高效液相色谱操作知识
高效液相色谱仪操作
高效液相色谱仪操作一、简介高效液相色谱仪（High-performance liquid chromatography，HPLC）是一种常用的分析仪器，主要用于分离、定量和检测样品中的化合物。
它具有分离效率高、分离时间短、操作方便等优点，广泛应用于制药、化妆品、食品、环境监测等领域。
本文将为您介绍高效液相色谱仪的操作步骤和注意事项。
二、操作步骤1.准备工作在使用高效液相色谱仪之前，需要确保仪器和所需材料的准备工作已完成。
包括以下几个方面： - 选用合适的色谱柱：根据样品的特性和分离要求，选择相应的色谱柱类型和规格。
- 准备好流动相：根据试验要求和分析方法，配置好正确的流动相，确保其符合实验要求。
- 检查仪器状态：检查仪器的电源是否正常，色谱柱是否安装正确，流速控制装置是否工作正常等。
2.样品准备•将待分析样品溶解或稀释到合适的浓度。
•过滤样品以去除杂质，确保样品的纯度和稳定性。
•如果需要，可以对样品进行衍生化处理，以提高分离效果。
3.仪器设置•打开操作软件，确保仪器和计算机正常连接。
•根据分析要求设置进样体积、流速、检测器参数等。
•在进样器中加入样品，设置为自动进样或手动进样。
4.开始分离•启动色谱泵，使流动相从色谱柱中流动，建立起足够的流速。
•启动检测器，选择适当的检测模式和波长。
根据样品特性选择合适的检测器类型，如紫外/可见光检测器、荧光检测器等。
•开始记录数据，在色谱软件上观察色谱图的变化，根据需要进行峰的识别和峰面积的积分计算。
5.数据分析•根据分析要求，对色谱图进行峰的分析和峰面积的计算。
•根据标准曲线或对照品，进行定量分析。
三、注意事项1.安全操作：使用高效液相色谱仪时，应注意仪器操作安全，避免发生意外事故。
如注意电源和高压电缆的连接是否牢固，避免漏电和触电危险。
2.样品准备：样品准备过程中，应避免受到外界污染和杂质的干扰，保证样品的纯度和稳定性。
3.色谱柱的选择：根据样品的性质和分离要求，选用合适的色谱柱。
高效液相色谱的工作原理及操作注意事项
高效液相色谱的工作原理及操作注意事项高效液相色谱的工作原理及操作注意事项一、高效液相色谱的工作原理高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分离和分析技术，主要应用于化学、生物、医药等领域。
其工作原理是利用不同物质在固定相和移动相之间的分配平衡，实现对待测组分的高效分离。
以下是高效液相色谱的工作原理：1.流动相：高效液相色谱中的流动相也称为溶剂或载体，是携带待测组分通过色谱柱的介质。
流动相的选择应根据样品的性质、检测器的类型以及分离效果等因素进行选择。
2.固定相：高效液相色谱中的固定相是色谱柱中的填料，通常是涂布在硅胶或氧化铝等载体上的高分子聚合物。
不同物质根据其在固定相和流动相之间的分配系数进行分离。
3.洗脱过程：在高效液相色谱中，待测组分随流动相通过色谱柱，经过固定相和流动相之间的分配平衡实现分离。
分离后的组分会按照其在固定相和流动相之间的分配系数依次流出色谱柱，进入检测器进行检测。
4.检测器：高效液相色谱中使用的检测器根据待测组分的性质和检测要求进行选择，常见的有紫外-可见光检测器、荧光检测器、电导检测器等。
检测器的作用是将组分的浓度转化为可测量的电信号，以便进行记录和分析。
二、高效液相色谱的操作注意事项在使用高效液相色谱进行实验操作时，需要注意以下事项：1.样品准备：在进行高效液相色谱分析前，需要对样品进行必要的处理和制备。
应尽可能避免样品中的杂质和干扰物质对分离和分析的影响。
同时，样品的浓度应适中，以避免色谱柱过载或检测器过载。
2.流动相选择：流动相的选择对高效液相色谱的分离效果和分析结果至关重要。
应根据样品的性质、实验要求以及分离效果等因素选择合适的流动相。
同时，应注意流动相的纯度和稳定性，以保证实验结果的可靠性。
3.色谱柱选择：高效液相色谱中使用的色谱柱是分离和分析的关键元件。
应根据样品的性质、待测组分的类型以及分离要求等因素选择合适的色谱柱。
同时，应注意色谱柱的粒径、孔径和填料性质等参数，以确保达到最佳的分离效果。
高效液相色谱仪的操作与维护指南
高效液相色谱仪的操作与维护指南高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）作为一种常用的分析仪器，广泛应用于化学、药学、环境科学等领域。
为了保证仪器的正常运行和获得可靠的分析结果，正确的操作和科学的维护是非常重要的。
本指南将详细介绍高效液相色谱仪的操作和维护方法，以帮助用户正确使用该仪器。
一、高效液相色谱仪的操作方法1. 准备工作在操作前，需要先进行一些准备工作。
首先，检查仪器是否处于稳定的工作环境中，以确保仪器不受外界干扰。
其次，检查所有的连接与密封件是否完好，确保流体不会泄漏。
最后，检查溶剂和样品的储存条件，保证其符合要求。
2. 开机与关闭正确的开机和关闭步骤可以延长仪器的寿命。
开机前，需要检查电源和其他外部连接。
按照仪器的说明书，按顺序打开电源和其他必要的开关。
关闭仪器时，应按照相反的顺序关闭开关，并断开电源。
3. 样品准备与进样在进行进样操作前，需要准备好样品和溶剂。
样品准备时，应遵循相应的样品制备方法，确保样品的准确性和稳定性。
进样时，应根据实验需求设置适当的进样方式，并注意定量准确。
4. 仪器参数设置在进行分析之前，需要设置仪器的参数，以调整流速、温度、检测波长等参数。
仪器的参数设置应根据实验目的和样品特性进行优化调整，确保获得准确的分析结果。
5. 分析运行与数据处理设置好仪器参数后，可以开始进行分析运行。
根据实验要求和样品特性，选择合适的分析方法和梯度程序。
