质粒载体
质粒载体名词解释
质粒载体名词解释
质粒载体是分子生物学中非常重要的一种实验工具。
它们制造了一种由DNA链组成的小环状结构，这种结构可以被用来储存和传输遗传物质。
这类单个元件称为“质粒”，它们是一种可以携带遗传物质的载体，以便转移到其他生物体中。
质粒载体可以在生物体内或外部制备，最常见的质粒载体类型包括重组DNA质粒、脱氧核糖核酸质粒和反转录质粒。
重组DNA质粒可以携带大量的DNA，是植物转基因的常用载体。
脱氧核糖核酸质粒和反转录质粒则可以把复杂的基因表达转换成活性的蛋白质，在细胞分裂、凋亡等过程中扮演重要角色。
质粒载体一般由三个部分组成：表达载体、质粒引物和抗性基因。
表达载体是携带转录组分子的大分子，质粒引物用来引导特定的DNA 片段，而抗性基因是防止质粒中的DNA被非特异性酶切的基因。
质粒载体的应用非常广泛，它们可以用来传输特定的DNA片段，影响基因表达，从而改变植物的外观、抵抗传染病等。
此外，质粒载体也可以用来制备特异性的抗原，用于诊断和治疗许多疾病，其中包括癌症、HIV等。
由于质粒载体的巨大潜力，现在全球科学家正在努力开发出更好的质粒载体，以帮助实现从植物转基因到药物新研发的宏伟目标。
通过不断改进分子技术，期望借助质粒载体能够研发出更多有效的药物和抗疾病的新型疫苗，从而提高人类的健康水平。
总之，质粒载体是一种重要的分子生物学实验工具，它可以携带
遗传物质并转移到其他生物体中，这样就能够产生新的基因表达，从而改变植物的外观和抵抗力。
由于质粒载体的多种功能，它已经成为实现植物转基因和新药研发的核心技术，未来仍将继续发挥重要作用。
第四章 基因工程的质粒载体
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
质粒载体种类
质粒载体种类
质粒载体是在基因工程中经常使用的一种工具，常见的质粒载体种类包括：
1. Shuttle质粒载体：能够在多个宿主生物中复制的质粒载体，通常用于在不同宿主中进行基因表达或基因转导的研究。
2. 表达质粒载体：用于将特定基因的DNA序列插入到质粒载
体中进行表达的载体，通常包括启动子、转录终止子和选择标记基因等。
3. 空质粒载体：通常只包含质粒的骨架结构，没有包含具体的基因，常用作对照实验的负对照。
4. 感受态质粒载体：这种质粒载体可与RNA或DNA片段融合，形成DNA-RNA复合体，通常用于RNA干扰实验。
5. 水平转移质粒载体：这种质粒载体能够在细菌中进行一种称为水平转移的传递，用于研究基因在不同细菌中的传播。
6. 呈味性质粒载体：这种质粒载体能够在菌落中形成代谢产物，在实验室中常用于菌落筛选。
以上是一些常见的质粒载体种类，不同种类的质粒载体在基因工程中扮演不同的角色，被用于不同的研究目的。
三、质粒与载体
1.1 质粒的分子结构
通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；
也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒； 疏螺旋体、链霉菌和酵母菌
1.2 质粒的检测
提取所有胞内DNA后电镜观察；
超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察； 通常用碱裂解法提取质粒
1.3 质粒的命名
第1个字母(小写)： p， 质粒（plasmid）; 第2，文缩写; 编号（阿拉伯数字） ：区别同一类型的不同质粒 例： pUC18, pUC19
将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNA分子上并引 入原核细胞后,该重组DNA具有自主复制能力。
pBR322是最早人工构建的质粒载体。通过将下面几部分不同
来源的DNA片段连接起来而构成的环状质粒：
•来源于ColE1的衍生质粒pMB1 的DNA复制起点(ori) 及rop区；
•来源于质粒pSC101的四环素抗性基因(tetr)；
1.4 质粒的主要类型 质粒与宿主的关系：
质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的； 在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的
机能，从而使宿主得到生长优势。
（ P202）
质粒的主要类型
致育因子(Fertility factor，F因子)
质粒所编码 的功能和赋 予宿主的表 型效应 抗性因子(Resistance factor，R因子)
RNA Polymerase RNAII starts at -555 on H strand
- 555 RNAII
-445 - 555
Transcription beyond oriV Hybridisation at/near oriV
3’
-445 - 555
质粒载体
质粒载体简介质粒在所有的细菌类群中都可发现，它们是独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。
自然界中，质粒是在营养充足时出现的，它在结构、大小、复制方式，每个细菌的拷贝数，在不同的细菌体内的繁殖力，在菌种之间的转移力等方面都会变化，可能最重要的是质粒所携带的特征的改变。
大多数原核生物的质粒是双链环状的DNA分子；但是无论是在革兰式阳性还是阴性菌体内都可以发现线状质粒。
