第四章抗体制药
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【药学课件】生物技术制药(4)
第四章 抗体制药
生物技术制药——4
.
第一节 概述
• 1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒 素，建立了血清疗法，开创了抗体制药。
• 1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为 白蛋白，α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性 主要存在于γ球蛋白组分。
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第一节 概述
• 抗体（antibody,Ab）是指能与相应抗原 特异性结合具有免疫功能的球蛋白。
.
2、体外免疫：不能用体内方法或抗原免 疫原性极弱且引起免疫抑制时。
• 抗原量少（＜10μg）、免疫期短（4-5d）、 干扰因素少、杂交瘤细胞株不稳定。
• 4-8W BALB/c小鼠脾脏制成细胞悬液，加 Ag达0.5-5μg/ml，培养4-5d（370C、 5%CO2），分离脾细胞，细胞融合。
.
淋巴细胞 （致敏动物脾细胞）
3、亲和力测定 4、特异性、纯度、识别抗原的相对分子量等
• 单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源 稳定、可大量生产等特点，为抗体制备和应 用提供了全新的手段，还促进了基础和临床 医学的发展。
.பைடு நூலகம்
单克隆抗体的应用：
• 单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要 用于疾病的诊断和治疗。
• 单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原， 辅助临床诊断。用放射性核素标记单克隆 抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。
p3-X63-Ag8.653 P3.653 BALB/c 8-Ag
——
SP2/0-Ag14 SP2/0 BALB/c 8-Ag
——
Fast-Zero FO BLAB/c 8-Ag Y3-Ag1,2,3 Y3 Lou 8-Ag
—— κ链
YB2-3.0-Ag20 YB2 (LouAO)F1 8-Ag
生物技术制药——4
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第一节 概述
• 1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒 素，建立了血清疗法，开创了抗体制药。
• 1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为 白蛋白，α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性 主要存在于γ球蛋白组分。
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第一节 概述
• 抗体（antibody,Ab）是指能与相应抗原 特异性结合具有免疫功能的球蛋白。
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2、体外免疫：不能用体内方法或抗原免 疫原性极弱且引起免疫抑制时。
• 抗原量少（＜10μg）、免疫期短（4-5d）、 干扰因素少、杂交瘤细胞株不稳定。
• 4-8W BALB/c小鼠脾脏制成细胞悬液，加 Ag达0.5-5μg/ml，培养4-5d（370C、 5%CO2），分离脾细胞，细胞融合。
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淋巴细胞 （致敏动物脾细胞）
3、亲和力测定 4、特异性、纯度、识别抗原的相对分子量等
• 单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源 稳定、可大量生产等特点，为抗体制备和应 用提供了全新的手段，还促进了基础和临床 医学的发展。
.பைடு நூலகம்
单克隆抗体的应用：
• 单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要 用于疾病的诊断和治疗。
• 单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原， 辅助临床诊断。用放射性核素标记单克隆 抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。
p3-X63-Ag8.653 P3.653 BALB/c 8-Ag
——
SP2/0-Ag14 SP2/0 BALB/c 8-Ag
——
Fast-Zero FO BLAB/c 8-Ag Y3-Ag1,2,3 Y3 Lou 8-Ag
—— κ链
YB2-3.0-Ag20 YB2 (LouAO)F1 8-Ag
第四章 抗体制药ppt课件
解决问题的方法或途径——基因工程技术
