实验七 蔗糖酶的制备和活力测定

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参考教案-蔗糖酶的提取纯化与鉴定分析

参考教案-蔗糖酶的提取纯化与鉴定分析

参考教案:酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定蔗糖酶(E.C.3.2.1.26)( —D—呋喃果糖苷果糖水解酶),能催化非还原性双糖(蔗糖)的1,2-糖苷键裂解,释放出等量的果糖和葡萄糖。

不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖,也能催化棉子糖水解,生成密二糖和果糖。

由于果糖甜度高 ,约为蔗糖1.36~1.60倍 ,在工业上具有较高的经济价值。

可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。

蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧,在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分,是含有50% 糖成分的糖蛋白。

在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶,含有少量的糖。

两种酶的蛋白质部分均为双亚基,二聚体,两种形式的酶的氨基酸组成不同,外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸,Ser和Met,它们的分子量也不同,外酶约为27万(或22万,与酵母的来源有关),内酶约为13.5万。

尽管这两种酶在组成上有较大的差别,但其底物专一性和动力学性质仍十分相似,因此,本实验未区分内酶与外酶,而且由于内酶含量很少,极难提取,本实验提取纯化的主要是外酶。

每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖,蔗糖的裂解速率可以通过NeLson法测定还原糖的产生数量来测定。

一个酶活力单位规定为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。

比活力单位为每毫克蛋白含有酶活力单位。

(本实验以酵母为原料)一、教学目的通过酵母菌扩大培养及蔗糖酶的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子(酶)制备方案设计和开展实践研究的方法,体验从复杂细胞混合物体系中提取纯化酶的基本原理、过程和方法。

本实验为学生提供一个较全面的科学研究实践机会,整个实验过程学生独立完成,虽然操作难度较大,所需要的实间较长(64学时),但每一步单元操作的原理清晰,技术成熟,实验结果明显,能给学生较多的设计空间和动手机会,有利于培养学生的学习兴趣和从事科学研究的能力。

蔗糖酶活力实验报告

蔗糖酶活力实验报告

一、实验目的通过本实验,了解蔗糖酶的活力及其影响因素,探究温度、pH值、抑制剂和激活剂对蔗糖酶活力的影响,为后续研究蔗糖酶的应用提供基础。

二、实验原理蔗糖酶(Invertase)是一种水解酶,能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。

本实验采用比色法测定蔗糖酶活力,通过测定在一定条件下,酶催化蔗糖水解生成还原糖的速率,从而反映酶的活力。

三、实验材料与仪器1. 实验材料:(1)蔗糖酶:市售或实验室自备(2)蔗糖:分析纯(3)葡萄糖标准溶液:0.1 mol/L(4)3,5-二硝基水杨酸(DNS):分析纯(5)盐酸、氢氧化钠:分析纯2. 实验仪器:(1)电子天平(2)恒温水浴锅(3)紫外可见分光光度计(4)移液器(5)试管四、实验方法1. 葡萄糖标准曲线绘制:(1)配制不同浓度的葡萄糖标准溶液(2)将各浓度葡萄糖溶液分别加入试管中,加入适量DNS试剂,沸水浴5分钟(3)冷却后,在540 nm波长下测定吸光度(4)以葡萄糖浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线2. 蔗糖酶活力测定:(1)配制酶反应体系:取一定量的蔗糖溶液,加入适量蔗糖酶,置于恒温水浴锅中(2)每隔一定时间取样,加入DNS试剂,沸水浴5分钟(3)冷却后,在540 nm波长下测定吸光度(4)根据标准曲线计算还原糖浓度(5)根据酶反应体系中蔗糖浓度和反应时间,计算酶活力3. 影响蔗糖酶活力的因素:(1)温度对蔗糖酶活力的影响:在不同温度下测定酶活力(2)pH值对蔗糖酶活力的影响:在不同pH值下测定酶活力(3)抑制剂对蔗糖酶活力的影响:加入一定浓度的抑制剂,测定酶活力(4)激活剂对蔗糖酶活力的影响:加入一定浓度的激活剂,测定酶活力五、实验结果与分析1. 葡萄糖标准曲线绘制根据实验结果,绘制葡萄糖标准曲线,相关系数R²为0.998,表明曲线拟合度良好。

2. 蔗糖酶活力测定在不同反应时间下,酶活力随时间延长而增加,说明蔗糖酶具有催化活性。

3. 影响蔗糖酶活力的因素(1)温度对蔗糖酶活力的影响:在40℃时,酶活力最高,随着温度升高或降低,酶活力逐渐下降。

蔗糖酶的分离提纯及酶促反应动力学实验

蔗糖酶的分离提纯及酶促反应动力学实验

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3、 蔗糖酶粗品(E1)的制备
①自溶:15g(一小袋)高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中、少量多次地 加入50ml蒸馏水,搅拌均匀,成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙 酯,搅匀,再于35℃ 恒温水浴中搅拌30分钟,观察菌体自溶现象;
②抽提:补加蒸馏水30ml,搅匀,盖好,于35℃ 恒温过夜, 8000r/min
7.学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法、选择 确
定酶促反应最适条件(温度、pH值、离子浓度等)的方法;
8.学习《正交试验法》中最简单的入门知识:用正交表设计
试验方案、用极差分析处理试验数据并分析试验结果。
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Байду номын сангаас
二、实验原理
前言
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质,可据酶蛋白的结构 和性质选择分离提纯条件和含量测定方法。
② 工作以曲葡线萄。糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标,画出
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3,5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作
试号 含糖量 葡萄糖标准液 去离子水 3,5-二硝基水杨酸试剂 A540
(mg) (ml) (ml)
( ml)
10
0
2.0
3
2 0.4 0.2
1.8
3
3 0.8 0.4
⑥ 保存成品E3
测酶E3活力及蛋白质浓度
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成品E3 计算出E3浓度
周六(全天)上午8:00开始
(1).蔗糖酶米氏常数的测定
(2).用正交法测定几种因素
对蔗糖酶 活力的影响
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蔗糖酶生化实验报告(3篇)

