浅论一种新型速效人胰岛素类似物的构建、制备及性质研究

浅论一种新型速效人胰岛素类似物的构建、制备及性质研究【摘要】目的：构建和制备出一种新型速效人胰岛素类似物(PIns),进行其性质研究。

方法：采用加端PCR的方法,扩增出在天然人胰岛素原N端添加精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、脯氨酸4个氨基酸残基的重构胰岛素原基因片段,将其插入通用表达载体pET28a后,再将经过改构后的硫氧还蛋白的基因片段与重构胰岛素原基因的5′端通过赖氨酸连接,成功构建了速效人胰岛素原类似物融合蛋白(FKPPIns)的表达载体。

此融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,经包涵体洗涤和DEAE阴离子交换树脂纯化后进行复性、酶切。

酶切产物经纯化后,质谱法测定其分子量;等电聚焦法测定此蛋白的等电点;凝胶过滤法测定其自身的缔合性质。

对新西兰大白兔肌肉注射纯化后PIns,进行初步的药效学评价。

结果：获得了结构为的PIns纯品,其等电点为,自身缔合性较标准胰岛素显着下降。

结论： PIns与标准人胰岛素相比,起效快、达峰时间及持续时间短。

【关键词】融合表达;速效人胰岛素类似物; 单体胰岛素; 药效学活性常规药用人胰岛素由A、B两条多肽链构成,等电点为,以六聚体形式溶解于中性溶液中。

六聚体在皮下不能直接被吸收,必须解聚成二聚体或单体方能透过毛细血管壁进入血液循环而发挥作用。

因此,起效时间约为h,作用高峰在～ h,持续时间6～8 h,药代动力学特征与正常人餐后的胰岛素高水平分泌和餐间及夜晚的低水平基础胰岛素分泌不符,造成临床应用上的局限：(1)使用不便,需要在餐前30 min注射,且餐后血糖控制不理想。

(2)作用时间较长,容易出现下一餐前的低血糖和夜间低血糖[1]。

现在已经上市的3种速效人胰岛素类似物(PIns)Lispro、Aspart和Glulisine等电点均在左右,以单体形式存在,起效快，达峰时间及作用时间短,可以较好地模拟和替代餐时胰岛素的分泌,病人可根据进餐的需要及在餐后追加使用,在更好地控制餐后血糖的同时减少了低血糖的发生。

以往采用改变与六聚体形成相关的人胰岛素B链上某些氨基酸的方法,来改善胰岛素自身聚合的性质,以达到速效的目的。

而我们的实验目的是在不改变天然人胰岛素氨基酸序列的情况下,仅在其B链N端添加精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、脯氨酸4个氨基酸,获得了一种等电点,接近人生理pH值的,缔合性较标准人胰岛素显着降低的PIns。

1 材料与方法材料菌种和质粒含有标准人胰岛素原基因的质粒)、含有硫氧还蛋白基因的质粒(pET32a)、表达载体pET28a、大肠杆菌，均为实验室保存。

试剂引物由上海英俊生物技术公司合成,限制性内切酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、Taq酶及T4 DNA连接酶均为TaKaRa公司产品。

Trypsin和羧肽酶B均为Amresco公司产品。

人胰岛素标准品为 Sigma公司产品。

三氟乙酸(TFA)和乙腈为色谱纯,其余试剂均为市售分析纯。

实验方法重组质粒的构建及转化用Oligo 软件,自行设计引物LysArgProLysPro引物1：ⅠAAGCGTCCGAAACCGTTT引物2：引物3：Glu引物4：。

以质粒为模板,利用引物1和引物2进行PCR扩增反应,反应过程包括94 ℃变性5 min,然后在94 ℃、45 s，58 ℃、50 s，72 ℃、45 s条件下进行30个循环,最后72 ℃保温5 min。

扩增后的基因片段纯化后用限制性内切酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ切割,切割后的产物与经过同样酶切后的表达载体pET28a连接后,得到重组质粒。