1984年报道了人—鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、 单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消 除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗 体分子的1/80～1/3。
第一节 单克隆抗体（Monoclonal Antibody） 的制备
1、单克隆抗体与多克隆抗体
单克隆抗体（McAb ）：如果把能分泌某种特异抗体的 一个B型淋巴细胞分离出来，通过纯种培养，则只产生一种 抗体，可以特异性地与体内一种抗原结合，这种单一的特异 抗体即为单一B细胞克隆抗体，即单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。
2、制备单克隆抗体的一般流程
3、杂交瘤细胞的制备与筛选流程图
BALB/C小鼠
注射矿物油诱发 骨髓瘤细胞 TK或HGBRT缺陷
BALB/C小鼠
注射某种抗原免疫 脾细胞 B淋巴细胞
融合（PEG） 分装于多孔培养板培养（HAT） 亲株死亡
杂交瘤细胞生长繁殖
鉴定单克隆抗体 选出优良杂交瘤细胞， 用于生产或冷冻保藏
二、杂交瘤细胞的制备
1、抗原与动物免疫的获得
免疫方法：体内免疫和体外免疫 抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原 免疫动物：BALB/c小鼠和Lou大鼠
多克隆抗体：动物细胞的免疫系统接受到一个新的抗原 时，并不是对抗原的所有表面都作出反应，而只对抗原中特 异的抗原决定簇产生应答，一般一个抗原有多个抗原决定簇， 可以同时诱导产生多个B型淋巴细胞的增生。机体在同一时间 都是接受多种外界的抗原物质的，使得B型淋巴细胞增生的种 类也有多种，造成不同种B型淋巴细胞同时存在于体液中，由 此产生的抗体也是多种，所以从体液中分离提取的多种抗体 也是由多种B型淋巴细胞产生出来的，是多种抗体的混合物。 由B细胞分裂而形成的细胞群（是同质的），称为一个克隆。 因此存在于体液中各种抗体的总和可称为多种B细胞克隆抗体， 简称多克隆抗体（polyclonal antibody）。
4. 抗体工程制药课件
• 宋朝（十一世纪）时吸入天花痂粉预防 天花 ；
• 明代（公元十七世纪七十年代左右）接 种“人痘”，预防天花；
• 十八世纪后叶，英国乡村医生Jenner种 “牛痘”预防天花。
病原菌致病与疫苗
• 十九世纪中叶，显微镜的改进导致病原菌的 发现；
• 1850年在羊的血液中看到炭疽杆菌； • Pasteur证明实验室培养的炭疽杆菌能使动物
第四章 抗体工程制药
教学目标：掌握抗体药物制备的基本原理和技术。 教学要求：了解免疫现象和抗体药物制备的发展简史，了
解基因工程抗体和抗体工程技术的基本内容；理解抗 体药物的结构和生物学活性与单克隆抗体靶向制剂的 研究意义；掌握单克隆抗体的基本概念与制备原理和 鼠源性单克隆抗体的改造方法。 教学重点：单克隆抗体的基本概念与制备原理和鼠源性单 克隆抗体的改造方法。 教学难点：抗原表位的概念、单克隆抗体的制备原理。
器官移植后的排斥反应是宿主T细胞被外来移 植物抗原刺激活化之后所介导的免疫反应。而T 细胞的完全活化必须具备三个外来信号，即由 抗原提呈细胞（APC）提供的移植物抗原（第 一信号）和共刺激因子（第二信号）以及T细胞 自分泌或旁分泌的促生长因子（第三信号）。 这三个信号的糖蛋白分子都必须与T细胞表面的 受体或配体结合，才能传递活化信号，引起T细 胞的活化与克隆增殖。
免疫是机体对异种、异体及自身物质所产生的反应，即机 体“自我识别，排除异己”，以达到自身稳定的一种复杂的 生理性保护，并且与人体的胚胎发育、疾病发生、衰老等一 系列的生命过程有密切关系，是人体进化的结果。
免疫学是研究人类和实验动物体内、外免疫反应的本质及 其变化规律的科学。
免疫系统是由淋巴器官（胸腺、骨髓、淋巴结、脾和扁桃 体）、淋巴组织以及免疫细胞（淋巴细胞、浆细胞和巨噬细 胞）借助血液和淋巴循环相互联系而组成的功能系统。
优选第四章抗体制药
2020/8/7
6
多抗与单抗
多克隆抗体：病原微生物含有多种抗原决定簇的 抗原物质，对其产生的抗体也是多种抗体的混合 物，称为多克隆抗体。
单克隆抗体：针对一个抗原决定簇的抗体，又是 单一的B淋巴细胞克隆产生的、高度特异、均一、 来源稳定、可大量生产的抗体。
7 2020/8/7
抗原 免疫
传统抗血清
11 2020/8/7
基因工程技术为解决问题提供了可能
基本消除了单克隆抗体的鼠 源性（免疫原性）,鼠源氨基 酸只占完整抗体分子的 1/80~1/3，只保留同抗原特 异性结合的活性。
制备出改形抗体、单链抗体、 单域抗体、最小识别单位等 很多类型的抗体或抗体单位。
12 2020/8/7
二、抗体工程发展历程及趋势
双特异抗体 2个
Fc融合蛋白 7个
2008 Cimzia
2009 Stelara Sinponi
2010 Actemra Numax
2011 Benlysta Yervoy Adcetris
2012 Perjeta Eylea
2013 Kadcyla Gazyva
2014 Cyramza Sylvant Entyvio Keytruda
Biogen-IDEC