蔗糖酶生化实验报告(3篇)

第1篇一、实验目的1. 理解蔗糖酶的催化原理和特性。

2. 掌握蔗糖酶的提取、纯化方法。

3. 学习通过不同方法测定蔗糖酶的活力。

4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。

二、实验原理蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。

本实验旨在通过提取、纯化蔗糖酶,并测定其活力,了解蔗糖酶的特性。

三、实验材料与试剂1. 材料:- 酵母细胞- 淀粉- 蔗糖- 还原糖试剂(如班氏试剂)2. 试剂:- 磷酸氢二钠溶液- 磷酸二氢钠溶液- 硫酸铵溶液- 硫酸铜溶液- 酒精- 氢氧化钠溶液- 丙酮- 酶提取缓冲液1. 蔗糖酶的提取:- 将酵母细胞用磷酸缓冲液洗涤,并悬浮于磷酸缓冲液中。

- 使用匀浆机破碎细胞,收集匀浆液。

- 将匀浆液离心,收集上清液即为蔗糖酶粗提液。

2. 蔗糖酶的纯化:- 将蔗糖酶粗提液用硫酸铵溶液进行盐析,收集沉淀。

- 将沉淀用磷酸缓冲液溶解,并使用凝胶过滤柱进行纯化。

3. 蔗糖酶活力的测定:- 将纯化后的蔗糖酶与蔗糖溶液混合,在适宜的温度下反应。

- 加入还原糖试剂,观察颜色变化,根据颜色变化判断蔗糖酶的活力。

五、实验结果与分析1. 蔗糖酶的提取:- 通过匀浆和离心,成功提取出酵母细胞中的蔗糖酶。

2. 蔗糖酶的纯化:- 通过盐析和凝胶过滤柱,成功纯化出蔗糖酶。

3. 蔗糖酶活力的测定:- 在适宜的温度下,蔗糖酶能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。

- 加入还原糖试剂后,溶液颜色发生变化,表明蔗糖酶具有活力。

4. 影响蔗糖酶活性的因素:- 温度:在一定范围内,温度升高,蔗糖酶的活力增加。

- pH值:在一定范围内,pH值升高,蔗糖酶的活力增加。

- 抑制剂:某些物质(如重金属离子)可以抑制蔗糖酶的活力。

1. 本实验成功提取和纯化了蔗糖酶,并测定了其活力。

2. 实验结果表明,温度和pH值是影响蔗糖酶活性的重要因素。

3. 在实际应用中,需要根据具体情况进行酶活性的调控,以获得最佳催化效果。

七、实验结论1. 蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。

蔗糖酶综合性实验报告

蔗糖酶综合性实验报告

一、实验目的1. 了解蔗糖酶的特性和功能;2. 掌握蔗糖酶提取和纯化的方法;3. 学习测定蔗糖酶活力和专一性的实验技术;4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。

二、实验原理蔗糖酶是一种水解酶,可以将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。

本实验通过提取和纯化蔗糖酶,测定其活力和专一性,并分析影响其活性的因素。

三、实验材料与试剂1. 实验材料:酵母菌、蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素、麦芽糖等;2. 实验试剂:氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铜、硫酸锌、碘液、斐林试剂等;3. 实验仪器:旋光仪、离心机、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计、移液器、容量瓶、烧杯、试管等。

四、实验步骤1. 蔗糖酶提取(1)将酵母菌接种于含有葡萄糖的培养基中,37℃培养24小时;(2)收集培养液,离心分离菌体;(3)将菌体悬浮于磷酸缓冲溶液中,加入一定量的氯化钠和磷酸氢二钠,超声波破碎菌体;(4)离心分离酶液,得到粗提蔗糖酶。

2. 蔗糖酶纯化(1)将粗提蔗糖酶溶液通过硫酸铵分级沉淀法进行纯化;(2)收集沉淀,用磷酸缓冲溶液溶解,透析去除小分子物质;(3)通过凝胶过滤色谱法进一步纯化蔗糖酶。

3. 蔗糖酶活力测定(1)采用硫酸铜法测定蔗糖酶活力,以葡萄糖生成量为指标;(2)设置不同浓度的蔗糖溶液,在特定条件下测定酶活力;(3)绘制酶活力曲线,确定最适酶浓度和反应时间。

4. 蔗糖酶专一性实验(1)将蔗糖酶分别作用于蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素、麦芽糖等底物;(2)通过比色法测定反应产物的生成量;(3)分析酶对不同底物的催化效率,确定蔗糖酶的专一性。

5. 影响蔗糖酶活性的因素实验(1)考察pH、温度、离子强度等因素对蔗糖酶活性的影响;(2)设置不同pH、温度、离子强度等条件,测定酶活力;(3)分析影响蔗糖酶活性的因素。

五、实验结果与分析1. 蔗糖酶提取和纯化通过超声波破碎菌体和离心分离,成功提取出粗提蔗糖酶。

经过硫酸铵分级沉淀、透析和凝胶过滤色谱法,纯化得到较高纯度的蔗糖酶。

蔗糖合成酶的测定方法[方案]

蔗糖合成酶的测定方法[方案]