在分析过程中，应定期检查仪器运行状态，注意观察流速、峰面积、保留时间等数据，并记录相关结果。
6. 仪器清洗与维护分析结束后，必须对仪器进行清洗和维护。
首先，关闭流体通道，清除流体残留物和样品残留物。
然后，根据仪器说明书的要求，进行仪器的常规清洗和维护工作。
定期检查和更换液相柱、检测器等易损件，以保证仪器的正常运行。
二、高效液相色谱仪的维护方法1. 液相柱维护液相柱作为HPLC分离的重要组件，需要定期维护和保养。
高效液相色谱法操作步骤
高效液相色谱法操作步骤
高效液相色谱法的操作步骤如下:
1. 过滤流动相并根据需要选择不同的滤膜。
溶剂必须为色谱纯，且溶剂及样品必须过膜（0.45μm）。
超声脱气30分钟以上。
2. 用流动相冲洗金属过滤器，然后将过滤器浸入储液罐的流动相中。
有一段时间没用或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。
3. 将储液罐放置在一定的高度，以避免由于搬运和其他操作人员的移动而造成不必要的跌落。
4. 然后按以下顺序依次启动高效液相色谱仪：泵→检测器→高效液相色谱软件→设置软件参数，如分析时间、检测波长、流速等。
5. 启动泵，运行5分钟，主要是为了排除系统中的气泡，结束后关闭所有排气阀。
6. 然后按照预先计划的速度，以固定的速率，如1mL/min左右，运行流动相，走基线，直到基线平稳。
7. 基线平稳后，在软件中设置样品的运行参数，如流速和分析时间等。
分析时间会因样品、流速、柱长等因素变化。
8. 设计走样方法。
9. 在进样和进样后操作的过程中，需要及时调整和监控各项参数。
高效液相色谱仪操作技巧及操作规程
高效液相色谱仪操作技巧及操作规程高效液相色谱仪操作技巧任何颗粒物进进高效液相色谱仪后都会在柱子进口端被筛板挡住，最后的结果是将柱子堵塞，表现出的特征是系统压力加添并使色谱峰变形。
因此，要实行各种防备措施，包括操纵步骤和商品仪器自身的各种过滤设计，努力防止或削减颗粒物进进高效液相色谱仪中，从而延长仪器和色谱柱的使用寿命，并进步数据的牢靠性。
在高效液相色谱仪中，颗粒物的紧要来源有三个途径：活动相、被测样品和仪器系统部件的磨损物。
1、被测样品使用针筒式过滤器不可能100%得到通过过滤器的被测样品，总会或多或少的丢失。
丢失来自这样几方面：过滤器滤膜的吸附、过滤器滤出的颗粒物上的吸附、针筒式滤膜过滤器与针筒连接处的渗漏等。
2、活动相无论是高效液相色谱仪HPLC级的水还是在试验室使用超纯水净化系统制备的水，最后一步也是通过0.2μm微孔滤膜。
任何一种缓冲液中加进了固体物，必定活动相过滤将。
少量杂质颗粒存在于活动相中必定成为残渣。
解决方法：2.1.活动相制备仅接受HPLC级液体时不需要过滤，反之全部活动相构成在使用前必需过滤。
2.2.在连接储液瓶和泵的输液管的末端进口接受下沉式过滤器（常见材质有熔融玻璃砂芯滤板和微孔金属的两种）也是很紧要的。
这个过滤器的规格为≥10μm的微孔物质，所以它不能取代活动相过滤步骤，但是它能除往系统中的尘土并保证储液瓶、输液管使用的牢靠性。
2.3.推举在HPLC系统中接受一个0.45或0.5μm的在线多孔过滤器，接在自动进样器和柱子之间，即使已使用了保护柱。
这个在线过滤器将成为挡板代替柱头的滤板，而且如接受一个玻璃砂芯滤板，既便宜，更换又便利（几分钟就可更换）。
若接受在线过滤，高效液相色谱仪检测每批样品开始前记录下压力值，当压力上升确定值，例如25%或加添500psi，应当更换玻璃砂芯滤板了，更换以后冲洗几分钟系统将恢复到原来的压力值。
3、仪器系统部件的磨损物最后，在高效液相色谱仪HPLC系统中颗粒物的另一个紧要来源是输液泵密封垫和进样阀旋转轴的磨损。
高效液相色谱仪操作说明书
高效液相色谱仪操作说明书一、引言高效液相色谱仪（HPLC）是一种广泛应用于化学、生物医药、环境监测等领域的分析仪器。
本操作说明书旨在帮助用户正确有效地操作HPLC仪器，以获得准确可靠的分析结果。
二、仪器概述1. 主要组成：HPLC仪器主要包括进样系统、色谱柱、流动相装置、检测器及数据分析系统等组成部分。
2. 基本原理：HPLC利用流动相在高压下通过色谱柱，样品分离后再由检测器进行检测和信号记录，通过数据分析系统生成分离效果图谱或定量结果。
三、操作步骤1. 准备工作a) 确保仪器电源已接通，并检查各部分连接是否牢固。
b) 打开相关软件并进行系统初始化。
c) 根据待分析样品的特性，选择适宜的色谱柱和流动相。
2. 进样系统操作a) 将待测样品通过合适的方法制备成溶液。
b) 打开进样系统的相关开关，将样品通过进样针注入进样口。
c) 调整进样量和进样速度，确保样品完全被进样器吸取。
3. 色谱柱操作a) 将色谱柱连接到系统中，并确保连接处密封良好。
b) 根据样品性质选择合适的流动相和梯度条件，设置柱温以提高分离效果。
c) 在柱前和柱后设置适当的减压阀，调节流量和压力，确保色谱柱正常运行。
4. 流动相装置操作a) 根据检测要求准备合适的流动相溶液。
b) 将流动相溶液通过流动相装置输送至色谱柱，确保流速和流量稳定。
5. 检测器操作a) 打开检测器并进行相关参数设置，如波长选择、灵敏度调节等。
b) 将流经色谱柱的样品原液通过检测器进行检测，并记录信号。
6. 数据分析与结果生成a) 使用相应的数据分析软件，导入检测到的信号数据。
b) 根据需求进行峰面积积分、峰高浓度定量等相关数据分析。
c) 生成分析图谱或报告，并保存结果。
四、故障排除在操作过程中，可能会遇到一些故障情况，以下列举一些常见故障及其排除方法：1. 柱堵塞：检查柱前和柱后的减压阀是否打开和调整流量。