8.678
Non-Hopkin’s Lymphoma
4
Enbrel
Amgen
4
Lantus (insulin glargine)
Sanofi
6
Avastin
Roche/Genentech
8.538 7.279 6.957
RA、牛皮癣 I/II型糖尿病 结肠癌，NSCLC
7
Herceptin
第四章 抗体制药1
1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白 1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白 分离为白蛋白、甲种（ ）、乙种 乙种（ 分离为白蛋白、甲种（α）、乙种（β）、 丙种（ 球蛋白， 丙种（γ）球蛋白，并证明抗体活性主要 存在于丙种（ 球蛋白组分。 存在于丙种（γ）球蛋白组分。 在一段时间内， 在一段时间内，丙种球蛋白成为抗体的 代名词。 代名词。
IgA抗体进入身体的黏膜表面，包括呼吸、消 抗体进入身体的黏膜表面，包括呼吸、 抗体进入身体的黏膜表面 生殖等管道的黏膜，中和感染因子。 化、生殖等管道的黏膜，中和感染因子。还可以 通过母乳的初乳把这种抗体输送到新生儿的消化 道黏膜中，是在母乳中含量最多， 道黏膜中，是在母乳中含量最多，最为重要的一 类抗体 IgE抗体的尾部与嗜碱细胞、肥大细胞的细胞 抗体的尾部与嗜碱细胞、 抗体的尾部与嗜碱细胞 膜结合。当抗体与抗原结合后， 膜结合。当抗体与抗原结合后，嗜碱细胞与肥大 细胞释放组织胺一类物质促进炎症的发展。 细胞释放组织胺一类物质促进炎症的发展。这也 是引发速发型过敏反应的抗体； 是引发速发型过敏反应的抗体； IgD抗体的作用还不太清楚。它们主要出现在 抗体的作用还不太清楚。 抗体的作用还不太清楚 成熟的B淋巴细胞表面上 可能与B细胞的分化有 淋巴细胞表面上， 成熟的 淋巴细胞表面上，可能与 细胞的分化有 关。
一个B 一个B细胞针对一个抗原决定簇所产生 单克隆抗体。 的一种特异性抗体，称为单克隆抗体 的一种特异性抗体，称为单克隆抗体。 单克隆抗体具有高度特异性 均一性、 高度特异性、 单克隆抗体具有高度特异性、均一性、 来源稳定、可大量生产等特点 等特点， 来源稳定、可大量生产等特点，为抗体制 备和应用提供了全新的手段， 备和应用提供了全新的手段，还促进了基 础和临床医学的发展。 础和临床医学的发展。
4.抗体制药
围从150,000到950,000道尔顿。分五类：
• IgG在血清中含量最高，达75~80%,是抗感染
的主要抗体;
• IgM是五类免疫球蛋白中分子量最大的，为
五聚体,是对一个抗原作出反应时产生的
第一个抗体；
• IgA在黏膜表面、乳腺、泪腺形成，主要参
与局部的免疫反应;
免疫球蛋白
• IgD在血清中含量很低;
2、杂瘤细胞的选择性培养
常用的选择培养基为HAT培养基。 次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A能阻断DNA合成)、
胸腺嘧啶(T)。 脾细胞具有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
(HGPRT),因此脾-瘤融合的杂交瘤细胞可利用 HGPRT酶,用次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)合成 DNA,使杂交瘤细胞得以生长。
抗体药物市场销售额
160 140 120 100
80 60 40 20
0
年份 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2011
全球有超过200家上市或未上市公司正在研发
用于临床诊断和治疗的单克隆抗体
正在进行临床试验的抗体公司（38家）：
Abgenix Alexion Pharm Altarex Applied Molecular Evolution BASF Biogen BioTransplant CAT(Cambridge Ab Tech) Celltech Centeon Centocor (Johnson & Johnson)
纯化单克隆抗体流程(大鼠)
三.单克隆抗体药物的现状
250多种抗体类药物在临床试验中
－1/3已进入三期临床 －1/4已通过临床III期试验
美国市场上有13种治疗用的抗体药物 抗体药物的销售额
生物制药技术-第四章-抗体制药(1,2,3)
胞都是次黄嘌呤鸟瞟岭磷酸核糖转移酶 (HGPRT)缺乏株，脾细胞内却有这种酶，因此脾-瘤融合的杂交瘤细 胞 可利用HGPRT，用次黄瞟岭(H)和胸腺嘧啶(T)合成DNA，使杂交瘤细胞 得以生长。选择 性培养的常规方法是将融合的细胞悬浮于HAT的培养 液(表4 - 2)中，加入到含有饲养细胞 的96孔板内.根据情况每2~3 d 换液一次。换液时吸去l/2~2/3培养液，加入等量的新鲜 培养液。在 融合后7 d内用HAT培养液，杀死瘤瘤融合细胞后，第七天至第十四天 改用HT 培养液，第十四天以后用普通的RPMl1640完全培养液(表4 3)，从融合后8~9d就可对所 有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测， 筛选出产生抗体的阳性克隆。