蔗糖合成酶的测定方法[方案]蔗糖合成酶的测定方法一、仪器设备冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计二、试剂HEPES-NaOH(50mmol/L,pH7.5)缓冲液,包括50mmol/L MgCI;2mmol/LEDTA;20.2%(W/V)BSA;2%PVP;0.1%间苯二酚:称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。

30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖三、操作方法1、粗酶液制备称取0.5g样品(植物叶片去掉主叶脉),洗净剪碎,置于预冷的研钵中,加3ml Hepes-NaOH缓冲液,冰浴研磨,10000×g离心10min。

2、酶活性测定依次加入50μL粗酶液,50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5,20μL 50 mmol/LMgCI, 220μL 100mmol/L UDPG,20μL 100mmol/L6-磷酸果糖(20μL 100mmol/L果糖), 30?中反应30min后,加入200μL 2mol/L NaOH终止反应,沸水煮10min,流水冷却,加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1% 间苯二酚,摇匀后置于80?水浴保温10min,冷却后置于480nm 处,以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。

同时取50μL粗酶液,加入200μL 2mol/L NaOH,以下同上操作,测定蔗糖含量。

3、蔗糖标线制作:取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL,操作同上,然后以蔗糖浓度为纵坐标,以吸光值为横坐标,得方程。

4、计算,1,1样品中酶活性(μg?g?h)=式中 C—反应液催化产生的蔗糖总量(μg);V—提取酶液时加入的缓冲液体积(ml); 1V—酶反应时加入的粗酶液体积(ml) 2淀粉酶活性的测定1方法1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液:0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液:用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液(pH 5.6)配制;标准麦芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中,移入1000 mL容量瓶中,加入325 mL 2mol?L-1 NaOH溶液,再加入45g丙三醇,摇匀,冷却后定容到1000 mL。

蔗糖酶提取实验报告

蔗糖酶提取实验报告

1. 掌握从酵母中提取蔗糖酶的基本方法。

2. 了解酶的提取、纯化及活力测定的原理和操作。

3. 掌握酶活性测定的方法。

二、实验原理蔗糖酶(Invertase)是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。

本实验采用酵母作为原料,通过破碎细胞、离心、沉淀、透析等步骤提取蔗糖酶,并对其进行活力测定。

三、实验材料与仪器材料:1. 酵母(安琪酵母粉)2. 蔗糖3. 葡萄糖4. 果糖5. 磷酸盐缓冲液(pH6.0)6. 3,5-二硝基水杨酸(DNS)仪器:1. 电子天平2. 离心机3. 恒温水浴锅4. 分光光度计5. 试管6. 烧杯7. 移液器1. 酵母细胞的制备:- 称取1g酵母粉,加入10ml磷酸盐缓冲液(pH 6.0),搅拌均匀,置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。

- 将保温后的酵母悬液以3000r/min离心10分钟,收集上清液。

2. 酶液的提取:- 向上清液中加入等体积的50%饱和硫酸铵溶液,搅拌均匀,置于4℃冰箱中过夜。

- 将沉淀物以3000r/min离心10分钟,收集上清液即为粗酶液。

3. 酶液的透析:- 将粗酶液置于透析袋中,置于磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中透析过夜,以去除硫酸铵等小分子杂质。

4. 酶液的活力测定:- 取1ml蔗糖溶液(2%蔗糖溶液),加入1ml透析后的酶液,置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。

- 取0.5ml反应液,加入2ml DNS试剂,沸水浴5分钟。

- 取出后,加入4ml蒸馏水,在540nm波长下测定吸光度。

五、实验结果与分析1. 酶液活力测定结果:- 通过DNS试剂显色,根据吸光度计算出酶的活力。

2. 结果分析:- 通过对比不同处理条件下的酶活力,分析提取、纯化过程中酶活力的影响因素。

六、实验结论1. 通过本实验,成功从酵母中提取了蔗糖酶。

2. 酶的提取、纯化过程中,酶活力受到pH、温度、离子强度等因素的影响。

3. 透析法是一种有效的酶纯化方法,可以去除小分子杂质,提高酶的纯度。

生化综合实验-酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究

生化综合实验-酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究

酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究一、蔗糖酶的制备1、提取称取14.997g干酵母粉于250ml小烧杯中,少量多次地加入50ml蒸馏水,搅拌均匀。

成糊状后加入1.499g乙酸钠、25ml乙酸乙酯,搅匀。

再于35℃恒温水浴中搅拌30min,然后补加30ml蒸馏水,搅匀,盖好,于35℃恒温过夜。

之后,1000r/min离心10min,抽取酯层后再次离心,得到无细胞提取液。

用1M HCl将其PH调至5.0,即可得到级分Ⅰ。

(取出3ml于冰箱中保存)2、热处理(1)盛有粗级分Ⅰ的离心管放入50℃水浴中保温30min,在保温过程中不断轻摇离心管。

(2)取出离心管,于冰浴中迅速冷却,用4℃,1000r/min离心10min。

(3)上清液即为热级分Ⅱ。

(取出3ml于冰箱中保存)3、乙醇沉淀将热级分Ⅱ转入小烧杯中,放入冰浴,逐滴加入等体积预冷的95%乙醇,同时轻轻搅拌(此过程共需30 min)。

然后在冰浴中静置10 min,以沉淀完全。

然后4℃,1000r/min离心10min。

倾去上清,并滴干。

将沉淀保存于离心管中,冷冻保存,此即级分Ⅲ。

二、蔗糖酶的纯化将3ml级分Ⅲ加入洗脱柱中进行梯度洗脱。

及洗脱峰图如下:三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定(一)还原糖含量测定1、各级分稀释倍数的确定级分Ⅰ:取50μl稀释至1.5ml(30倍)级分Ⅱ:取50μl稀释至1.5ml(30倍)级分Ⅲ:取50μl稀释至15ml(300倍)取20μl稀释至2ml(100倍)释100倍。