2. 波峰异常：检查流动相和检测器参数设置是否正确。
3. 信号丢失：检查进样系统是否正常工作，检查柱连接是否存在泄漏。
高效液相色谱仪操作三要点 液相色谱如何操作
高效液相色谱仪操作三要点液相色谱如何操作高效液相色谱仪操作三要点高效液相色谱仪（HPLC）现已成为有机化学分析的紧要手段之一、同样，在食品分析中，无论是残留分析还是成分分析，HPLC也已成为不可或缺的分析仪器。
和其它分析仪器一样，你若想让HPLC 很好地为你工作、得到牢靠的数据，首先你要保养好它，使它处于一个良好的待机状态，这样你操作它进行分析时就可以比较顺当地获得理想的结果。
而且良好规范的操作习惯可以延长仪器使用寿命。
大家在学校或接受仪器公司培训的时候，老师或工程师会提出很多的操作注意事项。
但要是总结归纳一下，较为紧要的有三点：脱气、过滤和冲洗。
本文围绕这三点进行讨论，给新从事HPLC分析的工一点操作建议，希望能对正确的操作仪器有一点帮忙。
更欢迎有阅历的专家介绍使用阅历，提出好建议。
一、脱气流动相脱气对于避开HPLC系统出问题，顺当得到一个理想的数据是一个很有效的措施。
HPLC系统内是不希望有气泡存在的。
HPLC泵在输送液体时要产生很大的气力，由于气体的压缩比与液体相比大的多，因而当气泡存在时，你将察看到瞬间的流速降低和系统压力下降。
假如这个气泡充分大，液相泵将不能输送任何溶剂，而且假如压力低于预先设定的压力低限，泵将停止工作。
有些泵设计可以很好地排出气泡，而也有一些泵设计当气泡存在时将停止运转。
当一个气泡通过输液泵时，由于系统压力大，气泡通常会溶解在流动相溶液中，随流动相通过柱子。
但是到达检测器流通池时系统压力又恢复到了大气压，因而气泡可能在检测器流通池中又显现，在色谱图上会显现不规律的毛刺。
为解决这个问题，有些仪器公司设计一个反压掌控器，这样可以在检测器出口供应充分的压力保持气泡始终溶解在流动相中直到它们流出检测器。
当然，这个压力不能超过流通池所能承受的压力极限，否则可能损坏检测器。
紫外/可见光（UV/VIS）检测器的液相色谱图中的噪音毛刺通常是气泡进入并通过流通池的征兆。
有些检测器对空气的存在也特别敏感，但表现出的征兆与UV/VIS不同，例如有报导说，当使用荧光（FL）检测器时，流动相中溶解氧的存在可能会使一些化合物失去荧光性。
高效液相色谱提纲
高效液相色谱提纲色谱的基础知识第一章色谱分析法概述一、色谱分析法发展简介二、色谱法分类1、按两相状态分类2、按操作形式分类3、按分离原理分类三、HPLC与其他方法的比较1. 色谱法与精馏、萃取分离比较2. 色谱法与光谱、质谱分析方法比较3. 高效液相色谱与经典色谱的比较4. 液相色谱与气相色谱的比较四、色谱法特点五、现代色谱法应用领域六、有关色谱主要期刊与书籍第二章色谱分析法的理论基础一、色谱流出曲线二、色谱图中的基本术语三、分配平衡四、色谱法的基本理论五、色谱法基本分离方程第三章色谱定性分析和定量分析一、定性分析二、定量分析高效液相色谱的知识第四章高效液相色谱仪第五章色谱分离系统一、液相色谱分离原理及分类（一）分离原理（二）高效液相色谱法的主要类型二、高效液相色谱的固定相1. 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类2.高效液相色谱固定相按孔隙深度分类3. 高效液相色谱固定相以化学组成来分类三、流动相1.对流动相溶剂的要求：2. 流动相及流动相的极性3. 流动相的组成四、色谱柱1. 色谱柱的构型2. 色谱柱寿命第六章液固色谱法和液液色谱法一、液一固吸附色谱法(LSAC)1．分离原理 2.固定相 3.流动相二、液一液分配色谱法（LLPC）1．分离原理 2.固定相 3.流动相第七章化学键合相色谱法一、化学键合固定相二、反相键合相色谱法三、正相键合相色谱法四、离子性键合相色谱法第八章离子交换和离子色谱法一、离子交换色谱法1．离子交换色谱原理2．固定相3．流动相二、离子色谱法1.离子色谱法原理2.离子色谱具有以下优点3.离子色谱装置类型4.离子色谱的应用第九章体积排阻色谱法高效液相色谱同时测定食品中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠、维生素C高效液相色谱同时测定药品中的苯甲酸与水杨酸样品处理、条件优化及应用第十章色谱分析样品处理一、样品的采集二、常用样品制备技术（一）溶剂萃取***1. 液-液萃取液-液萃取新技术——液相微萃取2. 液-固萃取3. 液-气萃取（溶液吸收）4. 萃取溶剂的选择（二）蒸馏1. 简单蒸馏2. 分馏3. 减压蒸馏4. 水蒸气蒸馏（三）固相萃取***1. 固相萃取的模式及原理2. 固相萃取的常用吸附剂3. 固相萃取的装置及操作程序4. 固相萃取技术的应用（四）膜分离（五）衍生化技术*（六）其它样品制备技术*1. 超临界流体萃取2. 微波萃取技术第十一章衍生化技术及浓缩柱一、衍生化技术（一）按衍生化反应分类1.衍生化反应满足条件2. 按衍生化反应类别分类（二）按衍生化的方式分类1. 柱前衍生2. 柱后衍生二、浓缩柱第十二章高效液相色谱分离条件的优化及建立分析方法的一般步骤一、高效液相色谱分离条件的优化（一）高效液相色谱中色谱参数的相关性1. 色谱参数的分类2. 色谱参数的相关性（二）色谱分离条件优化标准的选择1. 难分离物质对的峰对分离优化标准2. 整体色谱图的优化标准二、建立HPLC分析方法的一般步骤（一）样品的性质及柱分离模式的选择1. 样品的溶解度2. 样品的分子量范围3. 样品的分子结构和分析特性（二）分离操作条件的选择1. 容量因子和死时间的测量2. 色谱柱操作参数的选择3. 样品组分保留值和容量因子的选择4. 相邻组分的选择性系数和分离度的选择第十三章高效液相色谱法的实验技术和分析应用一、高效液相色谱法的实验技术1. 溶剂的纯化技术2. 色谱柱的装填技术3. 色谱柱的平衡、保护与清洗、再生技术二、HPLC法的分析应用第十四章液相制备色谱。