因此，抗体是指能与相应抗原特异性综合的具有免疫功能的球 蛋白。它是机体免疫系统受 抗原物质刺激后，B淋巴细胞被活化、 增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。20 世纪60年 代初期.发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。患 者血清中也出现 同抗体分子结构类似的球蛋白。因此，将具有抗体 活性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为 免疫球蛋白 (immunoglobulin，Ig)。 显然，Ig是化学结构上的概念，而抗体是生物学功能上的概 念。也 就是说，所有抗体均是Ig，但并非所有Ig分子都具有抗体活性。由 于病原微生物是含有 多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制 剂也是多种抗体的混合物.故称多克隆抗体， 即针 对多种抗原决定 簇的抗体。这些抗体制剂在应用过程中经常发生非特异性交叉反应 而出现假阳 性结果，必须经多次吸收试验才能得到所谓的精制单价 血清，用于临床病原学诊断，如痢疾杆菌 属诊断血清和沙门氏菌属 诊断血清等。虽然称为精制单价血清，但仍然难免出现假阳性结果; 而且其产量很低.很难满足临床治疗和诊断上的需要。
因此，抗体是指能与相应抗原特异性综合的具有免疫功能的球 蛋白。它是机体免疫系统受 抗原物质刺激后，B淋巴细胞被活化、 增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。20 世纪60年 代初期.发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。患 者血清中也出现 同抗体分子结构类似的球蛋白。因此，将具有抗体 活性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为 免疫球蛋白 (immunoglobulin，Ig)。 显然，Ig是化学结构上的概念，而抗体是生物学功能上的概 念。也 就是说，所有抗体均是Ig，但并非所有Ig分子都具有抗体活性。由 于病原微生物是含有 多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制 剂也是多种抗体的混合物.故称多克隆抗体， 即针 对多种抗原决定 簇的抗体。这些抗体制剂在应用过程中经常发生非特异性交叉反应 而出现假阳 性结果，必须经多次吸收试验才能得到所谓的精制单价 血清，用于临床病原学诊断，如痢疾杆菌 属诊断血清和沙门氏菌属 诊断血清等。虽然称为精制单价血清，但仍然难免出现假阳性结果; 而且其产量很低.很难满足临床治疗和诊断上的需要。
抗体工程制药 ppt课件
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29
4.3 鼠源性单克隆抗体的改造
杂交瘤单克隆抗体均为鼠源性 大量应用于人体可产生人抗鼠抗体 改造鼠源性单克隆抗体的目的： 降低免疫原性 降低相对分子质量，增加组织通透性
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30
一、免疫球蛋白的结构
B淋巴细胞在抗原刺激下增殖分化为浆细胞，
浆细胞产生能与相应抗原发生特异性结合的
植时的抗排斥反应。在这个时期，抗体药物的研制和 应用给人们治疗疾病带来了很大的期望。20年后的今 天，单克隆抗体药物已经成为生物医药最重要的发展 领域之一，到2006年，FDA共批准23个治疗性单克隆抗
体药物。
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27
OKT3单抗主要和T细胞表面的CD3抗原结合，
而CD3分子是与T细胞受体（TCR）紧密相联在一
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9
自然自动免疫
在自然条件下，人体被病原体感 染后所获得的免疫力。这种免疫可以 通过得传染病获得，也可经过隐性感 染获得。
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宋朝（十一世纪）时吸入天花痂粉预防 天花 ； 明代（公元十七世纪七十年代左右）接 种“人痘”，预防天花； 十八世纪后叶，英国乡村医生Jenner种 “牛痘”预防天花。
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病原菌致病与疫苗
十九世纪中叶，显微镜的改进导致病原菌的
发现；
1850年在羊的血液中看到炭疽杆菌； Pasteur证明实验室培养的炭疽杆菌能使动 物感染致病； Koch提出病原菌致病的概念；
正式认识Jenner的接种牛痘苗、预防天花的
科学性和重大意义。
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人工自动免疫
原（包括血小板、红细胞）可发生交叉反应而导
抗体制药
1940年至1980年抗体的生产和纯化技术显著提高， 抗体制剂更适于静脉注射，并证实人免疫球蛋白制剂 可减少丙种球蛋白缺乏症患儿的感染。
6
