浅论一种新型速效人胰岛素类似物的构建、制备及性质研究

浅论一种新型速效人胰岛素类似物的构建、制备及性质研究

【摘要】目的：构建和制备出一种新型速效人胰岛素类似物(PIns),进行其性质研究。方法：采用加端PCR的方法,扩增出在天然人胰岛素原N端添加精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、脯氨酸4个氨基酸残基的重构胰岛素原基因片段,将其插入通用表达载体

pET28a后,再将经过改构后的硫氧还蛋白

的基因片段与重构胰岛素原基因的5′端通过赖氨酸连接,成功构建了速效

人胰岛素原类似物融合蛋白(FKPPIns)的表达载体。此融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,经包涵体洗涤和DEAE阴离子交换树脂纯化后进行复性、酶切。酶切产物经

纯化后,质谱法测定其分子量;等电聚焦法

测定此蛋白的等电点;凝胶过滤法测定其自身的缔合性质。对新西兰大白兔肌肉注射纯化后PIns,进行初步的药效学评价。结果：获得了结构为的PIns

纯品,其等电点为,自身缔合性较标准胰岛

素显着下降。结论： PIns与标准人胰岛素

相比,起效快、达峰时间及持续时间短。

【关键词】融合表达;速效人胰岛素类似物; 单体胰岛素; 药效学活性

常规药用人胰岛素由A、B两条多肽链构成,等电点为,以六聚体形式溶解于中性溶液中。六聚体在皮下不能直接被吸收,必须解聚成

二聚体或单体方能透过毛细血管壁进入血

液循环而发挥作用。因此,起效时间约为h,作用高峰在～ h,持续时间6～8 h,药代动力学特征与正常人餐后的胰岛素高水平分泌

和餐间及夜晚的低水平基础胰岛素分泌不符,造成临床应用上的局限：(1)使用不便,

需要在餐前30 min注射,且餐后血糖控制不理想。(2)作用时间较长,容易出现下一餐前的低血糖和夜间低血糖[1]。

现在已经上市的3种速效人胰岛素类似物(PIns)Lispro、Aspart和Glulisine等电点均在左右,以单体形式存在,起效快，达峰时间及作用时间短,可以较好地模拟和替代

餐时胰岛素的分泌,病人可根据进餐的需要

及在餐后追加使用,在更好地控制餐后血糖的同时减少了低血糖的发生。以往采用改变与六聚体形成相关的人胰岛素B链上某些氨基酸的方法,来改善胰岛素自身聚合的性质,以达到速效的目的。而我们的实验目的是在不改变天然人胰岛素氨基酸序列的情况下,仅在其B链N端添加精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、脯氨酸4个氨基酸,获得了一种等电点,接近人生理pH值的,缔合性较标准人胰岛素显着降低的PIns。

1 材料与方法

材料

菌种和质粒含有标准人胰岛素原基因的质粒)、含有硫氧还蛋白基因的质粒(pET32a)、表达载体pET28a、大肠杆菌，均为实验室保存。

试剂引物由上海英俊生物技术公司合成,限制性内切酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、Taq

酶及T4 DNA连接酶均为TaKaRa公司产品。Trypsin和羧肽酶B均为Amresco公司产品。人胰岛素标准品为 Sigma公司产品。三氟乙酸(TFA)和乙腈为色谱纯,其余试剂均为市

售分析纯。

实验方法

重组质粒的构建及转化用Oligo 软件,自行设计引物

LysArgProLysPro

引物1：

ⅠAAGCGTCCGAAACCGTTT

引物2：

引物3：

Glu

引物4：

。以

质粒为模板,利用引物1和引物2进行PCR扩增反应,反应过程包括94 ℃变性5 min,然后在94 ℃、45 s，58 ℃、50 s，72 ℃、45 s条件下进行30个循环,最后72 ℃保温5 min。扩增后的基因片段纯化后用限制性内切酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ切割,切割后的产物与经过同样酶切后的表达载体

pET28a连接后,得到重组质粒。以pET32a质粒为模板,用引物3和引物4进行PCR扩增反应,反应过程包括94 ℃变性5 min,然后在94 ℃、45 s，57 ℃、45 s，72 ℃、20 s条件下进行30个循环,最后72 ℃保温5 min。扩增后的基因片段纯化后用限制性内切酶Nco Ⅰ、BamH Ⅰ切割,切割后的产物与经过同样酶切后的

重组质粒连接后,得到重组质粒。重组质粒经酶切、测序后鉴定。将该质粒转入大肠杆菌

中,进一步做表达筛选。

FKPPIns融合蛋白的发酵表达从平板

上挑取工程菌单菌落,接种至含50

μg·ml-1卡那霉素的5 ml LB液体培养基中,于37 ℃培养12 h后,转接到500 ml含 50 μg·ml-1卡那霉素的LB培养基中作为发酵种子液。于37 ℃培养12 h后,接种到5 L 新鲜的LB培养基中进行发酵,在37 ℃搅拌、通气条件下培养4 h后加入终浓度为mmol·L-1的α乳糖,诱导表达融合蛋白FKPPIns。诱导6 h后,于4 ℃和5000×g条

件下离心10min,收集菌体检测目的蛋白的表达量。

FKPPIns融合蛋白的纯化收集后的菌

体按1∶10(m/v)悬浮在含有% Triton

、50 μg·ml-1溶菌酶的标准液(50 mmol·L-ol·L-1 EDTA,pH )中,37℃过夜裂解。于4 ℃和8000×g条件下离心20min,回收沉淀。沉淀先后用含有%

和2 mol·L-1尿素的标准液分别洗涤两次,每次2 h。于4 ℃和8000×g 条件下离心20min收集沉淀。沉淀用含有8 mol·L-1尿素、%巯基乙醇的标准液,37 ℃裂解4 h。于4 ℃和12000×g条件下离心20 min，取上清。上清用阴离子交换树脂纯化,平衡液用含有8 mol·L-1尿素的标准液,洗脱液用含有0～·L-1 NaCl、8m ol·L-1尿素的直线梯度标准液,根据15%

电泳检测的结果收集目的蛋白峰,透析后冻干。

FKPPIns融合蛋白的复性参照文献方

法对融合蛋白进行复性。

FKPPIns融合蛋白的切割、纯化及鉴定