电源，进行电泳。

- 电泳完成后，关闭电源，取出凝胶。

4. 凝胶成像与分析：- 使用凝胶成像系统观察电泳结果。

- 根据标准DNA分子量标记，分析酶切产物的长度。

- 比较酶切前后的质粒DNA片段，鉴定目的DNA片段。

五、实验结果与分析1. 质粒DNA提取：成功提取出质粒DNA，通过紫外分光光度计检测，A260/A280比值在1.8-2.0之间。

2. 酶切反应：限制性核酸内切酶成功切割质粒DNA，产生不同长度的片段。

3. 琼脂糖凝胶电泳：- 电泳结果显示，酶切后的质粒DNA片段在凝胶上呈现清晰的条带。

- 通过比较标准DNA分子量标记和酶切产物，可以确定酶切位点的位置。

限制性核酸内切酶能不能切割RNA等问题

、Hinｄ。其中罗马数字应该用正体。
个字母都应该用斜体。
（2）若酶是从其中一种特殊菌株而来，还在基本名称后加上菌株名称符号。例如BamH，其中Ｈ为菌株编号，所以应该用正体。
如果限制与修饰体系在遗传上是由病毒或质粒引起的，则在缩写的寄主菌的种名后附加一个字母，表示此染色体外成分，例如EcoR
，其中Ｒ用正体。
二、限制性核酸内切酶在微生物中的作用
限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是提高自身的防御能力，限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA。
三、限制性核酸内切酶能不能切割RNA
目前为止，还没有资料说明有切割RNA的限制性核酸内切酶。在进化的角度去看，理由可能是只能切割稳定的DNA，RNA本身一般是单链结构不稳定，不需要进行切割防御。
疑难问题：限制性核酸内切酶的内容在教材过于简单，教材中只介绍了一种限制酶，在教学中学生会提出许多关于限制性核酸内切酶的疑难问题，以前解释过一些（见链接），现在再补充相关的问题。
限制性核酸内切酶是一种基因工程的工具酶，这类酶的最大功能特点有特异性，特异性体现序列和位点的切割。
一、为什么叫限制性核酸内切酶？
在做试题的过程中发现，限制性核酸内切酶的名称比较特殊，以下节选王永杰科学网博客，从中发现，在命制试题时书写也要规范。
第１个字母大写斜体，第２、３个字母小写斜体，第４个字母正体，后接正体的罗马数字。例如Taq、Hae、BamＨ等。
限制酶都来自各种细菌，细菌的命名依据《国际细菌命名法规》的规定，因此，限制酶的命名是依据细菌的命名方法进行的。
（3）若一种特殊的寄主菌株，具有几个不中发现此酶的先后次序。
例如：Hae 是从埃及嗜血杆菌（Haemophilus aegyptius）中提取的，并且是从中发现的第２个酶；流感嗜血菌

限制性内切酶酶切位点及保护碱基

寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。

其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。

在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

单位的寡实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260核苷酸。

取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。

反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl,25 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。

20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。

本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。

限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法

限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法，个人觉得总结得很好，特转贴供本供大家分享。

酶切现问题，看内切酶说明书，相应试剂公司目录。

不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，。

可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基，同尾酶、同裂酶1. 酶切不开或不完全1.1 质粒问题纯度差或残留酶切抑制物最为常见。

杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等；【重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂，1.2 酶的问题：确认内切酶有效 [很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。

确认酶切效果不好，做标记，更换] 。

【题外话：用内切酶注意】a. 内切酶如无特殊要求，保存-20~-30度。

并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油缓冲液中，温度过低时，酶会发生冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用干冰，酶会冻结，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择），如果是经常使用的话，酶会被反复冻融，从而降低了活性。

当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。

b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。

这点大家都清楚，不过多强调也没坏处。

因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，手不是抓着管子上端，而握在管子的底部，相当于用手在给酶进行加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。

偶尔一次没有大碍，反复如此，可能会影响酶活。

c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。

有时我们可以发现，即使是-20~-30度放置，酶仍然会冻结。

个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖子在较长时间的开着，甘油会吸取空气中的水分，对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。

限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶
目录
• 限制性核酸内切酶的概述 • 限制性核酸内切酶的分类 • 限制性核酸内切酶的工作原理 • 限制性核酸内切酶的应用 • 限制性核酸内切酶的未来发展
01
限制性核酸内切酶的概述
定义和特性
定义
限制性核酸内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。
在生物科学领域的应用
基因克隆和DNA重组技术
限制性核酸内切酶是基因克隆和DNA重组技术中的关键工具，用于切割和重组DNA 片段。
基因诊断和基因治疗
限制性核酸内切酶可用于检测和纠正基因突变，为基因诊断和基因治疗提供有效手段。
生物制药和生物技术
限制性核酸内切酶在生物制药和生物技术领域中用于生产重组蛋白、抗体和治疗性核酸等生物制品。
双活性酶
02
同时具有切割和磷酸酶活性，如BstAPI。
多活性酶
03
同时具有多种活性，如FokI同时具有切割、磷酸酶和甲基化酶
活性。
03
限制性核酸内切酶的工作原理
识别和切割DNA的过程
识别
限制性核酸内切酶能够识别特定的 DNA序列，通常是4-6个核苷酸组成的序列。
切割
在识别位点处，限制性核酸内切酶将 DNA链切开，形成两个断开的磷酸二酯键。
产生黏性末端
限制性核酸内切酶切割DNA后，通常产生具有突出末端的片段，也称为黏性末端。这种黏性末端可以用于DNA的连接和重组。
04
限制性核酸内切酶的应用
在基因工程中的应用
1 2 3
基因克隆
限制性核酸内切酶能够将DNA分子切割成特定序列的片段，为基因克隆提供精确的DNA片段。

