ELISA法检测血清抗心磷脂抗体
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2 实验与结果
2. 1 包被载体的比较 本研究对 Corn ing Costar高 亲和力板条、C-射线处理国产 8孔板条及国产 12孔 板进行了比较, 将阳性及阴性样本用以上不同包被 载体进行检测, 其 P /N 值显 示不同厂家、批号的包 被载体对包被抗原的吸附力和均一性均有差别, 其 中以 C orn ing Costar板吸附力最佳。 2. 2 包被抗原浓度与体积的选择 以 4份阳性血 清与 4份阴性血清平均 A 值的比值 ( P /N ) 对不同浓
注: * 含 10 mm ol /L H epes, 150 mmo l/ L N aC ,l 3 g /L BSA, pH 7. 4。
10% 小牛血清 (新鲜 ) 0. 649 0. 226 2. 872
10 g /L PEG-PBS
0. 634 0. 210 3. 019
2. 4 样 本稀释 液的比 较 本 研究 就含 不同浓 度 BSA 的稀释液对检测结果的影响进行比较, 结果含 有 20 g /L、100 g /L BSA的 PBS稀释液的检测结果基 本一致, 并且加入显色剂后对实验结果无显著影响。 但未含 BSA的稀释液则检测结果不佳。 2. 5 样本稀释度与反应温度的选择 血清 1B50和 1B100 稀释 P /N 值分别为 3. 737 和 3. 511, 二者无显著区 别。稀释度 > 1B200, P /N值显著降低 ( 2. 963~ 2. 646)。 反应温度 25 e 优于 37 e 水浴。 2. 6 B2-GP I对检测结果的影响 用欧蒙公司 A CA 检测试剂检测结果 阳性的血清 25 份, 阴性血清 17 份进行比较, 发现单用心磷脂抗原包被时, 敏感性为 68. 0% ~ 76. 0% , 特异性为 82. 4% ; 将 B2-GP I与心 磷脂抗原混合后包被者, 敏感性 84. 0% , 特 异性仅 76. 5% ; 而先包被心磷脂抗原, 次日再包被 B2-GP I时, 敏感性最高, 达 92. 0% , 特异性也最高, 为 94. 1% 。 2. 7 稳定性试验 包被板及试剂于 37 e 分别存放 4~ 8 d后, 与 4 e 存放的试剂进行比较。放 37 e 后 A 值略有下降, 但与 4 e 保存者无统计学差异。 2. 8 精密度 4份血清样本同一批次重复检测 12 次, 批内变异系数 ( CV ) 为 4. 0% ~ 9. 5% ; 以 3份血 清样本重复检测 12次, 批间 CV 为 9. 9% ~ 15. 4% 。
纯度 > 98% , 为美国 S igm a公司产品, - 20 e 保存。 纯化的人 B2-GP I本室自制, 由健康成人血浆经高氯 酸沉淀、肝素亲和层析、P rotein G亲和层析分离纯化 后获得, 分子量 (M r)约 47 000, SDS-PAGE鉴定纯度 \ 95% , 蛋白 质含量 0. 5 m g /m ,l 用 w estern blotting 鉴定其活性后分装贮于 - 80 e 。聚苯乙烯固相载 体为 Corning Costar高亲和力板条, 样本稀释液和酶 稀释液分别为含 20 g /L 小牛血清清蛋白 ( BSA ) 的 0. 01 mo l /L( pH 7. 4) PBST 和硼酸盐缓冲液 ( 含 BSA 稳定剂及防腐剂色素 等 ) , 酶结合物为 丹麦 DAKO 公司生产的辣根过氧化物酶 ( HRP ) 标记的兔抗人 IgG、IgA、IgM, 封闭液为含 10 g /L 聚乙二醇 ( PEG ) 混合物之 PBS, 显色剂为 TMB-H2O 2 底物系统, 终止 液为 2 m o l/L 硫酸。 1. 3 EL ISA 包被板的制备 将心磷脂抗原稀释为 100、50、25、12. 5、6. 25、3. 125 Lg /m l分别进行包被, 4 e 过夜, 次日以 1 Lg /m l的 B2-GP I进行再包被, 37 e 1. 5 h后以 10 g /L PEG 混合物封闭, 干燥、密封 后贮于 2~ 8 e 。 1. 4 EL ISA 检测 待测血清稀释后加至反应板孔 内, 经温育、洗涤, 加入已稀释的酶结合物, 温育、洗