质粒大小变化很大，可从几个到数百个kb。
质粒依靠宿主细胞提供的蛋白质进行复制，但也可以使宿主细胞获得质粒编码的功能。
质粒复制可以与细菌的细胞周期同步，导致菌体内质粒的拷贝数较低，质粒复制也可独立于细胞周期，使每个菌体内扩增了成百上千个质粒拷贝。
一些质粒在菌种间可自由地转移它们的DNA分子，另一些只转移质粒给同种细菌，而有些却根本不转移它们的DNA。
质粒带有具有许多功能的基因，这些功能包括对抗生素和重金属道德抗性、对诱变原的敏感性、对噬菌体的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和毒素、决定毒力、降解复杂有机分子，以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。
人工构建的质粒载体分类高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。
适合大量增殖克隆基因，或需要大量表达的基因产物。
低拷贝数的质粒载体由pSC101派生来的载体特点是分子量小的拷贝数。
它有特殊的用途：当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌的死亡时，就需要低拷贝的载体。
失控的质粒载体这是一类温度敏感型复制控制质粒。
如pBEU1、pBEU2。
插入失活型克隆载体。
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。
如pDF41、pDF42。
正选择的质粒载体直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。
质粒载体的筛选特征选择质粒载体的要素是要了解可用到的载体的特征和预测重组克隆所用于的实验。
所有的质粒载体都有三个共同的特征：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点。
质粒载体的知识点
质粒载体的知识点1. 什么是质粒载体？质粒载体是一种常见的DNA分子，在分子生物学研究中广泛应用。
它是一种环状的DNA分子，具有自主复制和传递的能力，能够携带外源DNA序列并在细胞内进行复制和表达。
2. 质粒载体的特点质粒载体具有以下几个特点：•自主复制能力：质粒载体可以独立于宿主细胞的染色体进行复制，从而实现外源DNA的复制。
•传递能力：质粒载体可以在细菌、酵母等微生物细胞中传递，从而实现外源DNA的表达。
•多样性：质粒载体种类繁多，可以根据实验需要选择不同的质粒载体来进行研究。
•多拷贝数：质粒载体通常具有多个拷贝数，使得外源DNA在细胞中得到高效复制和表达。
3. 质粒载体的结构质粒载体通常由以下几个部分组成：•起始子：负责启动质粒载体的复制过程。
•多个限制酶切位点：用于将外源DNA序列插入到质粒载体中。
•选择标记：帮助筛选携带质粒载体的细胞，例如抗生素抗性基因。
•表达元件：包括启动子、终止子和转录调控序列，用于控制外源DNA的表达水平。
4. 质粒载体的应用质粒载体在分子生物学研究中有广泛的应用，包括：•基因克隆：质粒载体可以用于将外源DNA序列引入到细胞中，从而克隆目标基因。
•基因表达：质粒载体可以用于外源基因的表达，从而研究其功能和调控机制。
•基因敲除：质粒载体可以用于引入RNA干扰或基因敲除工具，从而研究基因的功能。
•疫苗研究：质粒载体可以用于构建疫苗候选物，进行疫苗研究和疫苗开发。
5. 质粒载体构建的步骤质粒载体的构建通常包括以下步骤：1.选择质粒载体：根据实验需求选择合适的质粒载体，包括质粒大小、拷贝数和选择标记等因素。
2.线性化质粒载体：使用适当的限制酶切酶将质粒载体线性化，以便后续插入外源DNA序列。
3.插入外源DNA：将目标DNA序列与线性化质粒载体连接，并使用DNA连接酶进行连接反应。
4.转化宿主细胞：将质粒载体导入宿主细胞中，可以使用化学方法或电穿孔等技术实现质粒转化。
5.筛选正品系：根据质粒载体携带的选择标记进行筛选，例如使用抗生素选择培养基筛选带有抗生素抗性的细胞。
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程是一种用于改变和改造生物体遗传基因的技术，它是利用分子生物学技术提高生物性状的一种新技术。
在基因工程中，需要使用一种材料将外源基因投入细胞中，这种材料就是载体。
基因工程中常用的载体有以下三种：
1. 质粒载体. 质粒载体是一种比较常见的基因工程载体，具有较强的稳定性，它是一种质粒DNA，也称为质粒DNA，不是单链DNA，它是由细菌质粒的DNA结合其它分子，形成质粒DNA的结构，具有可复制性能，可以在细菌或动物细胞中复制，具有较强的稳定性。
2. 杆状病毒载体. 杆状病毒载体是一种比较常见的基因工程载体，它由病毒的全基因组和其它分子形成，用来转移外源基因到细胞中，可以把外源基因转移到细胞核或任何其它的地方，可以实现基因工程的目的。
3. 化合物载体. 化合物载体是一种新型的载体，它是由多种不同的分子组成的，可以将外源基因转移到细胞核或其它位置，并且可以把这些基因在细胞中表达出来，从而实现基因工程的目的。
质粒载体的特点及应用
质粒载体的特点及应用质粒载体是一种用于携带和传递特定基因的分子。
它的主要特点有多个拷贝数、相对较小的大小、可自复制和稳定传递等。
下面将详细介绍质粒载体的特点及其应用。