1975年杂交瘤技术的创立给抗体的研究及应用带来了 突破。单克隆抗体作为临床诊断、治疗、预防以及基础理 论研究（如纯化蛋白、免疫沉淀、免疫细胞化学等）的新 型制剂，已日益显示出重要的作用和广阔的应用前景，以 单克隆技术为主要产品的生物技术已成为具有巨大市场潜 力的新兴产业部门。
16
2．可变区与恒定区：
重链及轻链N端部分的氨基 酸组成及排列变化多端，称为抗 体可变区（约占重链1/4～1/5及 轻链1/2）（variable region， V区）；V区以外的结构氨基酸 组成、数量、排列则相对恒定， 称为抗体的恒定区（constant region, C区）,该区主要发挥抗 体分子的相应功能。
39
5. 靶向作用
天然不加修饰的单抗可以通过上述几种机制发 挥治疗作用，但在许多情况下，尤其是实体恶性肿 瘤，其效果不甚理想。可以利用抗体的特异性结合 活性，将细胞杀伤性物质选择性导向肿瘤部位。
如：放射性核素、化疗药物、毒素等。
40
第二节 单克隆抗体
单克隆抗体是针对一个抗原决定簇、由单一B淋巴细 胞克隆产生的抗体；单克隆抗体的结构和特异性完全相 同。
一些与免疫系统关键分子相互作用的抗体，可以增强机体的免疫 应答能力，使原来较弱的、无效的抗肿瘤免疫反应得到有效的提高， 对机体提供免疫保护。
如抗CD40抗体：引起APC表面CD40分子的交联，激活APC(抗 原提呈细胞 ),提高其对肿瘤抗原的加工处理能力。(CD分子指的是与 人类细胞发育、分化、活化有关的膜抗原 )
17
3．超变区与框架区：
V区中某些特异位置上的氨基酸残基随抗体特异性不同而出现极 大的变异，这些区域称为超变区(hypervariable region, HV)或互补 决 定区（complementarity determining region, CDR）,是V区中特 异结合抗原的部位。
6
1975年杂交瘤技术的创立给抗体的研究及应用带来了 突破。单克隆抗体作为临床诊断、治疗、预防以及基础理 论研究（如纯化蛋白、免疫沉淀、免疫细胞化学等）的新 型制剂，已日益显示出重要的作用和广阔的应用前景，以 单克隆技术为主要产品的生物技术已成为具有巨大市场潜 力的新兴产业部门。
16
2．可变区与恒定区：
重链及轻链N端部分的氨基 酸组成及排列变化多端，称为抗 体可变区（约占重链1/4～1/5及 轻链1/2）（variable region， V区）；V区以外的结构氨基酸 组成、数量、排列则相对恒定， 称为抗体的恒定区（constant region, C区）,该区主要发挥抗 体分子的相应功能。
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5. 靶向作用
天然不加修饰的单抗可以通过上述几种机制发 挥治疗作用，但在许多情况下，尤其是实体恶性肿 瘤，其效果不甚理想。可以利用抗体的特异性结合 活性，将细胞杀伤性物质选择性导向肿瘤部位。
如：放射性核素、化疗药物、毒素等。
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第二节 单克隆抗体
单克隆抗体是针对一个抗原决定簇、由单一B淋巴细 胞克隆产生的抗体；单克隆抗体的结构和特异性完全相 同。
一些与免疫系统关键分子相互作用的抗体，可以增强机体的免疫 应答能力，使原来较弱的、无效的抗肿瘤免疫反应得到有效的提高， 对机体提供免疫保护。
如抗CD40抗体：引起APC表面CD40分子的交联，激活APC(抗 原提呈细胞 ),提高其对肿瘤抗原的加工处理能力。(CD分子指的是与 人类细胞发育、分化、活化有关的膜抗原 )
17
3．超变区与框架区：
V区中某些特异位置上的氨基酸残基随抗体特异性不同而出现极 大的变异，这些区域称为超变区(hypervariable region, HV)或互补 决 定区（complementarity determining region, CDR）,是V区中特 异结合抗原的部位。
第四章 抗体制药
高变区之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对不易变化， 称为骨架区（FR），VH和VL各有4个骨架区，分别用FR1、 FR2、FR3和FR4表示。
VH和VL的三个高变 区共同组成免疫球 蛋白的抗原结合部 位，该部位形成一 个与抗原决定簇互 补的表面，所以高 变区又被称为互补 决定区（CDR）， 分别用CDR1、 CDR2和CDR3表示。 不同的抗体其CDR 序列不相同，并因 此决定抗体的特异 性，其中CDR3具有 更高的高变程度，H 链在于抗原结合中 起非常重要的作用。
2.同种异型 同种异型是指同一种属不同个体间的Ig分子抗原性的不 同，在同种异体间免疫可诱导免疫反应。
3.独特型 独特型是一种特异性免疫球蛋白V区上的抗原特异性， 独特型的抗原决定簇称为独特位，可在异种、同种异体以及 自身体内诱导产生相应的抗体，称为抗独特型抗体。
独特型和抗独特型抗体可形成复杂的免疫网络，在机 体免疫调节中占有重要地位。
在制备杂交瘤细胞时，选择缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖 转移酶（HGPRT）瘤细胞株，PEG法融合后，在含有次黄嘌呤、
氨基碟呤和胸腺嘧啶的HAT培养基上进行筛选。细胞中，DNA的
生物合成主要有两种途径——主要途径和补救途径，主要途径是 细胞由氨基酸和小分子化合物合成核苷酸，进而合成DNA，这一