度心磷脂包被效果进行比较, 结果用 100、50、12. 5、 6. 25和 3. 125 Lg /m l心磷脂包被时, P /N 值分别为 6. 988、6. 474、5. 891、4. 762和 3. 733。在以后的研 究中均选用 50 Lg /m l浓度包被。同法选用 1 Lg /m l B2-G P I进行包被。包被体积 50 Ll与 100 L l结果无 区别, 均选用 50 Ll。 2. 3 包被条件的比较 一种方法是在氮气条件下 快速蒸发约 20 m in, 另一种在 4 e 过夜, 两者结果无 显著差异, 因此选用 4 e 过夜进行包被。分别用 10 g /L BSA、3 g /L BSA-H epes、10% 小牛血清 ( 灭活 )、 10% 小牛血清 ( 新鲜 ) 、10 g /L PEG-PBS等 5种封闭 液封闭, 结果见表 1。各种封闭液封 闭效果无显著 差异 ( P > 0. 05) , 但以 10 g /L PEG-PBS混合液效果 最佳且价格便宜。
表 1 5种不同封闭液效果的比较 ( A 值均值 )
标本
ACA 阳性血清 ( n = 11) ACA 阴性血清 ( n = 12)
P /N
Fra Baidu bibliotek
10 g /L BSA
0. 908 0. 316 2. 873
3 g /L BSA-H epes*
0. 855 0. 309 2. 767
10% 小牛血清 (灭活 ) 0. 630 0. 212 2. 972
摘要: 目的 分析 EL ISA 检测血清抗心磷脂抗体 ( A CA )的方法学影响因素, 并 对实验条件进行优化。方法 用间接 EL ISA 检
测 559份血清 ACA 水平 , 并以欧蒙公司标准品标定临界值, 用以判定 结果。结果 对检测 方法进 行了优 化, 本 试验特 异性为
96. 4% ( 503 /522), 敏感性为 89. 2% ( 33 /37), 临床诊断符合率 为 96. 2% ( 538 /559)。结论 优化后的 EL ISA 法检测 ACA 具有
1 材料和方法
1. 1 样本来源 血清样本来自本院及北京大学第 一医院检验科, 其中健 康成人 431名, 梅毒患者 89 名, SLE患者 39名, 均保存于 - 70 e 待测。经欧蒙 公司 EL ISA 法检测 ACA 试剂盒测定, ACA 阳性 37 份, ACA 阴性 522份。 1. 2 试剂 包被用抗原 Ñ 为心磷脂, Ò 为 B2-糖蛋 白 Ñ ( beta 2 g lycoprote in I, B2-GP I)。心磷脂系从 牛心中提取的心磷脂乙醇溶液, 浓度为 4. 7 mg /m ,l
# 16#
临床检验杂志 2010年 1月第 28卷第 1期 Ch in J C lin L ab Sc,i Jan. 2010, V o .l 28, N o. 1
文章编号: 1001-764X ( 2010) 01-016-03
#临床检验技术研究 #
EL ISA 法检测血清抗心磷脂抗体
金燕萍 1, 陈因1, 于雪 莹1, 鄢盛恺 1, 侯林浦 2, 李欣 2, 吴尔若 2, 马旭 2 ( 1. 卫生部中 日友好医院检 验科, 北京 100029; 2. 国家人口计生委科学技术研究所, 北京 100081)
作者简介: 金燕萍, 1962年生, 女, 主管技师, 本科, 从事临床病毒与血清自身抗体检测。
临床检验杂志 2010年 1月第 28卷第 1期 Chin J C lin L ab Sc ,i Jan. 2010, V o .l 28, N o. 1
# 17#
涤后加入底物系统显色, 最后加入终止液 200 L,l 于 酶联仪 450 nm 波长测 A 值。以欧蒙公司 ACA 试剂 盒标示的临界值判定结果是否阳性。 1. 5 统计学方法 采用 SPSS 11. 0 统计软件对检 测数据进行统计学分析。
敏感、特异、简便快速、重复性佳的特点, 可 用于血清 ACA 水平的常规检测。
关键词: 抗心磷脂抗体; 酶联免疫 吸附试验
中图分类号: R 446. 6
文献标识码: A
S tudy on an EL ISA for detecting an ticard iolip in an tibod ies in serum J IN Yan-p ing1, CH EN Y in1, YU X ue-y ing1, YAN Sheng-kai1, H OU Lin-pu2, LI X in2, W U E r-ruo2, M A X u2 ( 1. D epartm ent of Laboratory, China-Japan F riendship H o sp ital, B eij ing 100029; 2. N ational R esearch Institu te of Fam ily P lanning, Beij ing 100081, Ch ina) Abstrac t: Ob jec tive T o ana ly ze influenc ing facto rs on an EL ISA for detecting an ticard io lipin antibod ies ( ACA ) in serum and