一、质粒载体的特点1.多个拷贝数：质粒载体通常可以在目标细胞中形成多个拷贝，从而提高目标基因的表达水平。
这对于研究基因功能和大规模蛋白产量等应用非常重要。
2.相对较小的大小：质粒载体通常比细菌基因组小得多，方便通过细菌转化技术导入目标细胞。
同时，小的质粒载体也更容易被提取和纯化。
3.可自复制：质粒载体可以通过细胞的复制机制自主复制。
这意味着目标基因可以在转化后传递给后代细胞，并稳定存在。
4.稳定传递：质粒载体的自复制保证了基因的稳定性和可遗传性。
它可以长期存在于细胞中，从而实现长期的基因表达。
5.多样性：质粒载体具有很高的多样性，可以根据不同的研究需求选择合适的载体。
常见的质粒载体包括pUC、pBR322等。
二、质粒载体的应用1.基因克隆：质粒载体是进行基因克隆的重要工具。
通过将目标基因插入到质粒载体的多克隆位点上，可以实现目标基因的扩增和筛选。
2.基因表达：质粒载体可以用于外源基因的表达。
将目标基因插入到适当的表达载体中，可以实现目标基因的高效表达，并获得目标蛋白。
3.分子标记：质粒载体可以用来标记目标分子。
通过在质粒载体上引入荧光蛋白等标记基因，可以实现目标分子的可视化和追踪。
4.基因敲除：质粒载体可以用来进行基因敲除实验。
通过在质粒载体上插入特定的引物或RNA干扰序列，可以干扰目标基因的表达，从而研究其功能和调控机制。
5.基因治疗：质粒载体可以用来进行基因治疗研究。
将具有治疗效果的基因插入到质粒载体中，可在体内或体外进行基因传递实验，通过调控基因的表达来治疗疾病。
6.基因工程：质粒载体可以用来进行基因工程研究。
通过对载体进行改造和优化，可以实现目标基因的高效表达和产量提高。
总结：质粒载体具有多个拷贝数、相对较小的大小、可自复制和稳定传递等特点，是基因工程研究中常用的工具。
第三章质粒载体
质粒DNA拷贝数的控制
高拷贝质粒DNA复制的启动，是由质粒编码基因合成的 功能蛋白质调节的，与寄主细胞周期开始时合成的不稳 定的复制起始蛋白质无关。
低拷贝质粒的复制是受寄主细胞不稳定的蛋白质控制的， 并与寄主细胞染色体同步进行。
用蛋白质合成抑止剂氯霉素或壮观霉素处理寄主细胞， 使染色体DNA复制受阻的情况下，松弛的质粒仍可继续 扩增。而严紧型质粒则不行。
4、质粒DAN的复制类型
严紧型质粒：每个寄主细胞仅含有1－3份的拷贝，称 “严紧型”复制控制的质粒。
松驰型质粒：每个寄主细胞中可高达10－60份的拷贝， 称“松弛型”复制控制的质粒。
质粒拷贝数：每个细菌染色体平均具有的质粒DNA 分子的数目。 质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并非绝对，它不仅受 自身的制约，还受寄主的控制。
6、质粒的其他特性
稳定性：维持一定的拷贝数 同源性：不同的质粒有相同的同源区 重组性：质粒间、质粒同染色体间重组 消除和恢复性等特性
第二节 质粒DNA的分离与纯化
➢ 氯化铯密度梯度离心法 ➢ 碱变性法 ➢ 微量碱变性法 ➢ 影响质粒DNA产量的因素
(1)寄主菌株的遗传背景 (2)质粒的拷贝数及分子大小
大肠杆菌质粒分子的结构示意图
2、质粒DNA分子的三种构型
SC构型: 是指两条多核苷酸链均保持着完整的环形 结构时，称为共价闭合环形DNA(cccDNA)，即超螺 旋的 SC构型。 OC构型: 两条多核苷酸链中只有一天保持完整的环 形结构，另一条出现一至数个缺口时，称开环DNA
(ocDNA)，即OC构型； L构型: 质粒DNA经酶切，发生双链断裂而形成线 性分子(LDNA)，L构型。（见图）
分离纯化质粒DNA的程序
3、微量碱变性法提取质粒DNA步骤
2.1_基因工程载体-质粒载体_201209
死
抗菌素
活
b.蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验）
乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖
乳糖类似物异丙基-β-D -硫代半乳糖苷 （IPTG） 有更强的诱导作用。 IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。
LacZ基因编码的乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物
-半乳糖苷酶Xgal显色反应： -半乳糖苷酶能把无色的化合物 Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的 物质5-溴-4-氯靛蓝。 Xgal 半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
– 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R的其它成员
• 值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在 接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移， 这个过程由 bom 和mob 基因决定
（ 5）质粒DNA的构型：
SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（ocDNA） L 型 线性DNA（cDNA）
根据宿主细胞所含的拷贝数多少， 可将质粒分成：