高效液相色谱仪的操作流程和注意事项
高效液相色谱仪的操作流程和注意事项引言：高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种重要的分析仪器，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
掌握正确的操作流程和注意事项，对保证分析的准确性和结果的可靠性至关重要。
下面将详细介绍高效液相色谱仪的操作流程和注意事项。
一、仪器准备在开始操作高效液相色谱仪之前，需要进行一些准备工作。
首先，检查仪器是否正常工作，例如电源是否正常接通，各个模块是否连接牢固等。
其次，确保色谱柱处于良好的工作状态，即没有泄漏和堵塞等问题。
最后，根据需要，选择合适的检测器，并校准相应的参数。
二、样品准备和进样样品的准备是操作高效液相色谱仪的关键一步。
首先，根据样品的性质选择合适的溶剂体系，并将样品完全溶解。
其次，为了提高分析的准确性，通常需要对样品进行预处理，例如磷酸酯酶的样品需要经过脱磷酸处理。
最后，将样品装入进样瓶中，根据仪器的要求设定进样量。
三、流动相的选择和准备流动相是高效液相色谱仪中的关键因素之一。
在选择流动相时，需要考虑样品的性质以及分析的目的。
常见的流动相包括有机溶剂、水以及它们的混合溶液。
在选择后，需要准备流动相，并进行除气处理以去除气泡。
此外，还要注意流动相的质量，例如pH值、浓度等。
四、色谱条件的设置色谱条件是操作高效液相色谱仪的关键之一。
根据分析的目的和样品的性质，需要设置合适的参数，例如流速、温度、梯度等。
在设置前，需要根据样品性质选择合适的色谱柱，并设定相应的温度以优化分离效果。
此外，还需要根据检测器的要求设定相应的参数。
五、数据采集和结果分析在操作高效液相色谱仪时，需要进行数据采集和结果分析。
首先，确保数据采集系统正常工作，并根据仪器的要求进行设定。
其次，启动数据采集并进行监控，及时记录实验过程中的各项指标。
最后，对采集的数据进行处理和分析，例如峰面积的计算、峰形的分析等。
注意事项：1. 严格按照操作流程进行操作，避免任意更改设置。
高效液相色谱十大步骤
高效液相色谱十大步骤
1.样品准备：将待测样品制备成合适的溶液，通常需要进行提取、纯化或稀释等处理。
2.色谱柱选择：根据待测化合物的特性选择合适的色谱柱，如
反相色谱柱、离子交换色谱柱等。
3.溶剂选择：根据待测化合物的亲水性或疏水性选择合适的溶剂，以保证化合物在柱上有足够的保留时间。
4.样品注入：使用自动进样器或手动注射器将样品注入色谱柱。
5.溶剂梯度：设定一定的梯度条件，根据溶剂极性的变化来分
离不同化合物。
6.检测器选择：根据待测化合物的特性选择合适的检测器，如
紫外检测器、荧光检测器等。
7.梯度程序设定：根据待测化合物的特性设定合适的梯度程序，如流速、溶剂比例等。
8.流速调控：根据实际需要调整色谱柱的流速，以控制分离的
时间和峰形。
9.峰识别和定量：根据峰的保留时间、峰面积或高度来识别和
定量待测化合物。
10.数据分析和报告：对得到的数据进行分析处理，生成色谱图和报告，对结果进行解释和总结。
高效液相色谱法知识汇总大全集.总结
高效液相色谱法知识汇总大全集（最新最值得收藏的资料整理）HPLC应用一、样品测定1．流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜）。
所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。
弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。
2．样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。
某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。
3．记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。
4．进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数HPLC系统采用定量环（10ml、20ml 和50ml），因此应注意进样量是否一致。
（可改变样液浓度）5．计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。
6．仪器的使用：①流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。
有请重新滤过。
②柱在线时，增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。
否则会使柱床下塌，叉峰。
柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。
③安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。
④样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。
⑤测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。
如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。