to improve test procedures. M ethods ACA in 559 serum sam ples w as detec ted by indirect EL ISA, in wh ich the standard certificated by Con federation of Euro immun also serv ed as cut-o ff va lue. Re su lt T he techn ica l com parison and im provem ent o f m ethod fo r detec ting ACA w ere accomp lished w ith the specificity o f 96. 7% ( 503 /522) , sensitiv ity o f 89. 2% ( 33 /37) and c lin ica l co incidence of 96. 2% ( 538 /559) . Conclusions T he optim ized m ethod has advantages of h igh sens itiv ity and spec ificity, good repeatability, rap idity, and conv en ience. The assay can be used for routine detection o f ACA in se rum. K ey word s: anticardio lip in an tibody; EL ISA
抗磷脂抗体综合征 ( an tiphospho lipid syndrom e, APS)为非器官特异性的自身免疫性疾病, 临床表现 包括反复血管栓塞、流产或胎死宫内、血小板减少、 溶血性贫血及肢端顽固性溃疡等, 这些临床表现可 单一出现或并存。由于 APS患者体内具有中、高滴 度抗心磷脂抗体 ( anticardio lip in an tibody, ACA ) 并可 长期存在 [ 1] , 因此 A CA 为 诊断 APS 的 重要 依据。 EL ISA法检测 ACA 具有简便、快速、可定量检测抗 体类型及易于标准化等优点, 但影响因素较多, 不同 实验室测得的结果差异较大 [ 2-3] 。本研究对 EL ISA 法 检测 ACA的影响因素进行了比较研究, 现报告如下。
2. 1 包被载体的比较 本研究对 Corn ing Costar高 亲和力板条、C-射线处理国产 8孔板条及国产 12孔 板进行了比较, 将阳性及阴性样本用以上不同包被 载体进行检测, 其 P /N 值显 示不同厂家、批号的包 被载体对包被抗原的吸附力和均一性均有差别, 其 中以 C orn ing Costar板吸附力最佳。 2. 2 包被抗原浓度与体积的选择 以 4份阳性血 清与 4份阴性血清平均 A 值的比值 ( P /N ) 对不同浓
注: * 含 10 mm ol /L H epes, 150 mmo l/ L N aC ,l 3 g /L BSA, pH 7. 4。
10% 小牛血清 (新鲜 ) 0. 649 0. 226 2. 872
10 g /L PEG-PBS
0. 634 0. 210 3. 019
2. 4 样 本稀释 液的比 较 本 研究 就含 不同浓 度 BSA 的稀释液对检测结果的影响进行比较, 结果含 有 20 g /L、100 g /L BSA的 PBS稀释液的检测结果基 本一致, 并且加入显色剂后对实验结果无显著影响。 但未含 BSA的稀释液则检测结果不佳。 2. 5 样本稀释度与反应温度的选择 血清 1B50和 1B100 稀释 P /N 值分别为 3. 737 和 3. 511, 二者无显著区 别。稀释度 > 1B200, P /N值显著降低 ( 2. 963~ 2. 646)。 反应温度 25 e 优于 37 e 水浴。 2. 6 B2-GP I对检测结果的影响 用欧蒙公司 A CA 检测试剂检测结果 阳性的血清 25 份, 阴性血清 17 份进行比较, 发现单用心磷脂抗原包被时, 敏感性为 68. 0% ~ 76. 0% , 特异性为 82. 4% ; 将 B2-GP I与心 磷脂抗原混合后包被者, 敏感性 84. 0% , 特 异性仅 76. 5% ; 而先包被心磷脂抗原, 次日再包被 B2-GP I时, 敏感性最高, 达 92. 0% , 特异性也最高, 为 94. 1% 。 2. 7 稳定性试验 包被板及试剂于 37 e 分别存放 4~ 8 d后, 与 4 e 存放的试剂进行比较。放 37 e 后 A 值略有下降, 但与 4 e 保存者无统计学差异。 2. 8 精密度 4份血清样本同一批次重复检测 12 次, 批内变异系数 ( CV ) 为 4. 0% ~ 9. 5% ; 以 3份血 清样本重复检测 12次, 批间 CV 为 9. 9% ~ 15. 4% 。