在上述表格中,Glu含量是由标准曲线求得的,E'=Glu含量*稀释倍数/(10 min*0.6 ml)Units=0.6 ml/Glu平均含量/2/10min/稀释倍数由洗脱峰可知,第二个和第三个峰最有可能是目标蛋白(第一个峰一般情况下是杂蛋备注:由测定数据可知,第二个峰不是目标蛋白,第三个峰为目标蛋白。

(二)蛋白质含量测定1、各级分稀释倍数的确定由以上数据可知,级分Ⅰ和级分Ⅱ不需稀释,级分Ⅲ需稀释5倍。

蔗糖酶学实验03.10.28

蔗糖酶学实验03.10.28

0.179
0.292 0.385
5
6 7
2.0
2.4 2.8
1.0
1.2 1.4 K=4.384
1.0
0.8 0.6 B=0.038
3.0
3.0 3.0
0.474
0.592 0.672
6
C=K*A+B


2、蔗糖酶的活力测定:
①.蔗糖酶活力的规定:在本实验条件下,每3min释


放1mg还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位。 ②.操作: 取两支试管分别加入酶液2ml,一支中加入0.5ml 1mol/L的NaOH,摇匀,使酶失活(做参比),另一支做 测定管; 把两支试管和5%的蔗糖溶液都放在35℃水浴中预热 恒温;上述两试管中分别加入2ml 5%的蔗糖液,并准 确计算时间,3分钟后于测定管中加入 0.5ml 1mol/L的 NaOH,摇匀,终止反应。


取出比色皿洗净,样品室用软布或软纸擦净。

总糖 总糖主要指具有还原性的葡萄糖,果糖,戊糖,乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖 的蔗糖(水解后为1分子葡萄糖和1分子果糖),麦芽糖(水解后为2分子葡萄糖)以及可能部 分水解的淀粉(水解后为2分子葡萄糖)。还原糖类之所以具有还原性是由于分子中含有游离 的醛基(-CHO)或酮基(=C=O)。 测定总糖的经典化学方法都是以其能被各种试剂氧化为基 础的。这些方法中,以各种根据斐林氏溶液的氧化作用的改进法的应用范围最广。这里主要 介绍铁氰化钾法,蒽铜比色法,斐林氏容量法。斐林氏容量法由于反应复杂,影响因素较多, 所以不如铁氰化钾法准确,但其操作简单迅速,试剂稳定,故被广泛采用。蒽铜比色法要求 比色时糖液浓度在一定范围内,但要求检测液澄清,此外,在大多数情况下,测定要求不包 括淀粉和糊精,这就要在测定前将淀粉,糊精去掉,这样就使操作复杂化,限制了其广泛应 用。

蔗糖酶活力测定

蔗糖酶活力测定

一、目的了解植物组织中提取蔗糖酶的方法,掌握蔗糖酶活力测定的原理。

二、原理本实验以Nelson 方法测定酶活力,其原理是:蔗糖酶可将非还原性的蔗糖水解为葡萄糖和果糖,而葡萄糖作为还原糖含有的自由醛基,在碱性溶液中将Cu 2+ 还原,还原糖本身被氧化成羟酸;砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色复合物(砷钼蓝),在510nm 波长下有正比于还原糖浓度的光密度,从而确定蔗糖酶的活力,该法测定的范围为25~200μg。

三、主要仪器及试剂四、操作步骤1.标准曲线制作(1)取9 个具塞试管,按表1 加样:(2)向每管中加1mL Nelson 试剂,盖上塞子,置沸水浴中20 min。

冷至室温,向每管中加1 mL 砷钼酸试剂。

(3)5 min 后,向每管中加7mL 蒸馏水,混匀。

(4)在510 nm 下测定光密度,以还原糖葡萄糖为横坐标,以OD510nm 值为纵坐标,制作标准曲线。

2.酶活力测定取2g 小麦苗,加入2mL 乙酸缓冲液,在冰浴中用研钵研磨成糊状,12 000r/min 离心10min,留取上清液用于酶活测定。

取2 支具塞刻度试管,向每个试管中加入乙酸缓冲液0.8ml,0.5 mmol/L 蔗糖溶液0.2mL,适当稀释的酶液1mL,以同样处理但不加酶液者为空白对照,室温下放置10min。

然后向每管中加1mL Nelson 试剂,置沸水浴中20min。

冷却至室温,向每管中加1mL 砷钼酸试剂,5min 后,向每管中加7mL 蒸馏水,510 nm 下比色,测定光密度OD510nm。

五、实验结果活力计算:在室温、pH4.5 条件下,每分钟水解产生1μmol 葡萄糖所需的酶量,定义为酶的1 个活力单位(U)酶活力的影响教师:XXX实验类型:基础学时:10(参考)内容:一、实验目的初步掌握用正交表设计实验方案并用数理统计方法处理实验数据的步骤和注意事项。