以pET32a质粒为模板,用引物3和引物4进行PCR扩增反应,反应过程包括94 ℃变性5 min,然后在94 ℃、45 s，57 ℃、45 s，72 ℃、20 s条件下进行30个循环,最后72 ℃保温5 min。

扩增后的基因片段纯化后用限制性内切酶Nco Ⅰ、BamH Ⅰ切割,切割后的产物与经过同样酶切后的重组质粒连接后,得到重组质粒。

重组质粒经酶切、测序后鉴定。

将该质粒转入大肠杆菌中,进一步做表达筛选。

FKPPIns融合蛋白的发酵表达从平板上挑取工程菌单菌落,接种至含50μg·ml-1卡那霉素的5 ml LB液体培养基中,于37 ℃培养12 h后,转接到500 ml含 50 μg·ml-1卡那霉素的LB培养基中作为发酵种子液。

于37 ℃培养12 h后,接种到5 L 新鲜的LB培养基中进行发酵,在37 ℃搅拌、通气条件下培养4 h后加入终浓度为mmol·L-1的α乳糖,诱导表达融合蛋白FKPPIns。

诱导6 h后,于4 ℃和5000×g条件下离心10min,收集菌体检测目的蛋白的表达量。

FKPPIns融合蛋白的纯化收集后的菌体按1∶10(m/v)悬浮在含有% Triton、50 μg·ml-1溶菌酶的标准液(50 mmol·L-ol·L-1 EDTA,pH )中,37℃过夜裂解。

于4 ℃和8000×g条件下离心20min,回收沉淀。

沉淀先后用含有%和2 mol·L-1尿素的标准液分别洗涤两次,每次2 h。

于4 ℃和8000×g 条件下离心20min收集沉淀。

沉淀用含有8 mol·L-1尿素、%巯基乙醇的标准液,37 ℃裂解4 h。

于4 ℃和12000×g条件下离心20 min，取上清。

上清用阴离子交换树脂纯化,平衡液用含有8 mol·L-1尿素的标准液,洗脱液用含有0～·L-1 NaCl、8m ol·L-1尿素的直线梯度标准液,根据15%电泳检测的结果收集目的蛋白峰,透析后冻干。

FKPPIns融合蛋白的复性参照文献方法对融合蛋白进行复性。

FKPPIns融合蛋白的切割、纯化及鉴定参照文献方法对复性后的FKPPIns进行酶切转化,酶切产物纯化后进行真空冷冻干燥。

干燥后样品送南京大学进行AutoflexToF/ToF(Bruker Daitonnics)质谱鉴定。

PIns的等电点测定参照文献方法,分别用·L-1H3PO4和·L-1NaOH作为阳极和阴极缓冲液,测定PIns的等电点。

凝胶固定染色之前,从胶板上顺电场方向切下一窄条凝胶条,按 cm等距离切成小块后顺序放入小试管中,每管加入 ml双蒸水浸泡10 min,用微电极测定pH值,绘制标准曲线。

然后根据PIns的固定位置,对照标准曲线得出PIns的等电点。

PIns的自身缔合性质测定将IgG (相对分子质量为150 000)、标准人胰岛素(相对分子质量为5976)、PIns(相对分子质量为6275)、还原型的谷胱甘肽(相对分子质量为307)样品溶于20mmol·L-1磷酸钠缓冲液( pH ) 中,浓度为3mg·ml-1。

分子筛柱为以200 mmol·L-1 NaCl、20mmol·L-1 Na2HPO4为流动相,上样量5 μl,流速1 ml·min-1,以220 nm紫外监测,室温操作。

PIns初步药效学研究将标准人胰岛素和PIns用生理盐水配成浓度为mg·ml-1(约40 U·mg-1)的注射液。

取体重2～ kg的健康新西兰大白兔雌兔6只,随机分为天然胰岛素组、速效胰岛素类似物组两组,每组3只。

实验前18～20 h停止食物喂养,但给予饮水。

大腿内侧肌肉注射给药, 剂量为U·kg-1。

0、、、、、1、、2、3、4、5、6、7h时耳缘静脉取血,用血葡萄糖检测仪进行血糖测定。

2 结果重组质粒的构建以为模板,用加端PCR方法,扩增出在天然胰岛素原N端加有编码精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、脯氨酸4个氨基酸残基的基因片段,酶切后将其插入pET28a中,得到重组质粒图1)。