• 严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细 胞中仅含有1-2份的拷贝，称这类 质粒为“严紧型”复制控制的质 粒(stringent plasmid)； 高拷贝数的质粒，每个宿主细 胞中可高达10-200份拷贝，这类 质粒被称为“松弛型”复制控制 的质粒(relaxed plasmid)。
• 松弛型
（4）可转移性
在天然条件下，大多质粒可通过 细菌接合作用从一种宿主细胞内转移 到另外一种宿主内。
大肠杆菌接合（conjunction）
如：F质粒（性质粒、或F因子）
质粒迁移
• 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
– 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等
质粒载体种类
质粒载体种类质粒载体是分子生物学实验中常用的工具，用于在细胞中携带外源DNA序列，并实现其在细胞内的复制和表达。
根据其结构和功能的不同，质粒载体可以分为多种类型。
本文将介绍常见的几种质粒载体及其特点。
一、表达质粒载体表达质粒载体是常用的质粒载体类型之一，用于外源基因的表达。
其中，pUC18是常用的表达质粒载体，其大小为2686bp，含有多个重要的功能元件。
例如，pUC18包含了抗生素耐受基因，如AmpR基因，使得细菌能够在含有抗生素的培养基上生长。
此外，pUC18还包含了启动子、终止子和复制起始位点等重要序列，能够实现外源基因在细菌中的高效表达。
二、克隆质粒载体克隆质粒载体是用于基因克隆的质粒载体类型。
pBluescript II KS+是常用的克隆质粒载体，其大小为2960bp。
pBluescript II KS+含有多个克隆位点，如多克隆位点（MCS），能够方便地进行DNA片段的插入和克隆。
此外，pBluescript II KS+还包含了T7和T3启动子，使得插入的DNA片段能够通过转录和转录后修饰的方式进行进一步研究。
三、RNA干扰质粒载体RNA干扰质粒载体是用于RNA干扰实验的质粒载体类型。
pSUPER是常用的RNA干扰质粒载体，其大小为3144bp。
pSUPER含有特定的siRNA序列，能够通过RNA干扰技术抑制特定基因的表达。
此外，pSUPER还包含了启动子和选择性标记基因，使得转染细胞后能够通过选择性培养基筛选出抑制特定基因表达的细胞株。
四、双杂交质粒载体双杂交质粒载体是用于蛋白质相互作用研究的质粒载体类型。
pGBKT7和pGADT7是常用的双杂交质粒载体，分别用于检测靶蛋白的DNA结合活性和激活活性。
pGBKT7和pGADT7含有启动子、选择性标记基因和多克隆位点等重要元件，能够实现蛋白质相互作用的检测和分析。
五、表面显示质粒载体表面显示质粒载体是用于细胞表面展示外源蛋白的质粒载体类型。
质粒载体种类
质粒载体种类质粒载体是在基因工程和分子生物学研究中广泛应用的一种工具，它可以用来携带和传递外源基因。
根据其特性和功能的不同，质粒载体可以分为多种类型，下面将介绍几种常见的质粒载体。
1. 表达质粒载体表达质粒载体是用于表达外源基因的载体。
它通常包含一个启动子、一个编码区和一个终止子。
启动子可以使外源基因在宿主细胞内得到转录和翻译，编码区则包含了外源基因的编码序列，终止子用于终止翻译过程。
常用的表达质粒载体包括pUC19、pET28a等。
这些载体具有高拷贝数和广谱宿主范围的特点，适用于大多数细菌和酵母的表达。
2. 克隆质粒载体克隆质粒载体用于将外源DNA片段克隆到质粒中。
它通常包含一个多克隆位点，用于插入外源DNA片段，以及一些选择标记，如抗生素抗性基因。
常见的克隆质粒载体有pGEM-T、pBluescript 等。
这些载体具有较高的拷贝数和较大的插入容量，适用于DNA 片段的克隆和扩增。
3. RNAi质粒载体RNAi质粒载体用于介导RNA干扰（RNA interference）。
它通常包含一个RNAi导体，其中包含外源基因的靶向序列，以及一个RNAi表达序列。
外源基因的靶向序列可以与目标基因的mRNA相互配对，从而介导其降解或抑制其翻译。
常见的RNAi质粒载体有pSUPER、pLKO等。
这些载体具有较高的RNAi效率和较强的基因沉默能力，适用于基因功能研究和基因治疗。
4. 荧光蛋白质粒载体荧光蛋白质粒载体用于表达荧光蛋白基因，常用于研究基因的表达和定位。
它通常包含一个荧光蛋白基因，如绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（RFP），以及一个启动子和终止子。
外源基因的表达可以使细胞或生物发出荧光信号，从而实现基因的可视化。
常见的荧光蛋白质粒载体有pEGFP、pRSET等。
这些载体具有较高的表达效率和较强的荧光信号，适用于细胞标记和蛋白定位等研究。
5. 敲入质粒载体敲入质粒载体用于将外源DNA片段整合到宿主基因组中。
质粒和载体的关系
质粒和载体的关系
质粒是指在细胞质内具有自主复制能力的一类DNA分子，通常被用作基因克隆和基因表达等生物学实验中的载体。
载体是指能够携带外源DNA并进行转移、复制和表达的一类生物分子，其中质粒是最常用的一种载体。
质粒和载体的关系可以通过以下几点来说明：
1. 质粒是载体的一种形式。
质粒作为一种能够独立复制的DNA 分子，可以携带外源DNA序列，并被用作基因工程和遗传学实验中的载体。