二、实验原理酶的催化作用受多种因素的影响。

欲求某因素对酶活力的影响,通常是固定其它因素,测定该因素不同水平下的酶活力。

蔗糖酶的提取及活力

蔗糖酶的提取及活力

蔗糖酶的提取及活力、含量和相对分子质量测定摘要:本学期共做了六次生化实验。

.第一次是提取及纯化蔗糖酶,以为后续实验提供样品。

实验主要目的是要求学生掌握高速离心机的使用。

实验共得到不同纯化度的三种提取液,标记为A、B、C。

将三种提取液分别放入冰箱保存,做为后续实验样品。

也因此做此实验时必须保证各个操作无误,及准确,以免影响后续实验的结果。

第二次是有关蔗糖酶的柱层析法,主要目的是要求同学掌握离子交换层析的原理及柱层析的操作技术及紫外吸收的分析方法。

此次实验通过柱层析及紫外吸收法得到2~3管的活力最大的分离液合并为分离液D,放入冰箱作为后续实验样品。

第三次实验为蔗糖酶的活力测定,目的为掌握酶的活力测定方法,了解各个酶的纯化情况。

利用分光度计测出各个样品的OD值,再对照葡萄糖的标准曲线来得出剩余葡萄糖的含量,从而获得各个酶的活力大小,了解各个酶的纯化情况。

并得出结论酶的纯化度越高,活力越小。

第四次实验为蔗糖酶蛋白质的含量测定,目的为掌握学习Folin-酚测定蛋白质含量的原理及方法,制备标准曲线测定未知样品中蛋白质含量。

同样利用与标准曲线对照来得到试样的蛋白质含量,并测出酶的比活力。

测量蛋白质的方法有多种,我们必须根据所做实验的具体选择合适的方法来测定蛋白质。

第五次的实验是微量凯氏定氮测总蛋白。

目的是要求同学掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理及方法。

本实验除利用了凯氏定氮法外还加上了酸式滴定法最后得出了毫克级别的总蛋白含量。

其结果与上一实验所测得的总蛋白质含量有所不同,正证明了不同的方法测量蛋白质造成的误差不同,致所得结果不同。

最后一次实验为SDS-PAGE测定蛋白质分子质量,目的为掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和测定蛋白质分子量技术。

此实验操作复杂,需先制作凝胶再结果染色脱色,最后还要制作标准蛋白分子质量曲线图来进行试样对照。

最后得到蔗糖酶的分子量在5万左右及9万左右。

关键字:实验;提取液;比活;蛋白质;SDS-PAGE;OD正文:1,蔗糖酶的提取及提纯1.1,文献综述:蔗糖酶的分离利用的是细胞破壁法。

蔗糖酶-酶工程实验

蔗糖酶-酶工程实验

y = 0.0061x + 0.0827 y——蛋白质含量(µg/ml) x——595nm 下光吸收 四、实验结果及计算
步骤
提取(I) 热处理 沉淀(II) 乙醇沉 淀(III)
总体积 单位体积活 总活力 (mL) 力(IU/mL) (IU)
总蛋白 (mg)
比活力
纯化 产率
(IU/mg 蛋白) 倍数 (%)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
将各管溶液混匀后,在 100℃恒温水浴加热 5 分钟,取出立即用冷水冷却至室温
H2O
(ml)
7
7
7
7
7
7
将各管溶液混匀
7号 0...3.5. 0.70 1.30 1.0
7
A520nm 每步收集的酶液应进行一定倍数的稀释,先试做,选其吸光度值在 0.1-1.0 内,即还原糖含量应在 0.08~1.2
【实验一】蔗糖酶的提取(实验分组:4 人)
1.实验学时:6; 2.实验目的:掌握蔗糖酶提取的流程。 3.实验内容:沉淀、透析,及活性测定。计算酶的提取效率。 4.实验要求:理解影响酶提取的基本原理,掌握沉淀、透析等方法、影响实验结果的重要因素、掌握 数据的分析方法。 一、实验原理: 1、蔗糖酶 酵母细胞存在两种蔗糖酶,一种在细胞壁中,一种在细胞质内,前者活力较高,分子量较大(约 270KDa),后者活力较低,分子量约为 135KDa,两种酶的底物专一性和动力学性质十分相似,因此,本 实验未区分内酶与外酶。 2、蔗糖酶的初步分离纯化 本实验采用选择性变性(加热)、有机溶剂(乙醇)沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。
【实验二】蔗糖酶的固定化及固定化酶性质的测定
1.实验学时:4 2.实验目的:掌握蔗糖酶固定化方法。 3.实验内容:采用包埋法固定蔗糖酶,并测定固定化效率。 4.实验要求:理解酶的固定化原理,掌握蔗糖酶固定化的方法、实验中影响实验结果的重要因素、掌 握数据的分析方法。

蔗糖酶的测定原理

蔗糖酶的测定原理

蔗糖酶的测定原理
蔗糖酶(Sucrase)是一种催化蔗糖(麦芽糖)水解为葡萄糖
和果糖的酶。

测定蔗糖酶的活性常用的方法是通过测定其催化蔗糖水解生成葡萄糖的速率来间接测定。

测定蔗糖酶活性的实验步骤如下:
1. 准备反应体系。

一般采用含有蔗糖酶的提取物或纯化酶溶液作为反应体系,同时加入含有蔗糖的缓冲液。

2. 加入底物。

将一定量的蔗糖溶液加入反应体系中,使反应开始。

3. 控制反应条件。

将反应体系保持在适当的温度和pH值下进
行反应,通常蔗糖酶的最适催化温度为37°C,最适pH为6.8。

4. 反应时间控制。

反应一定时间后,停止反应。

5. 停止反应。

通常通过加入一定体积的酸性溶液来停止反应,将剩余的蔗糖转化为葡萄糖和果糖。

6. 对产生的葡萄糖进行测定。

葡萄糖的测定可以采用多种方法,如酶促发色法、底物比色法等。

通过测定蔗糖酶催化蔗糖水解生成的葡萄糖的量,可以间接测定蔗糖酶的活性。

活性通常以每分钟生成的葡萄糖的微摩尔数来表示。

需要注意的是,在文中不能再出现和标题相同的文字,以免造成重复。

蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测

蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测

蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解反应的酶,广泛存在于生命体内,具有重要的应用价值。

本文主要介绍了蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测方法。

一、蔗糖酶的提取1、选择合适的菌株:蔗糖酶广泛存在于细菌、真菌、植物和动物等生物体中,但不同菌株对蔗糖酶的产生能力存在差异,因此需要根据实际需求选择产酶能力较高的菌株。