纯度 > 98% , 为美国 S igm a公司产品, - 20 e 保存。 纯化的人 B2-GP I本室自制, 由健康成人血浆经高氯 酸沉淀、肝素亲和层析、P rotein G亲和层析分离纯化 后获得, 分子量 (M r)约 47 000, SDS-PAGE鉴定纯度 \ 95% , 蛋白 质含量 0. 5 m g /m ,l 用 w estern blotting 鉴定其活性后分装贮于 - 80 e 。聚苯乙烯固相载 体为 Corning Costar高亲和力板条, 样本稀释液和酶 稀释液分别为含 20 g /L 小牛血清清蛋白 ( BSA ) 的 0. 01 mo l /L( pH 7. 4) PBST 和硼酸盐缓冲液 ( 含 BSA 稳定剂及防腐剂色素 等 ) , 酶结合物为 丹麦 DAKO 公司生产的辣根过氧化物酶 ( HRP ) 标记的兔抗人 IgG、IgA、IgM, 封闭液为含 10 g /L 聚乙二醇 ( PEG ) 混合物之 PBS, 显色剂为 TMB-H2O 2 底物系统, 终止 液为 2 m o l/L 硫酸。 1. 3 EL ISA 包被板的制备 将心磷脂抗原稀释为 100、50、25、12. 5、6. 25、3. 125 Lg /m l分别进行包被, 4 e 过夜, 次日以 1 Lg /m l的 B2-GP I进行再包被, 37 e 1. 5 h后以 10 g /L PEG 混合物封闭, 干燥、密封 后贮于 2~ 8 e 。 1. 4 EL ISA 检测 待测血清稀释后加至反应板孔 内, 经温育、洗涤, 加入已稀释的酶结合物, 温育、洗
度心磷脂包被效果进行比较, 结果用 100、50、12. 5、 6. 25和 3. 125 Lg /m l心磷脂包被时, P /N 值分别为 6. 988、6. 474、5. 891、4. 762和 3. 733。在以后的研 究中均选用 50 Lg /m l浓度包被。同法选用 1 Lg /m l B2-G P I进行包被。包被体积 50 Ll与 100 L l结果无 区别, 均选用 50 Ll。 2. 3 包被条件的比较 一种方法是在氮气条件下 快速蒸发约 20 m in, 另一种在 4 e 过夜, 两者结果无 显著差异, 因此选用 4 e 过夜进行包被。分别用 10 g /L BSA、3 g /L BSA-H epes、10% 小牛血清 ( 灭活 )、 10% 小牛血清 ( 新鲜 ) 、10 g /L PEG-PBS等 5种封闭 液封闭, 结果见表 1。各种封闭液封 闭效果无显著 差异 ( P > 0. 05) , 但以 10 g /L PEG-PBS混合液效果 最佳且价格便宜。
表 1 5种不同封闭液效果的比较 ( A 值均值 )
标本
ACA 阳性血清 ( n = 11) ACA 阴性血清 ( n = 12)
P /N
Fra Baidu bibliotek
10 g /L BSA
0. 908 0. 316 2. 873
3 g /L BSA-H epes*
0. 855 0. 309 2. 767
10% 小牛血清 (灭活 ) 0. 630 0. 212 2. 972
摘要: 目的 分析 EL ISA 检测血清抗心磷脂抗体 ( A CA )的方法学影响因素, 并 对实验条件进行优化。方法 用间接 EL ISA 检
测 559份血清 ACA 水平 , 并以欧蒙公司标准品标定临界值, 用以判定 结果。结果 对检测 方法进 行了优 化, 本 试验特 异性为
96. 4% ( 503 /522), 敏感性为 89. 2% ( 33 /37), 临床诊断符合率 为 96. 2% ( 538 /559)。结论 优化后的 EL ISA 法检测 ACA 具有
1 材料和方法
1. 1 样本来源 血清样本来自本院及北京大学第 一医院检验科, 其中健 康成人 431名, 梅毒患者 89 名, SLE患者 39名, 均保存于 - 70 e 待测。经欧蒙 公司 EL ISA 法检测 ACA 试剂盒测定, ACA 阳性 37 份, ACA 阴性 522份。 1. 2 试剂 包被用抗原 Ñ 为心磷脂, Ò 为 B2-糖蛋 白 Ñ ( beta 2 g lycoprote in I, B2-GP I)。心磷脂系从 牛心中提取的心磷脂乙醇溶液, 浓度为 4. 7 mg /m ,l
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临床检验杂志 2010年 1月第 28卷第 1期 Ch in J C lin L ab Sc,i Jan. 2010, V o .l 28, N o. 1