在细胞内，质粒可以复制自身，同时也可以复制携带的外源DNA序列，从而实现基因表达等功能。
2. 载体可以是多种类型的分子。
除了质粒以外，还有病毒、贝壳蛋白、脂质体等分子可以作为载体。
不同类型的载体具有不同的特点和应用范围，但质粒作为一种常用的载体，因其构建简单、易于操作等特点，被广泛应用于生物学实验。
3. 质粒和载体的选择取决于实验需求。
在进行基因克隆和基因表达等实验中，研究人员需要根据实验所需的外源DNA序列大小、表达强度、转染效率等因素，选择适用的质粒载体。
同时，还需要考虑质粒在目标细胞中的稳定性、毒性等因素，以确保实验结果的准确性和可重复性。
综上所述，质粒是载体的一种形式，作为常用的载体之一，广泛应用于生物学实验中。
质粒和载体的选择应根据实验需求进行，以确保实验结果的准确性和可重复性。
质粒载体的概况及构建
特性
稳定性
质粒载体可以在宿主细胞内稳 定存在，不易丢失或发生突变
。
可复制性
质粒载体可以在宿主细胞内自 主复制，扩增DNA分子。
可选择性
质粒载体通常携带抗性基因， 可以通过抗生素筛选和富集。
可修饰性
质粒载体可以通过限制性酶切 和连接等分子生物学技术进行
修饰和改造。
质粒载体的应用领域
克隆技术
质粒载体是基因克隆和DN择
天然质粒载体
01
存在于生物体内的天然质粒，具有自我复制能力，可在宿主 细胞内稳定存在。
02
天然质粒通常具有抗生素抗性基因，可作为筛选标记基因。
03
天然质粒载体的复制能力有限，拷贝数较低，且容易丢失。
人工构建的质粒载体
通过基因工程技术人工构建的质粒载体，具有特 定的复制起始位点和筛选标记基因。
转化与筛选
转化
将连接产物导入受体细胞中，常用的受体细胞有细菌、酵母、动物细胞等。
筛选
通过抗性筛选、PCR鉴定等方法对转化子进行筛选，获得阳性克隆。
04
质粒载体的改造与
优化
启动子的优化
选择合适的启动子
启动子突变
根据基因的表达需求，选择合适的启 动子，如强启动子、弱启动子等。
通过突变启动子序列，改变其转录活 性，以实现基因表达的调控。
功能元件
选择含有合适功能元件的质粒载体，如启动 子、多克隆位点等，以满足实验需求。
稳定性
选择稳定性好、不易丢失的质粒载体，以确 保目的基因在宿主细胞内的稳定表达。
03
质粒载体的构建过
程
目的基因的获取与鉴的基因。
目的基因的鉴定
通过测序、限制性酶切、PCR扩 增等手段对目的基因进行鉴定， 确保其准确性。
质粒载体_精品文档
质粒载体引言质粒载体在基因工程和分子生物学研究中被广泛应用。
它们是由人工合成的DNA片段构建而成，可用于在细胞中传递、复制和表达外源基因。
质粒载体的研究为基因治疗、基因工程和生物技术的发展提供了重要的支撑。
本文将介绍质粒载体的定义、特点、常见类型以及其在科研和应用领域中的应用。
一、质粒载体的定义和特点质粒载体是一种可自主复制的环状DNA分子，它具有许多特点使其成为优秀的基因工程工具。
首先，质粒载体具有较高的稳定性，可以在宿主细胞中长时间保存。
其次，质粒载体可以携带较大的外源DNA片段，为基因操纵提供了更大的灵活性。
此外，质粒载体还具有选择标记，方便筛选和鉴定已转化的细胞。
二、常见类型的质粒载体目前，有许多种类的质粒载体可供科研人员选择使用。
其中包括表达质粒、克隆质粒、慢病毒质粒等。
表达质粒是最常见的一种质粒载体，用于在宿主细胞中表达外源基因。
克隆质粒则是用于合成、扩增和克隆基因或DNA片段。
慢病毒质粒是一种特殊类型的质粒载体，可用于稳定地传递外源基因到宿主细胞中。
三、质粒载体在科研中的应用质粒载体在科学研究中起着重要的作用。
首先，通过将外源基因插入质粒载体中，科研人员可以进行基因的合成、修饰和复制。
其次，质粒载体也被广泛用于表达外源基因以进行蛋白质的表达和功能研究。
此外，质粒载体还可以用于构建基因库、进行基因的定向突变以及筛选重组细胞等。
四、质粒载体在应用领域中的应用除了在科研中的应用，质粒载体还在许多应用领域中发挥着重要的作用。
在农业领域，质粒载体被用于转基因作物的研发，以提高作物的产量和抗病能力。
在医学领域，质粒载体则广泛应用于基因治疗和基因疫苗的研究，用于治疗多种疾病和预防感染性疾病的发生。
此外，质粒载体还可以用于工业发酵和环境修复等领域。
结论质粒载体作为一种强大的基因工程工具，在科研和应用领域中发挥着重要的作用。
通过插入外源基因到质粒载体中，我们可以实现基因的合成、表达和修饰。
质粒载体在农业、医学、工业和环境等领域都有广泛的应用，为许多领域的研究和发展提供了重要的支持。
所有质粒载体汇总
所有质粒载体汇总质粒载体是用于携带和复制DNA分子的小圆环DNA分子，在基因工程和分子生物学研究中扮演着重要的角色。
质粒载体的选择取决于不同的实验需要以及目标基因的特性。
下面是一些常用的质粒载体的简要概述。
1.pUC19：pUC19是一种常用的高拷贝质粒载体，在能源代谢和抗性等方面具有一些基本功能。
它含有多个限制性内切酶切位点，可以方便的进行基因克隆和插入。
2.pBR322：pBR322是最早的质粒载体之一，也是最常用的选择性质粒载体。
它具有多个抗性基因和多个限制性内切酶切位点，可以方便的进行限制性内切酶切和基因插入。
3. pET28a：pET28a是一种常用的诱导表达质粒载体。
它具有T7启动子和强力的胼胝体定位肽（His-tag），可以用于原核表达大量目标蛋白。
6. pcDNA3.1：pcDNA3.1是一种常用的真核表达质粒载体，可以在哺乳动物细胞中稳定表达目标基因。