途径会被HAT培养基中的氨基碟呤所阻断。失去主要途径的细胞
能产生某一特异性抗体的单克隆B细胞是获得单克隆抗体的
关键。骨髓瘤细胞即恶性浆细胞在培养条件下可以无限繁殖， 如果将B细胞和骨髓瘤细胞融合就能获得具有无限繁殖能力 并可分泌均质抗体的杂交瘤细胞。现阶段，杂交瘤细胞的两 个亲本细胞多来自小鼠——BALB/c小鼠。
二、单克隆抗体的制备
（一）抗原和动物免疫
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染色体数目多而集中的杂交瘤细胞能稳定分泌高效价的抗体， 而染色体数目少且分散的杂交瘤细胞分泌抗体的能力较低。
其他鉴定：Ig类和亚类的鉴定；亲和力鉴定；单克隆抗体的特 异性、纯度和识别抗原的相对分子量等进行鉴定
第四章抗体制药
五、单克隆抗体的大量制备
体外培养法：
（1）传统培养方法：RPMI1640培养液，10~20%小牛或胎牛 血清，但由于杂蛋白太多，纯化困难。如采用无血清培养基 （白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺），但产量低。一般 来说，可获得10 ug/ml的抗体。
SARS病毒的免疫治疗：例如钟南山提倡使用的以SARS痊愈 病人的血清来治疗SARS病人。
1937年，电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种球蛋白、乙种 球蛋白、丙种球蛋白，那么抗体属于哪一种蛋白？
第四章抗体制药
抗体：能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
免疫球蛋白：具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋 白。
第四章抗体制药
二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养
细胞融合的基本方法：取适量的脾细胞（1X108）与骨髓瘤细 胞（2~3X107）进行混合，在PEG作用下诱导融合，时间控制 在2min内，融后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。
PEG：分子量和浓度大，则促融合率高，但粘度和毒性也大。 常用分子量为4000，浓度为40~50%。为了提高融合率，也常 用DMSO来提高细胞接触的紧密性，增加融合率。
抗体=免疫球蛋白？ 抗体是生物学上功能的概念，而免疫球蛋白则是化学结构 上的概念。 抗体∈ 免疫球蛋白，免疫球蛋白≠ 抗体
例如：多发性骨髓瘤细胞也能分泌一 些同抗体分子结构类似的球蛋白，即
免疫球蛋白。
第四章抗体制药
多克隆抗体：在作为诊断试剂使用的时候，容易发生交叉免 疫反应，导致假阳性的发生。
单克隆抗体：高度特异性、均一性、来源稳定可大量生产， 主要用于疾病的诊断与治疗。 诊断：例如利用单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原、 辅助临床诊断或用放射性核素标记的单抗进行肿瘤显像。 治疗：例如针对T淋巴细胞分化抗原CD3的单抗，可用作免 疫抑制剂抑制器官移植中的排斥反应，现已上市。以单抗 为载体的药物可对肿瘤进行导向治疗。
密度的依赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞，常用为
饲养细胞。
第四章抗体制药
三、筛选阳性克隆与克隆化
筛选阳性克隆：常用方法有ELISA，放免，荧光免疫等，经 过筛选可得到所需要的产单抗的细胞株。
阳性细胞的克隆化：指筛选得到的阳性细胞通过无性繁殖而 得到细胞集团的培养过程。一般经过3次克隆，可得到纯阳 性克隆。克隆化常用方法为有限稀释法和软琼脂法。
有限稀释法：通过有限稀释，使每孔中理论上只有一个细胞， 通过饲养细胞的帮助成长为克隆。第一次应使用HT培养基， 其后用正常培养基即可。
软琼脂法：培养基中加入0.5%琼脂，将克隆打碎后再继续培
养。
第四章抗体制药
四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定
杂交瘤细胞的鉴定：主要是染色体分析。正常鼠脾细胞染色体 数为40，全部是端着丝粒染色体；小鼠骨髓瘤的染色体数变异 大，多为非整倍性，并且有中部着丝点染色体和亚中部着丝点 染色体。杂交瘤细胞的染色体在数目上接近两种亲本细胞染色 体数目的总和，在结构上多数为端着丝粒。
第四章抗体制药
• 第一节 概述 • 第二节 单克隆抗体 • 第三节 鼠源性单克隆抗体的改造 • 第四节 基因工程抗体和抗体工程 • 第五节 抗体诊断试剂 • 第六节 抗体治疗药物
第四章抗体制药
第一节 概述
1890年发现白喉抗毒素，建立了血清疗法，开抗体治疗之先 河。 传统免疫疗法：例如现在仍在使用的破伤风抗毒素血清。
融合后的结果：脾-脾，瘤-瘤，脾-瘤及未融合的细胞。在正 常培养基中，哪种细胞生长速度最慢？
第四章抗体制药
细胞DNA合成与HAT选择培养基：
（1）主途径：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶 酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。