限制性内切酶酶切注意事项

一、限制性内切酶酶切注意事项在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。

根据各种不同的条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题：1. 大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。

当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。

因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。

2. 浓缩的限制酶可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。

3. 反应体系中Mg2+是限制酶仅有的共同因子，当用其它二价阳离子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA时，酶活性会被抑制，或改变酶的特异性，导致星型反应。

4. 多种因素可引发星型反应：①非最适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶浓度大于25u/ug；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在(>12%)；⑥有机溶剂的存在。

5. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。

建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。

6. 酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。

7. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续反应；②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。

8. 用同一种酶切割不同的DNA时，所需酶量不同，可根据DNA底物上酶切位点的多少与λDNA 存在位点的数目比较后，决定用酶量。

实验三、限制性内切酶切割DNA

实验三、限制性内切酶切割DNA（4学时）实验目的1. 通过对DNA的酶切，学会设计构建体外重组DNA分子；2. 根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶；3. 掌握DNA的酶切技术。

实验原理限制性内切酶是从细菌中分离出来的一种能在特异位点切割DNA分子的核酸内切酶，目前已从多种细菌中分离出超过400种，识别各自不同的核苷酸顺序，这一顺序大多为具有一对称中心的回文序列，如从大肠杆菌中分离的 EcoR I识别：…GAATTC… 切割后产生…CTTAAG……G 和 AATTC…的末端，…CTTAA G…该末端由于有一段小的能互补配对的单链突出，故称为粘性末端。

切割后的末端为3’-OH和5’-磷酸基团。

即…G-OH…CTTAA-P。

有的限制性酶识别四碱基对的顺序，如 San3A识别 GATC ；有的识别六 CTAG碱基对，如上述的Eco R I。

识别四碱基对的内切酶由于识别顺序在DNA 出现的频率更高（四碱基酶为44=256，六碱基酶为46＝4096），因而可将DNA切割成更小的片段，而识别八碱基对的Not I …GCGGCCGC……CGCCGGCG… 则识别和切割位点更少（48＝65536），但碱基并不以均等的概率出现，因而切割后产生的片段变化范围很大。

限制性内切酶作用的温度一般为37℃，反应体系中以Mg2＋为唯一的辅助因子，且要求pH缓冲在7.5左右。

商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃贮存，活性通常较高，5u/μl（每单位即最适条件下1小时内完全酶解1μg DNA的酶量）。

实验材料待酶切的DNA样品实验仪器、器皿及试剂仪器：可调微量加样器、恒温水浴箱、电泳仪、电泳槽、紫外检测灯器皿：Eppendorf管、Tip、试管架试剂：1kb标准DNA分子量Bam HI、Kpn I限制性内切酶10×buffer：50mmol/l NaCl10mmol/l Tris-HCl(pH7.5)10mmol/l MgCl2lmmol/l DTT（二硫苏糖醇）实验步骤1．将DNA样品lμg溶解在16μl重蒸水中（在灭菌的Eppendorf管中进行）2．加入2μl 10×buffer，酶解buffer由厂家提供。

第2讲限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶
Restriction endonucleases
切割位点
识别位点处。
切开双链DNA。形成粘性末端（cohesine ends）或平齐末端（blunt ends）。如：
粘性末端（sticky ends，cohesine ends）含有几个核苷酸单链的末端。
分两种类型：
① 5’端凸出（如EcoR I切点）
由限制性物理图谱可获得如下信息：
①DNA大小； ②零点（环形图谱的起止点）； ③Ori； ④选择标记;
举例
常用的切割方法：单酶切、双酶切和部分酶切。
A
B
4kb
1.5kb 1kb 0.5kb
7kb 6kb 4.5kb 4kb 3kb 2.5kb 2kb 1.5kb 1kb 0.5kb
1kb 1.5kb 0.5kb 4kb
② 3’端凸出（如Pst I切点）1. 完全消化Fra bibliotek切割方式
内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。
1 23
4
12 3
4
2. 不完全消化 / 局部消化只有有限数量的酶切位点被切开。
1 23
4
1
4
通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。
DNA分子的限制性图谱（restriction mapping，RM）
A为完全酶切 B为部分酶切
限制性物理图谱即限制性内切核酸酶作图。简单地说就是DNA分子中限制性内切核酸酶切割位点的定位，即DNA分子中各种不同限制性内切核酸酶的酶切位点的线性排列图。
即标明限制酶在DNA分子上的限制性位点的数目、限制性片段大小及其线性排列的顺序。
RM的表现形式（3种）： ①环形（图） ②线条形（图） ③环行与线条形相结合（图）

cas9核酸内切酶对靶序列的切割位点

cas9核酸内切酶对靶序列的切割位点
Cas9核酸内切酶对靶序列的切割位点位于PAM（原间隔序列邻近基序）上游。

PAM是Cas9靶向DNA序列的一部分，对于Type II的CRISPR/Cas9系统，PAM通常为5'-NGG-3'。

切割发生在PAM上游原始间隔序列的第3和第4个核苷酸之间，产生平末端的DSB（双链断裂）。

这种切割是由Cas9核酸内切酶的两个结构域共同完成的：HNH核酸酶结构域切割与crRNA互补的DNA链，而RuvC-like结构域切割另一条非互补链。

因此，Cas9核酸内切酶通过识别PAM并切割其上游的特定位置，实现了对靶序列的精准编辑，这在基因敲除、敲入或点突变等应用中具有关键作用。

如需更多关于Cas9核酸内切酶的信息，建议查阅生物技术专业书籍或咨询相关专家。