2、液态培养:选用适宜的培养基和培养条件,促进菌株生长和蔗糖酶的合成。

一般情况下,最佳培养条件为温度在35℃左右,pH值为7.0左右,培养时间为24-48小时。

3、离心沉淀:将菌液离心,取上清液即为蔗糖酶提取液。

1、离子交换层析:通过调节液相pH值,利用离子交换材料对蔗糖酶进行吸附、洗脱和分离。

2、凝胶过滤层析:利用凝胶材料对蔗糖酶进行筛分,分离出不同分子量的蔗糖酶。

3、亲和层析:在固相材料上引入亲和基团,用于特异性地吸附蔗糖酶,洗脱和分离目标蛋白。

1、透析:通过半透膜对蔗糖酶真空透析,去除杂质。

2、浓缩:利用超滤膜对蔗糖酶进行浓缩。

3、电泳:运用电泳等方法对混合蛋白进行分离和分析,以实现蔗糖酶的纯化。

蔗糖酶的活性检测方法多种多样,以下介绍其中几种常见的方法。

1、邻苯二甲酸法:通过对邻苯二甲酸恒量反应条件下,测量比色产物的吸光度来检测蔗糖酶的活性。

2、甲酚磺酸法:测量甲酚磺酸转化为带电离子的速率,来判断蔗糖酶活性的多少。

3、蔗糖酶显色法:在蔗糖酶的作用下,蔗糖水解生成葡萄糖和果糖,再利用淀粉-碘酒作为指示剂,显色程度来反映蔗糖酶的活性。

总结:蔗糖酶是一种重要的酶类,在生命科学和工业生产等领域具有广泛应用。

其提取、分离、纯化及活性检测方法多种多样,需要根据不同的实验条件和需求来选择合适的方法。

酵母蔗糖酶的制备与活力测定

酵母蔗糖酶的制备与活力测定

酵母中蔗糖酶的制备及活力测定一、目的要求1、学习一种酵母中蔗糖酶的制备方法。

2.掌握3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)测定酶活力的原理和方法。

3. 掌握还原糖测定的基本原理和721分光光度计的操作。

二、实验原理蔗糖酶(invertase)(β—D—呋喃果糖苷果糖水解酶)(fructofuranoside fructohydrolase)(EC.3.2.1.26)特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解,具有相对专一性。

不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖,也能催化棉子糖水解,生成密二糖和果糖。

每水解1mol蔗糖,就生成2mol还原糖。

还原糖在碱性条件下加热可被氧化成糖酸及其它产物,而氧化剂3,5-二硝基水杨酸(DNS)则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计在520nm波长下测定光密度(OD)值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖的含量。

酶活力单位的定义:在一定条件下,反应5分钟每产生1mg还原糖所需的酶量为一个活力单位(U)。

三、仪器与试剂1. 仪器研钵,天平,离心机,721型分光光度计,恒温水浴,具塞试管25ml,沸水浴,移液器(1000ul、200 ul)2. 试剂市售酵母干粉,石英砂,丙酮(预冷), 1mg/ml葡萄糖溶液,pH4.5醋酸缓冲液, 10%蔗糖溶液,3,5-二硝基水杨酸溶液。

四、实验方法1. 蔗糖酶制备称取10g酵母干粉和少量石英砂放入研钵中,加适量蒸馏水,用力研磨30分钟成糊状,再加蒸馏水100ml,搅匀,6层纱布过滤,滤液加2倍体积冷丙酮搅匀,静置5分钟,离心管中,平衡后3000 rpm离心10 min,弃上清取沉淀。

沉淀用2倍体积丙酮重复操作一次。

沉淀真空干燥后称重。

再称取25mg酶粉加入少量蒸馏水研磨5分钟,用蒸馏水定容至40m l作为酶应用液备用。

2. 蔗糖酶活力测定(1)制作葡萄糖标准曲线取7支具塞刻度试管编号,按表1分别加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液、蒸馏水和DNS试剂,配成不同浓度的葡萄糖反应液。

实验七 蔗糖酶的制备和活力测定

实验七 蔗糖酶的制备和活力测定
0.1ml稀释后的酶A520—根据标准曲线计算反应中葡萄糖的产量—稀释的倍数——1ml酶活力
3、蔗糖酶制备过程中1ml 级分I和级分II中蛋白质的含量。 4、比活力的计算:
级分I和级分II中的蔗糖酶的活力 1ml级分I和级分II中蛋白质的含量
5、乙醇沉淀后的固体蔗糖酶(分装两支1.5ml离心管中,4℃保 存,备用)
实验 七 蔗糖酶的制备和比活力的测定
1. 酵母蔗糖酶的制备; 2. 各级分蔗糖酶溶液活性的测定; (包括葡萄糖标准曲线的制备) 3. 各级分蔗糖酶溶液蛋白质含量的测定; 4. 各级分蔗糖酶溶液比活力的计算。
蔗糖酶制备的原理
• 酵母中的蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内 侧,在细胞膜外细胞壁中的,称之为外蔗糖酶,其活力占蔗 糖酶活力的大部分,是含有 50% 糖成分的糖蛋白。在细胞 膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶,含有少量的糖。两种 酶的蛋白质部分均为双亚基,二聚体,两种形式的酶的氨 基酸组成不同,外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸,Ser和 Met ,它们的分子量也不同,外酶约为 27kDa( 或 22 kDa, 与酵母的来源有关),内酶约为13.5kDa。
H2O ml 二硝基水杨酸溶液ml
2
2
2
2
2
2
加毕混匀,盖上试管帽,于沸水浴(100℃)中准确煮5min,取出 用自来水冷却 3min ,加入 9ml 蒸馏水,混匀后以零号管调零,于 520nm 处测定光密度。以葡萄糖含量为横坐标,以光密度为纵坐 标画葡萄糖标准曲线图。