以pET32a为模板,通过PCR方法将硫氧还蛋白的前20个氨基酸的第2、4位氨基酸突变成甘氨酸和谷氨酸,扩增出的基因片段酶切后插入重组质粒得到以突变后的硫氧还蛋白的部分基因片段为融合伙伴,由赖氨酸与目的蛋白相接头的融合蛋白表达载体图1)。

重组质粒由上海英俊生物技术公司进行序列测定,证明插入序列正确。

FKPPIns的表达和纯化用电泳分析FKPPIns融合蛋白的表达量。

如图2所示,工程菌中在相对分子质量约12000处有一条区别于宿主菌蛋白的条带,通过薄层色谱扫描,约占全菌蛋白的40%。

融合蛋白经包涵体洗涤与DEAE纯化后纯度达95%。

1.分子量Marker;2. 宿主菌全蛋白;3. 工程菌全蛋白;4.FKPPIns的复性、酶切及鉴定复性后的FKPPIns融合蛋白,酶切时分别于 h和6 h取样。

切割完成后用对产物纯化,小肽电泳分析确定合适的切割时间和纯化后酶切产物PIns的纯度。

结果如图3所示,切割 h时仍有大量的复性后的FKPPIns融合蛋白没被切割,直至6 h才基本切割完全。

酶切产物经HPLC纯化后,纯度可达90%。

切割后PIns的结构应为标准胰岛素B链N端带有精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、脯氨酸4个氨基酸理论相对分子质量为6286。

纯化过的样品冻干后,通过质谱测定相对分子质量为,与理论相对分子质量相符。

PIns等电点的测定在等电聚焦(IEF)时,目的蛋白富集在距离管子底部 cm处(图4)。

固定后,PIns被固定在距离凝胶阳极端部 cm处,对照凝胶所做的标准等电点曲线(图4),可以计算出PIns的等电点为。

PIns的缔合性质测定采用分析型凝胶过滤方法,用IgG(相对分子质量为150000)、标准人胰岛素(相对分子质量为5976)、还原型谷胱甘肽(相对分子质量为307)作对照,对PIns自身聚合的性质进行测定。

如图5所示,IgG、标准人胰岛素、PIns、还原型谷胱甘肽的出峰时间依次为、、、,PIns的出峰时间明显延迟于标准人胰岛素。

PIns对新西兰大白兔的降血糖作用对新西兰大白兔皮下注射相同浓度的标准胰岛素和PIns后,测定的各个不同时间点取血的血糖值以起始值作百分比标准化换算,取其平均值来判定PIns降血糖的时效关系。

如图6所示,PIns对新西兰大白兔降血糖的起效时间为10 min、达峰时间为30 min、作用时间约为3 h,而标准胰岛素的起效时间约为、达峰时间为2h、作用时间约为。

PIns起效较常规胰岛素快。

3 讨论基因重组技术的发展使一些原核和真核蛋白在大肠杆菌中高效表达成为可能,然而某些蛋白尤其是小分子蛋白的表达仍较为困难，主要是由于表达的异源蛋白容易降解或者潜在的编码区域不能有效地转录所造成的。

一个普遍的解决方法是在目的蛋白的N端加一个融合伙伴,表达的融合蛋白通过化学切割或酶切的方法切割后获得目的蛋白。

我们采用了PCR的方法将硫氧还蛋白前20个氨基酸的第2个氨基酸突变成甘氨酸,便于其与表达载体的连接;将第4位氨基酸突变成谷氨酸,以提高此融合肽段的酸性,为后来使用DEAE阴离子交换树脂纯化此融合蛋白提供了便利。