文章编号: 1001-764X ( 2010) 01-016-03
#临床检验技术研究 #
EL ISA 法检测血清抗心磷脂抗体
金燕萍 1, 陈因1, 于雪 莹1, 鄢盛恺 1, 侯林浦 2, 李欣 2, 吴尔若 2, 马旭 2 ( 1. 卫生部中 日友好医院检 验科, 北京 100029; 2. 国家人口计生委科学技术研究所, 北京 100081)
作者简介: 金燕萍, 1962年生, 女, 主管技师, 本科, 从事临床病毒与血清自身抗体检测。
临床检验杂志 2010年 1月第 28卷第 1期 Chin J C lin L ab Sc ,i Jan. 2010, V o .l 28, N o. 1
# 17#
涤后加入底物系统显色, 最后加入终止液 200 L,l 于 酶联仪 450 nm 波长测 A 值。以欧蒙公司 ACA 试剂 盒标示的临界值判定结果是否阳性。 1. 5 统计学方法 采用 SPSS 11. 0 统计软件对检 测数据进行统计学分析。
敏感、特异、简便快速、重复性佳的特点, 可 用于血清 ACA 水平的常规检测。
关键词: 抗心磷脂抗体; 酶联免疫 吸附试验
中图分类号: R 446. 6
文献标识码: A
S tudy on an EL ISA for detecting an ticard iolip in an tibod ies in serum J IN Yan-p ing1, CH EN Y in1, YU X ue-y ing1, YAN Sheng-kai1, H OU Lin-pu2, LI X in2, W U E r-ruo2, M A X u2 ( 1. D epartm ent of Laboratory, China-Japan F riendship H o sp ital, B eij ing 100029; 2. N ational R esearch Institu te of Fam ily P lanning, Beij ing 100081, Ch ina) Abstrac t: Ob jec tive T o ana ly ze influenc ing facto rs on an EL ISA for detecting an ticard io lipin antibod ies ( ACA ) in serum and to improve test procedures. M ethods ACA in 559 serum sam ples w as detec ted by indirect EL ISA, in wh ich the standard certificated by Con federation of Euro immun also serv ed as cut-o ff va lue. Re su lt T he techn ica l com parison and im provem ent o f m ethod fo r detec ting ACA w ere accomp lished w ith the specificity o f 96. 7% ( 503 /522) , sensitiv ity o f 89. 2% ( 33 /37) and c lin ica l co incidence of 96. 2% ( 538 /559) . Conclusions T he optim ized m ethod has advantages of h igh sens itiv ity and spec ificity, good repeatability, rap idity, and conv en ience. The assay can be used for routine detection o f ACA in se rum. K ey word s: anticardio lip in an tibody; EL ISA
抗磷脂抗体综合征 ( an tiphospho lipid syndrom e, APS)为非器官特异性的自身免疫性疾病, 临床表现 包括反复血管栓塞、流产或胎死宫内、血小板减少、 溶血性贫血及肢端顽固性溃疡等, 这些临床表现可 单一出现或并存。由于 APS患者体内具有中、高滴 度抗心磷脂抗体 ( anticardio lip in an tibody, ACA ) 并可 长期存在 [ 1] , 因此 A CA 为 诊断 APS 的 重要 依据。 EL ISA法检测 ACA 具有简便、快速、可定量检测抗 体类型及易于标准化等优点, 但影响因素较多, 不同 实验室测得的结果差异较大 [ 2-3] 。本研究对 EL ISA 法 检测 ACA的影响因素进行了比较研究, 现报告如下。