300mM蔗糖溶液ml
pH5.0醋酸缓冲液ml H2O
• 参照以前实验课中的考马斯亮蓝方法中的蛋白质浓度标准 曲线,计算出级分I和级分II中蛋白质含量。

蔗糖酶分离纯化与活力测定

蔗糖酶分离纯化与活力测定

考马斯亮兰法测定蛋白质含量的原理
考马斯亮兰G 250在酸性溶液时呈茶棕色,最大吸收峰在465nm。 考马斯亮兰G-250在酸性溶液时呈茶棕色,最大吸收峰在465nm。 在酸性溶液时呈茶棕色 465nm 当与蛋白质结合后变成深蓝色,最大吸收峰转至595nm,在10当与蛋白质结合后变成深蓝色,最大吸收峰转至595nm, 10595nm 100μg/mL蛋白质浓度范围内成正比 蛋白质浓度范围内成正比; 100μg/mL蛋白质浓度范围内成正比; 测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数,使其测定值在标准曲 测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数, 线的直线范围内 根据所测定的A595nm值 在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量, 根据所测定的A595nm值,在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量, A595nm 从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL) 从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)
热处理和乙醇沉淀
预先将恒温水浴调到50℃ 将盛有粗级分I 50℃, (1) 预先将恒温水浴调到50℃,将盛有粗级分I的离心管稳妥 下保温30分钟, 地放入水浴中,50℃下保温30分钟 地放入水浴中,50℃下保温30分钟,在保温过程中不断轻 摇离心管。 摇离心管。 取出离心管, 冰浴中迅速冷却, 4℃,10000rpm, (2) 取出离心管,于冰浴中迅速冷却,用4℃,10000rpm,离 10min。 心10min。 将上清液转入小烧杯中,放入冰盐浴( (3) 将上清液转入小烧杯中,放入冰盐浴(没有水的碎冰撒 入少量食盐),逐滴加入等体积预冷至-20℃的95%乙醇 ),逐滴加入等体积预冷至 乙醇, 入少量食盐),逐滴加入等体积预冷至-20℃的95%乙醇, 同时轻轻搅拌,共需30分钟,再在冰盐浴中放置10分钟, 30分钟 10分钟 同时轻轻搅拌,共需30分钟,再在冰盐浴中放置10分钟, 以沉淀完全。 4℃,10000rpm,离心10min 倾去上清, 10min, 以沉淀完全。于4℃,10000rpm,离心10min,倾去上清, 并滴干,沉淀保存于离心管中,盖上盖子或薄膜封口, 并滴干,沉淀保存于离心管中,盖上盖子或薄膜封口,然 后将其放入冰箱中冷冻保存(称为“级分Ⅱ )。 后将其放入冰箱中冷冻保存(称为“级分Ⅱ”)。

蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测

蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测

蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展,不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究,越来越需要纯度更高的酶制剂,这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。

本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。

在实验过程中用乙醇分级分离法,DEAE-Cellulose 柱层析,分子筛(凝胶过滤)层析提取纯化蔗糖酶。

在实验过程中,虽然我们很努力, 但由于我们对实验的程序不熟悉,因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误,使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。

关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离DEAE-Cellulose 柱层析分子筛层析Km 前言生物体内所发生的一切化学反应,几乎都是在专一性酶的催化下进行的,因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。

随着分子生物学的发展,不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一,纯度高的酶制剂。

这就要求人们建立各种方法,以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。

由于酶本身也是蛋白质,因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同,一般来说,没有一种固定的方法,而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。

各种酶的纯化通常有五个阶段:①材料的选择与预处理;②细胞破碎;③抽提;④纯化;⑤浓缩﹑干燥及保存。

酶分离纯化成功与否的重要标志:一是要有较高的收率;二是达到所要求的纯度,这两个指标通常是矛盾的,可根据需要来有所侧重,一般来说,好的方法与步骤应该是简单易行,最终的酶制剂有较高的收率和纯度。

就单独的每种分离提纯的方法而言,有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法(纸层析、薄板层析、柱层析等)。

其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法,该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等,其中用得最多的是硫酸铵,因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。