高效液相色谱知识
⑤分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度 快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品 甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。
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三、HPLC 的组成
• HPLC系统一般由高压输液泵、进样器、OL Apple系列 色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成 。
• 一、高压输液系统
1、泵的性能 ①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至
关重要；②流量范围宽，分析型应在0.1~10 ml/min范 围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；③输出 压力高，一般应能达到150~300 kg/cm2；④液缸容积 小；⑤密封性能好，耐腐蚀。
2、梯度洗脱
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②高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到 最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能 高出许多倍。
③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数 量级。
④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高 效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、 热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。
• 梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高 压梯度（内梯度）。
• 两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多 种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯 形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进 行梯度洗脱。
• 在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不 断变化，因此带来一些精选特20殊21版问课件题，必须充分重视： 5
高效液相色谱知识
• 一、液相色谱的原理 • 二、HPLC的特点
• 三、HPLC 的组成 • 四、流动相 • 五、缓冲溶液的作用 • 六、梯度洗脱的流动相
高效液相色谱仪的基本操作和使用
高效液相色谱仪的基本操作和使用1.准备工作：-确保高效液相色谱仪的设备和耗材齐全。
-检查色谱柱，确保色谱柱选择正确并在有效使用期内。
-检查溶剂的质量和纯度，确保溶剂无杂质。
-设置所需的操作温度。
2.连接高效液相色谱仪：-将进样器连接到色谱柱，并将进样针座固定住。
- 将固相柱插入色谱柱座，然后将电导/ UV-Vis检测器连接到色谱柱座。
3.样品制备：-将待测样品溶解于合适的溶剂中，并进行必要的前处理步骤（如过滤、稀释等）。
-对于固体样品，可以采用适当的溶解方法，如超声波处理等。
4.设置色谱仪参数：-开启电源，等待色谱仪预热稳定。
- 打开色谱仪的软件，并设置所需的参数，包括流速、波长（对于UV-Vis检测器）、进样量、运行时间等。
5.校准仪器和程序：-制备标准品溶液，并用标准曲线法对色谱仪进行校准，以确保仪器输出的结果准确可靠。
-确认色谱仪的波长和检测器的线性范围，并根据需要进行修正。
6.进样：-打开进样器盖，用吸尘器吸出残液，然后用纯溶剂将针清洗干净。
-分别进行空白样品和待测样品的进样，保证进样量准确。
7.开始运行：-在软件界面上点击“开始运行”，观察色谱图输出的曲线形状和峰的出现。
-根据需要，可以进行多次重复运行。
8.结果分析：-对于定性分析，根据色谱图的特征峰形状、保留时间和波长，进行物质的鉴别。
-对于定量分析，根据标准曲线和色谱图的峰面积，计算出待测样品中目标物质的浓度。
9.清洗仪器：-运行结束后，关闭仪器，并将进样器和色谱柱进行清洗。
10.维护：-定期检查仪器的性能和功能是否正常。
-及时更换色谱柱、固相柱和检测器，确保仪器的正常运行。
-做好仪器维护和维修记录。
高效液相色谱（HPLC）操作规程
高效液相色谱（HPLC）操作规程一操作1.准备工作⑴流动相的准备应根据实验选择合适的流动相，所有流动相原则上应选择HPLC级别，水应选择超纯水，并应保持新鲜。
所有流动相在进行实验前应经过相应的脱气处理，脱气时间应根据流动相的量相应增加，但一般超声脱气不应少于20min。
在实验过程中应保证足够的流动相，流动相的量与流速、洗脱时间等有关，应根据具体情况进行准备。
⑵样品的准备对于待测的样品，在进样之前应经过滤膜过滤，根据样品的不同选择不同种类、不同直径的滤膜。
2. 排气打开purge阀，键入stop→prime，直到无气泡停止stop。
B泵同样操作。