（2）辅助途径：在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下， 经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶 （TK）的催化作用合成DNA。
第四章抗体制药
单抗介导的免疫疗法缺陷： （1）鼠原性单抗具有抗原性，容易引起人抗鼠免疫反应，从 而降低药物的半衰期。 （2）完整的抗体分子太大，不易穿透实体瘤组织。
解决办法： （1）降低单抗的免疫原性（单抗的人原化或基因工程抗体） （2）降低单抗的分子量 改进的抗体：改形抗体、单链抗体、单域抗体、超变区多肽 （最小识别单位）。这些改进抗体许多原来的鼠源性单抗的 生物学活性消失，如激活补体、免疫调理、ADCC等，只保 留了同抗原特异性结合的活性。
第四章抗体制药
第二节 单克隆抗体
单克隆抗体的制备 一、抗原与动物免疫 二、细胞融合与杂交瘤细胞的培养 三、筛选阳性克隆与克隆化 四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 五、单克隆抗体的大量制备 六、单克隆抗体的纯化
第四章抗体制药
第四章抗体制药
第四章抗体制药
一、抗原与动物免疫
（1）抗原的制备 （2）免疫动物的选择 （3）免疫方法： I.体内免疫法：免疫原性强、抗原量多时应用。一般在采集 脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原，使对应的B淋巴细 胞克隆受到可靠的最大限度刺激后分裂增殖。 II.体外免疫法：应用于制备人源性单克隆抗体，或抗原免疫 原性极弱且能引起免疫抑制时使用。具体方法就是制备脾细 胞，进行细胞培养，加入抗原刺激，然后分离脾细胞进入融 合。
选择培养基：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）和胸腺嘧啶核 苷（T）。氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常 途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的 HGPRT－细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞 具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖
饲养细胞：能释放生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞
第四章 抗体药物
第四章抗体制药
• 抗体—应用于免疫治疗与免疫诊断
▪ 免疫缺陷； ▪ 肿瘤； ▪ 感染； ▪ 自身免疫病； ▪ 超敏反应； ▪ 移植排斥； ▪ 炎症。
第四章抗体制药
抗体治疗作用机制：
• 中和毒素； • 介导溶解病原微生； • 介导溶解淋巴细胞； • 中和炎症因子； • 作为靶向性载体。
其他鉴定：Ig类和亚类的鉴定；亲和力鉴定；单克隆抗体的特 异性、纯度和识别抗原的相对分子量等进行鉴定
第四章抗体制药
五、单克隆抗体的大量制备
体外培养法：
（1）传统培养方法：RPMI1640培养液，10~20%小牛或胎牛 血清，但由于杂蛋白太多，纯化困难。如采用无血清培养基 （白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺），但产量低。一般 来说，可获得10 ug/ml的抗体。
SARS病毒的免疫治疗：例如钟南山提倡使用的以SARS痊愈 病人的血清来治疗SARS病人。
1937年，电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种球蛋白、乙种 球蛋白、丙种球蛋白，那么抗体属于哪一种蛋白？
第四章抗体制药
抗体：能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
免疫球蛋白：具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋 白。
第四章抗体制药
二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养
细胞融合的基本方法：取适量的脾细胞（1X108）与骨髓瘤细 胞（2~3X107）进行混合，在PEG作用下诱导融合，时间控制 在2min内，融后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。
PEG：分子量和浓度大，则促融合率高，但粘度和毒性也大。 常用分子量为4000，浓度为40~50%。为了提高融合率，也常 用DMSO来提高细胞接触的紧密性，增加融合率。
抗体=免疫球蛋白？ 抗体是生物学上功能的概念，而免疫球蛋白则是化学结构 上的概念。 抗体∈ 免疫球蛋白，免疫球蛋白≠ 抗体
例如：多发性骨髓瘤细胞也能分泌一 些同抗体分子结构类似的球蛋白，即
免疫球蛋白。
第四章抗体制药
多克隆抗体：在作为诊断试剂使用的时候，容易发生交叉免 疫反应，导致假阳性的发生。