它具有CMV启动子和多个选择性标记。
7.pAVEX系列：pAVEX系列是一组常用的双杂交质粒载体。
这些载体可以用于植物或哺乳动物细胞中检测蛋白相互作用。
8.pBI121：pBI121是一种常用的植物转化质粒载体。
它具有多个选择性标记和启动子，可以将目标基因导入植物细胞中进行稳定表达。
9.pCAMBIA1300：pCAMBIA1300是另一种常用的植物转化质粒载体。
它具有多个选择性和表达标记，以及多个启动子和启动子缺陷。
10.pHSE系列：pHSE系列是一组常用的高效表达质粒载体。
这些载体具有强力的启动子和增强子，可以用于高效表达目标基因。
这些只是众多质粒载体中的几个典型例子，根据不同实验需求和目标基因特性，科研人员可以选择适合自己实验的质粒载体。
质粒载体的设计和构建在基因工程研究和生物技术应用中起着至关重要的作用，不断的优化和改进将进一步拓宽其应用范围。
质粒载体介绍(质粒基本特性和种类及标记基因)
质粒载体介绍（质粒基本特性和种类及标记基因）2010-01-25 13:25:29 来源：易生物实验浏览次数：6084 网友评论 0 条一、质粒的基本特性二、标记基因三、质粒载体的种类关键词：质粒载体质粒载体标记基因一、质粒的基本特性1．质粒的复制通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。
在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和θ复制。
在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。
图3-1 是其复制其始示意图。
在复制时，首先合成前 RNAⅡ，即前引物，并与 DNA 形成杂交体；而后RNase H 切割前 RNAⅡ，使之成为成熟的 RNAⅡ，并形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。
形成的 RNAⅠ可控制 RNAⅡ形成二级结构，同时Rop 增强 RNAⅠ的作用，从而控制质粒的拷贝数。
削弱 RNAⅠ和 RNAⅡ之间相互作用的突变，将增加带有 pMB1 或（ColE1）复制子的拷贝数。
图 3-1 带 pMB1（或 ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。
2．质粒的拷贝数质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。
严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。
表 5-1 就是不同类的质粒与复制子及拷贝数的大致关系。
表 3-1 ：质粒载体及其拷贝数质粒 复制子 拷贝数pBR322 及其衍生质粒 pMB1 15～20pUC 系列质粒及其衍生质突变的 pMB1 500～700粒pACYC 及其衍生质粒 p15A 10～212pSC101 及其衍生质粒 pSC101 ～5ColE1 ColE1 15～20pUC 系列质粒的复制单位来自质粒 pMB1 ，但其拷贝数较高。
pMB1 质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA 聚合酶Ⅰ，DNA 聚合酶Ⅲ），依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶，以及宿主基因dnaB 、 dnaC 、 dnaD 和danZ 的产物。
质粒载体介绍
质粒载体介绍（质粒基本特性和种类及标记基因）一、质粒的基本特性1．质粒的复制通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。
在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和θ 复制。
在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1 质粒或ColE1 质粒的复制起始位点。
图3-1 是其复制其始示意图。
在复制时，首先合成前RNAⅡ，即前引物，并与DNA 形成杂交体；而后RNase H 切割前RNAⅡ，使之成为成熟的RNAⅡ，并形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。
形成的RNAⅠ可控制RNAⅡ形成二级结构，同时Rop 增强RNAⅠ的作用，从而控制质粒的拷贝数。
削弱RNAⅠ和RNAⅡ之间相互作用的突变，将增加带有pMB1 或（ColE1）复制子的拷贝数。
图3-1 带pMB1（或ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。
2．质粒的拷贝数质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。
严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。
表5-1 就是不同类的质粒与复制子及拷贝数的大致关系。
表3-1：质粒载体及其拷贝数pUC 系列质粒的复制单位来自质粒pMB1 ，但其拷贝数较高。
pMB1 质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提续复制，最后每个细胞中可积聚2～3 千个质粒。