关闭purge阀。
3. 开机打开电脑主机和显示器，点击Galaxie，进入工作站。
选择系统，点击Agilent HPLC.点击overview，可观察仪器各部分状态。
打开泵及检测器的电源。
二 分析方法建立1.进入工作站系统界面。
点击数据，文件→新建→方法，出现视窗，点击前进即可。
键入方法名和相应描述→点击ok后出现方法文档。
2.210的设定点击控制→210图标→Elution。
选择流动相A和B的种类。
Compressibility、Pressure Constant以及Refill Time属于内置参数无需设定。
设置A、B流动相的比例，通过改变B的比例设定。
如需梯度洗脱，则根据方法对Equilibrium Time 和Hold Time进行设定。
点击Misscellaneous。
Start Mode选择Inject Trigger on Pump A。
End of Sequence 选择Leave Pump on。
210设定结束。
3.325的设定点击325图标，选择Signal。
其中Detector Bunch Rate建议设置成2（10Hz），Noise Monitor Length建议设定成64，Response Time建议设定0.5。
根据方法设定相应波长。
高效液相色谱使用方法
高效液相色谱使用方法一、流动相准备将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解性不好，可分成两种。
流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。
二、开机首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打；打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。
三、抽气抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。
抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。
四、调节流动相比例与流速在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。
五、2410示差检测器的使用1、打开2410示差检测器开关2、调整检测器内、外温度3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。
六、2487紫外检测器的使用1、打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。
2、设置检测波长3、预热30分钟左右，即可注样测定。
试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定一、样品准备取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。
配80％甲醇，冰箱冷冻。
二、提取样品放入预冷研钵，加l0ml 80％的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。
小烧杯放入冰箱(0～4℃)冷藏14小时以上。
三、过滤取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180％甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多，则用10000g离心l0~12min，上清液转入冻干瓶中。
四、浓缩将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰)，然后用2m1 80％的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。
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高效液相色谱操作知识（一）高压恒流泵的维护注意事项泵的密封圈是最易磨损的部件，密封圈的损坏可引起系统的许多故障，要注意保养和定期更换。
应采取下列措施以延长使用寿命：绝对不允许在没有流动相的或流动相还没有进入泵头的情况下启动泵而造成柱塞杆的干磨。
每天使用后应将整个系统管路中的缓冲液体冲洗干净，防止盐沉积，整个管路要浸在无缓冲的溶液或有机溶剂中。
长期不用也要定期开泵冲洗整个管路。
要用HPLC级试剂输液管前端要用烧结不锈钢沉子过滤流动相。
要注意防止管路阻塞造成压力过高而损坏仪器。
压力下限应设置在0.5~1MPa，以防止储液器中的流动相被抽干或严重渗漏而引起柱塞的干磨有柱后清洗功能的高压恒流泵还要注意保持清洗液，否则将失去柱后清洗效果。
(二)流动相使用的注意事项必须使用HPLC级或相当于该级别的流动相，并要先经0.45?m薄膜过滤。
过滤后的流动相必须经过充分脱气，以除去其中溶解的气体（如02），如不脱气易产生气泡，增加基线噪声，造成灵敏度下降，甚至无法分析。
几种脱气方法比较：1、氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好但成本高。
2、加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。
3、抽真空脱气法：易抽走有机相4、超声脱气法：一种较为常见的脱气法。
流动相放在超声波容器中，用超声波震荡10~15 分钟，此法效果并不太好但操作简单。