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酶 活 测 定
1(级分I和级分 测定管) (级分 和级分 测定管) 和级分II测定管 10%蔗糖溶液 蔗糖溶液ml 蔗糖溶液 pH5.0醋酸缓冲液 醋酸缓冲液ml 醋酸缓冲液 0.60 1.30 25℃水浴中保温3min ℃水浴中保温 稀释X倍以后的酶液 稀释 倍以后的酶液ml 级分I和级分 和级分II) (级分I和级分II) 0.10 25℃水浴5min ℃水浴 二硝基水杨酸试剂0.5ml 二硝基水杨酸试剂 0.1mol/LNaOH溶液 溶液2.5ml 溶液 沸水浴煮5min 沸水浴煮 二硝基水杨酸试剂0.5ml 二硝基水杨酸试剂 2(对照I和对照 ) (对照 和对照 和对照II) 0.60 1.30 0.1mol/LNaOH溶液 溶液2.5ml 溶液 0.10
取出后经自来水冷却3min,以标准曲线的“0”管调零点,于540nm , 标准曲线的“ 管调零点 管调零点, 取出后经自来水冷却 处测光密度值。以测定管的光密度值减去对照管光密度值, 处测光密度值。以测定管的光密度值减去对照管光密度值,求得的差 值从标准曲线上查得相应的葡萄糖含量, 乘以10, 值从标准曲线上查得相应的葡萄糖含量,并乘以 ,即为每 1ml酶溶 酶溶 液的活力。(对照管中酶液最后加入) 。(对照管中酶液最后加入 液的活力。(对照管中酶液最后加入)
实 验 结 果
1、葡萄糖浓度的标准曲线 2、蔗糖酶制备过程中的级分I和级分II中的蔗糖酶的活力。(每 1ml酶溶液的活力)
0.1ml稀释后的酶A540—根据标准曲线计算反应中葡萄糖的产量—稀释的倍数——1ml酶活力
3、蔗糖酶制备过程中1ml 级分I和级分II中蛋白质的含量。 4、比活力的计算:
级分I和级分II中的蔗糖酶的活力 1ml级分I和级分II中蛋白质的含量
蔗糖酶活性测定原理
• 蔗糖酶特异性催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键水 解,具有相对专一性,能催化蔗糖水解生成D-果糖和 D-葡萄糖,也能水解棉子糖生成密二糖和果糖 • 3,5-二硝基水杨酸与还原糖在强碱性溶液中沸水浴 生成棕红色氨基化合物.在540nm处有最大吸收,在 一定范围内颜色深浅与还原糖浓度成正比 • 酶活性单位为,在一定条件下反应5min,每产生1mg 葡萄糖所需要的酶量。实际应用是1 ml酶液所产生 葡萄糖的量定为1ml酶液的活力。 • 酶的比活力,每 mg酶蛋白质所具有的酶活力。
加毕混匀,盖上试管帽,于沸水浴( 加毕混匀,盖上试管帽,于沸水浴(100℃)中准确煮 ℃ 中准确煮5min,取 , 出用自来水冷却3min,以零号管调零点,于540nm处测定光密度。 处测定光密度。 出用自来水冷却 ,以零号管调零点, 处测定光密度 以葡萄糖含量为横坐标,以光密度为纵坐标画葡萄糖标准曲线图。 以葡萄糖含量为横坐标,以光密度为纵坐标画葡萄糖标准曲线图。
实验 七 蔗糖酶和制备和比活力的测定
1. 酵母蔗糖酶的制备 2. 各级分蔗糖酶溶液活性的测定 包括葡萄糖标准曲线的制备) (包括葡萄糖标准曲线的制备) 3. 各级分蔗糖酶溶液蛋白质含量的测定 4. 各级分蔗糖酶溶液比活力的计算
蔗糖酶制备的原理
• 酵母中的蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内 侧,在细胞膜外细胞壁中的,称之为外蔗糖酶,其活力占蔗 糖酶活力的大部分,是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞 膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶,含有少量的糖。两种 酶的蛋白质部分均为双亚基,二聚体,两种形式的酶的氨 基酸组成不同,外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸,Ser和 Met,它们的分子量也不同,外酶约为27kDa(或22 kDa, 与酵母的来源有关),内酶约为13.5kDa。 • 两种酶底物专一性和动力学性质仍十分相似,因此,本实 验未区分内酶与外酶,而且由于内酶含量很少,极难提取, 本实验采用研磨水抽提,提取纯化的主要是外酶。
5、乙醇沉淀后的固体蔗糖酶(分装两支1.5ml离心管中,4℃保 存,备用)
思 考 • 比较级分I和级分II的比活力,试分析级分II比活力高 的原因。
葡萄糖标准曲线的制备
管号 试剂 标准葡萄糖溶液 (1mg/ml) ml ) pH5.0 0.1M醋酸缓冲液 醋酸缓冲液 ml 二硝基水杨酸溶液ml 二硝基水杨酸溶液 0.1mol/LNaOH溶液 溶液ml 溶液 0 2.0 0.5 2.5 0.6 1.4 0.5 2.5 0.8 1.2 0.5 2.5 1.0 1.0 0.5 2.5 1.2 0.8 0.5 2.5 1.4 0.6 0.5 2.5 0 1 2 3 4 5
蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝方法)
• 对照:0.5ml水+5ml考马斯亮蓝溶液,混匀后室温放置5分 钟以上。 • 样品:将级分I和级分II分别稀释100或者50倍,取稀释后 的酶液0.4ml,加入0.1ml水,混匀后加入5ml考马斯亮蓝 0.4ml 0.1ml 5ml 溶液,混匀后室温放置5分钟以上。 • 对照作为参比,测定级分I和级分II的A595。 • 参照以前实验课中的考马斯亮蓝方法中的蛋白质浓度标准 曲线,计算出级分I和级分II中蛋白质含量。 公式: y=0.0035x X代表溶液的浓度(µg/ml),Y代表595nm下的吸收值。
蔗糖酶制备的方法
• 实验方法参看实验指导教材(p76)。 • 注意级分II同书上有所不同。在第二步进行热处理(50℃, 30分钟)后,离心后将上清转移到离心管中,此时取离心管 中的上清约1.5ml,放在小离心管中,作为级分II。 • 乙醇沉淀后的固体蔗糖酶,等量分装在两个1.5ml的离心管中, 4℃下保存,做为下两次实验中的酶。
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