3．质粒的不相容性两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。
两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。
而不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。
质粒载体种类
质粒载体种类1. 背景介绍质粒是细菌或酵母等微生物细胞内存在的一种环状双链DNA分子，可以在细菌或酵母等微生物细胞中独立复制和传递。
质粒载体是一种用于携带、复制和传递外源DNA片段的DNA分子，常用于基因工程研究和生物技术应用中。
质粒载体种类繁多，每种质粒载体都有其特定的优点和应用范围。
2. 常见质粒载体种类2.1. pUC系列质粒载体pUC系列质粒载体是最早应用于基因工程的质粒载体之一，具有小分子量、高复制数和便于操作的特点。
pUC系列质粒载体通常包含选择标记基因，如抗生素抗性基因，用于筛选具有该质粒的细菌。
此外，pUC系列质粒载体还包含多个限制酶切位点，方便插入外源DNA片段。
2.2. pBR322质粒载体pBR322是一种广泛应用的质粒载体，具有多个限制酶切位点和选择标记基因。
pBR322质粒载体可用于大片段DNA的克隆和表达，适用于分子克隆和基因工程研究。
2.3. pGEM系列质粒载体pGEM系列质粒载体是一类常用于克隆和表达基因的质粒载体。
这些质粒载体包含选择标记基因和多个限制酶切位点，可用于插入外源DNA片段，并在宿主细胞中高效表达。
2.4. pET系列质粒载体pET系列质粒载体是一类专门用于大规模表达蛋白质的质粒载体。
这些质粒载体包含强启动子和选择标记基因，能够在宿主细胞中高效表达外源蛋白质，并具有易于纯化的特点。
2.5. Yeast系列质粒载体Yeast系列质粒载体是一类用于酵母表达系统的质粒载体。
这些质粒载体可以被酵母细胞高效复制和传递，用于酵母基因工程研究和蛋白质表达。
2.6. Gateway质粒载体Gateway质粒载体是一类基于Gateway技术的质粒载体。
Gateway技术是一种高效的DNA片段克隆技术，可以快速、准确地将外源DNA片段插入到Gateway质粒载体中。
Gateway质粒载体适用于高通量基因克隆和表达研究。
3. 质粒载体的应用质粒载体在基因工程和生物技术研究中具有广泛的应用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一、一个合格质粒的组成要素a复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
b 抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+c 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段d P/E 启动子/增强子e Terms 终止信号f 加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号a 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
b增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。
其作用与增强子所在的位置或方向无关。
即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。
/沉默子－负增强子，负调控序列。
c核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体d 转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA 的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream 有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上.三、介绍一下关于载体的知识（虽然课本上都有写）1. 什么是载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。
P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA2. 载体的分类―――按功能分成：（1）克隆载体都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。
它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。
（所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严谨行载体）（2）表达载体具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA 顺序的载体。
―――按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）.3. 基因工程载体的3个特点：（一）都能独立自主的复制：载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。