如果管路中使用peek树脂部件，请不要使用下列流动相：浓硫酸、浓硝酸、二氯乙酸、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿和二甲基亚砜特别注意HPLC使用过后的系统清洗：含有缓冲盐溶液的流动相的清洗方法：1、先用100%的纯水冲洗，打开排放阀，用3~5ml/min的流量，洗二十分钟左右后停泵。
此举主要是针对吸液系统、泵头、进出口单向阀等体积较大的空间的清洗2、再用5：95的甲醇/水清洗整个系统，关闭排放阀，用1ml/min的流量，洗30~60分钟后停泵。
此举主要是用水清洗整个系统中的盐，用5%的甲醇主要是为了保护色谱柱。
3、最后用100%的甲醇清洗整个系统，用1ml/min的流量，洗2分钟左右，然后关机。
如果流动相中不含盐，则使用上述第三步清洗即可。
(三)流动相的更换在分析过程中，有时需要更换流动相进行分析。
一定要注意前一种使用的流动相和所更换的流动相是不是能够相溶。
如果前一种使用的流动相和所更换的流动相不能够相溶，那您就要特别注意了。
要采用一种与这二种需更换的流动相都能相溶的流动相进行过滤、清洗。
较为常用的过滤流动相为异丙醇，但实际操作中要看具体情况而定，原则就是采用与这二种需更换的流动相都能相溶的流动相。
一般清洗时间为30~40分钟，直至系统完全稳定。
如不进行以上“特别注意”上述步骤的操作，将会导致系统管路阻塞。
严重时将引起流通池污染堵塞，不得不更换流通池。
用户就要承担不必要的损失了。
储液器的注意事项：保持流动相储液器的清洁是保证仪器正常使用的关键。
要使用HPLC级的溶剂，对试剂含有缓冲盐及非HPLC级的流动相一定要用0.45?m过滤器除区去其中的微量物质。
仪操作步骤1）、过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。
2）、对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
3）、打开液相色谱工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。
4）、进入液相色谱仪控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
5）、有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。
冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。
冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。
6）、调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。
点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。
7）、设计走样方法。
点击file，选取se-lect users ａnd methods，可以选取现有的各种走样方法。
若需建立一个新的方法，点击new method。
选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。
选完后，点击protocol。
一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。
8）、进样和进样后操作。
选定走样方法，点击start。
进样，所有的样品均需过滤。
方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。
全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。
9）、关液相色谱仪时，先关计算机，再关液相色谱。
10）、填写登记本，由负责人签字。
注意事项：1）、流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。
脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。
2）、柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。
3）、所有过柱子的液体均需严格的过滤。
高效液相色谱仪(Agilent 1100)操作注意事项---流动相：1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；2、水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质；3、使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相；A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。
样品：1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；2、用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍；色谱柱：1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等；2、使用符合要求的流动相；3、使用保护柱；4、如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。