单克隆抗体：高度特异性、均一性、来源稳定可大量生产， 主要用于疾病的诊断与治疗。 诊断：例如利用单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原、 辅助临床诊断或用放射性核素标记的单抗进行肿瘤显像。 治疗：例如针对T淋巴细胞分化抗原CD3的单抗，可用作免 疫抑制剂抑制器官移植中的排斥反应，现已上市。以单抗 为载体的药物可对肿瘤进行导向治疗。
密度的依赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞，常用为
饲养细胞。
第四章抗体制药
三、筛选阳性克隆与克隆化
筛选阳性克隆：常用方法有ELISA，放免，荧光免疫等，经 过筛选可得到所需要的产单抗的细胞株。
阳性细胞的克隆化：指筛选得到的阳性细胞通过无性繁殖而 得到细胞集团的培养过程。一般经过3次克隆，可得到纯阳 性克隆。克隆化常用方法为有限稀释法和软琼脂法。
有限稀释法：通过有限稀释，使每孔中理论上只有一个细胞， 通过饲养细胞的帮助成长为克隆。第一次应使用HT培养基， 其后用正常培养基即可。
软琼脂法：培养基中加入0.5%琼脂，将克隆打碎后再继续培
养。
第四章抗体制药
四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定
杂交瘤细胞的鉴定：主要是染色体分析。正常鼠脾细胞染色体 数为40，全部是端着丝粒染色体；小鼠骨髓瘤的染色体数变异 大，多为非整倍性，并且有中部着丝点染色体和亚中部着丝点 染色体。杂交瘤细胞的染色体在数目上接近两种亲本细胞染色 体数目的总和，在结构上多数为端着丝粒。
第四章抗体制药
• 第一节 概述 • 第二节 单克隆抗体 • 第三节 鼠源性单克隆抗体的改造 • 第四节 基因工程抗体和抗体工程 • 第五节 抗体诊断试剂 • 第六节 抗体治疗药物
第四章抗体制药
第一节 概述
1890年发现白喉抗毒素，建立了血清疗法，开抗体治疗之先 河。 传统免疫疗法：例如现在仍在使用的破伤风抗毒素血清。
融合后的结果：脾-脾，瘤-瘤，脾-瘤及未融合的细胞。在正 常培养基中，哪种细胞生长速度最慢？
第四章抗体制药
细胞DNA合成与HAT选择培养基：
（1）主途径：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶 酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。
（2）辅助途径：在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下， 经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶 （TK）的催化作用合成DNA。
第四章抗体制药
单抗介导的免疫疗法缺陷： （1）鼠原性单抗具有抗原性，容易引起人抗鼠免疫反应，从 而降低药物的半衰期。 （2）完整的抗体分子太大，不易穿透实体瘤组织。
解决办法： （1）降低单抗的免疫原性（单抗的人原化或基因工程抗体） （2）降低单抗的分子量 改进的抗体：改形抗体、单链抗体、单域抗体、超变区多肽 （最小识别单位）。这些改进抗体许多原来的鼠源性单抗的 生物学活性消失，如激活补体、免疫调理、ADCC等，只保 留了同抗原特异性结合的活性。
第四章抗体制药
第二节 单克隆抗体
单克隆抗体的制备 一、抗原与动物免疫 二、细胞融合与杂交瘤细胞的培养 三、筛选阳性克隆与克隆化 四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 五、单克隆抗体的大量制备 六、单克隆抗体的纯化
第四章抗体制药
第四章抗体制药
第四章抗体制药
一、抗原与动物免疫
（1）抗原的制备 （2）免疫动物的选择 （3）免疫方法： I.体内免疫法：免疫原性强、抗原量多时应用。一般在采集 脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原，使对应的B淋巴细 胞克隆受到可靠的最大限度刺激后分裂增殖。 II.体外免疫法：应用于制备人源性单克隆抗体，或抗原免疫 原性极弱且能引起免疫抑制时使用。具体方法就是制备脾细 胞，进行细胞培养，加入抗原刺激，然后分离脾细胞进入融 合。
选择培养基：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）和胸腺嘧啶核 苷（T）。氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常 途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的 HGPRT－细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞 具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖
饲养细胞：能释放生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞
第四章 抗体药物
第四章抗体制药
• 抗体—应用于免疫治疗与免疫诊断
▪ 免疫缺陷； ▪ 肿瘤； ▪ 感染； ▪ 自身免疫病； ▪ 超敏反应； ▪ 移植排斥； ▪ 炎症。
第四章抗体制药
抗体治疗作用机制：
• 中和毒素； • 介导溶解病原微生； • 介导溶解淋巴细胞； • 中和炎症因子； • 作为靶向性载体。