（二）都能便利的加以检测：如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。
（三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。
4. 载体的选择和制备：选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意3点：①选择合适的启动子及相应的受体菌；②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。
选用质粒（最常用）做载体的4点要求：①选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。
P.S. 穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两类细胞中都能扩增第四节质粒载体的构建及类型一.天然质粒用作隆载体的局限性天然质粒,一般是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。
在大肠杆菌中，常见的要用于基因克隆的天然质粒有ColE1RSF2124和pSC101等。
鉴于于然质粒用作基因克隆载体存在着不同程度的局限性，科学工作者便在其基础上进行了修饰改造，首先发展出了一批低分子量、高拷贝、多选择记号的质粒载体。
二．质粒载体必须具备的基本条件现行通用的基因克隆载体，绝大多数就是以质粒为基础改建而成的。
一般说来，一种理想的用作克隆载体的质粒必须满足如下几个方面的条件：(i)具有复制起点 (ii)具有抗菌素抗生基因（iii）具若干限制酶单一识别位点（iv）具有较小的分子量和较高的拷贝数三．质粒载体的选择记号在基因克隆中采用的质粒载体的选择记号，包括有新陈代谢特性、对大肠杆菌素E1的免疫性，以及抗菌素抗性等多种。
但绝大多灵敏的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号。
基因克隆实验中常用的几种抗菌素的作用方式及其抗性机理列于表4-4。
四．不同类型的质粒载体（1）高拷贝数的质粒载体适于分离大量的高纯度的克隆基因的DNA片段。
如ColE1、pMB1或它们的派生质粒。
它们不仅具有低分子量、高拷贝数的优点，而且在没有蛋白质合成的条件下仍能继续复制。
因此，若在处于对数生长晚期的含有ColE1一类质粒的大肠杆菌培养物中，加入适量的蛋白质合成抑制剂讲如氯霉素或壮观霉素处理之后，每个细胞中的质粒拷贝数则可扩增到1000～3000个之多。
如果加入高浓度的尿核苷，质粒DNA又可进一步扩增2～3倍。
（2）低拷贝数的质粒载体适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的DNA。
例如，pLG338、pLG339及pHSG415。
这类质粒载体的一个普遍性问题是，由于它们体积小、拷贝数低，与此相应的基因剂量也就较少，因此要制备大量的克隆DNA就很困难。
（3）失控的质粒载体失控的质粒载体（runaway plasmid vectors）：是一些低拷贝的质粒，其复制控制是温度敏感型的，也就是说在不同的温度下，拷贝数会有显著的变化。
B.E.Uhlin等人（1979）首先发展了失控的质粒载体pBEU1和Pbeu2。
这种质粒载体在30℃下，每个寄主细胞中只含有适量的拷贝数，而当培养温度超过35℃时，质粒的复制便失去了控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。
在这种高温环境下，细胞的生长蛋白质的合成可按正常的速率持续2～3小时。
这期间编码在质粒载体上的基因产物便超过了常量。
最后，细胞生长受到了抑制，并失去了存活的能力，但在这个阶段质粒DNA可累积到占细胞总DNA的50%。
（4）插入失活型的质粒载体选用插入失活型质粒，将外源DNA片段插入在会导致选择记号基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度地提高获得阳性克隆的几率。
除了pDF471和Pdf42之外，都具有基因插入失活的克隆位点，因此都属于插入失活型的质粒载体。
（5）正选择的质粒载体正选择质粒载体（direct selection vectors）：这种质粒载体具有具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。
通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻了实验的工作量，提高了选择的敏感性。
（6）表达型的质粒载体使克隆在大肠杆菌中特定位点的外源真核基因的编码序列置于大肠杆菌的转录-转译信号控制之下，并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体（expression vectors）。
它分为表达型质粒载体和表达型噬菌体载体两种不同的类型。
一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体（图4-11）的主要组成部分，包括大肠杆菌的启动子及操纵全点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。