5、色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存；6、不要高压冲洗柱子；7、不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；使用过程中注意轻拿轻放。
实验前准备事项1.1 对照品的配制1.1.1 配制方法取干燥情况下的对照品（注意是否吸潮），每次称取量不得少于5mg，置一定容量量瓶中，加入少量溶剂，超声溶解冷却后再定容、混匀（高浓度）。
再用移液管吸取1~2ml至先配制成高浓度的对照品，一定容量量瓶中，加入溶剂定容、混匀，即得（低浓度）。
配置后的对照品均需用封口膜封好。
1.1.2 配制浓度严格按照标准配制对照品浓度（低浓度），不可超过或低于一倍。
1.1.3 所需玻璃仪器和容器所需玻璃仪器和容器，尽量选用棕色容量瓶进行配制。
每次临用前需要用纯水清洗干净后，再用无水乙醇冲洗三次，阴（烤）干、冷却后方可使用。
1.1.4 标签配制好的对照品标签上应注明：品名、批号、取样量、稀释倍数（浓度）、配制日期。
1.1.5 干燥器干燥器中的干燥剂每月至少处理一次。
1.2 供试品的制备1.2.1 取样方法成品：取10袋装量差异项下的样品，按照相关品种标准含量测定项下有关要求，精密称取两份，进行平行实验。
药材：取样袋中药材全部打粉至规定目数（一般为3～4号筛），按照05年版中国药典相关品种含量测定项下有关要求，精密称取两份，进行平行实验。
1.2.2 称样要求用万分之一天平称取，使用中注意天平稳定。
1.2.3 量取要求均用移液管量取或刻度量管。
1.2.4 所需玻璃仪器和容器所需玻璃仪器和容器，每次临用前需要用纯水清洗干净后，再用无水乙醇冲洗三次，阴（烤）干、冷却后方可使用。
2 实验中注意事项2.1 实验仪器的准备2.1.1 仪器安装后是否存在漏液现象？压力是否稳定？柱子是否安反？2.1.2 检查完毕后，打开电脑、N2000工作站电源开关后，再打开泵电源开关、控制面板上泵开关。
先用色谱甲醇冲洗柱子，等待机器平稳后，再打开检测器电源开关、控制面板上检测器开关。
30分钟后方可进针做实验。
2.1.3 打开电脑桌面上的N2000在线工作站，选择通道，设定保存路径、波长（注意控制面板上同样需要设置）等实验信息。
2.1.4 设定完毕后，点击数据采集、查看基线、零点校正后，注意观察电脑左下角电压值、时间值波动是否正常？电压不对：灯是否开启？如果开启还有问题，就重新开启工作站或检测器。
时间不对：调节采样频率（应为10帧/秒）2.2 流动相的配制所需玻璃仪器和容器，每次临用前需要用纯水清洗干净后，再用无水乙醇冲洗三次，阴（烤）干、冷却后方可使用。
先抽滤、后超声（10-15分钟）2.3 测定法要求2.3.1 样品进样前先混匀，再用0.45?m滤膜过滤，再混匀后进样。
2.3.2 对照品与样品进样量要尽量保持一致，样品峰面积与对照品峰面积尽量保持一致（不要超过一倍，可适当调整进样量或稀释倍数）。
2.3.3 注意系统评价：理论板数（达到标准要求）、分离度（大于1.5）、拖尾因子（0.95-1.05之间）。
2.3.4 平行进针要求RSD<2％。
2.3.5 进样针每次改进不同样品或对照品时，需用色谱甲醇涮洗五次以上，涮洗位置要超过进样量位置。
2.4 仪器使用过程中注意事项注意机器异常情况的发生（声音），压力是否过高（超过200Bar不可再做实验），流动相是否流空、废液瓶是否已满等等。
2.5 实验完毕后可用甲醇冲洗一小时，如果流动相中含有酸或缓冲盐，则先用新鲜纯水冲洗0.5小时，再用甲醇冲洗一小时。
2.6 人参、西洋参等含量测定做波长小于240nm的样品时，注意机器、柱子一定要加长冲洗时间，乙腈则改用进口乙腈。
2.7 保留时间改变的样品用于实验时间加长，导致对照品与样品保留时间不一致时，在实验最后加进一针对操作过程：1、开机操作：（1）、打开电源，用Harb相连接时，注意Harb电源，打开计算机，打开Bootp Server（一般启动时已打开）；（2）、自上而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信号时（有六行字符），打开工作站（先打开On line）；（3）、打开冲洗泵头的10％异丙醇溶液的开关（需用针捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量为准；（4）、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，及时加液；（5）、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。
2、先以所用流动相冲洗系统一定时间（如所用流动相为含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐流动相），正式进样分析前30min 左右开启D灯或W灯，以延长灯的使用寿命；3、建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的Method，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果；4、使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡；5、溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤；6、实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路30分钟以上，再用甲醇冲洗。