DNA印迹与杂交技术课件PPT
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DNA的提取原理：裂解细胞，使DNA释 放，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性 剂，有效去除蛋白质
标准程序：酚——酚-氯仿——氯仿。
16
17
2. 待测DNA 样品的电泳分离： 琼脂糖凝胶电泳
18
A
B
C
M 琼脂糖凝胶电泳
bp
—1534
— 994 — 695
— 515
— 377 — 237
19
3. 凝胶中DNA的变性：碱变性
24
25
（2）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到
固相支持物上。
26
（3）真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜
在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上， 利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝 胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段 转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。
第二 是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的DNA或 RNA探针进行杂交
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杂交模式图
－
DNA印迹转移
探针杂交
放射自显影
＋
13
Southern bloting的主要步骤
1.待测DNA样品的制备、酶切 2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜(印迹)：
3
Hybridization of Nucleic Acids
DNA1
DNA2
DNA RNA
探针
probe
Northern
Southern
hybridization
hybridization
4
（一）DNA变性与复性
DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的
氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性。
第三节 核酸分子杂交技术
DNA印迹与杂交技术 RNA印迹与杂交技术
1
一、 分子杂交的基本方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
固相杂交
2
二、核酸分子杂交的基本原理
• 具有互补序列两条单链核酸分子在一定 条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链 的过程。 • 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列， 已知核酸序列称探针。
分离、转印到固相支持物上，用探针进行检 测的方法。 应用：基因组DNA的定性和定量分析
基因诊断、分子克隆、法医学等
11
在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或 RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而 且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此， 核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。 材料：尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE） 步骤： 第一 将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上－核酸印迹转移 电泳凝胶核酸印迹法、 斑点和狭线印迹法、 菌落和噬菌斑印迹法
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复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定
条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸 的过程，称复性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成 双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、 寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。
8
2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 （3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列 （4）形成完整的双链分子
ຫໍສະໝຸດ Baidu23
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的 DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器 中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠， 上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤 纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动 凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA 片段移出凝胶而滞留在膜上。
5
2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
双链核酸分子链间的氢键断裂。
6
3、变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加
22
4.2 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
9
核酸的分子杂交
将带有互补的特定核 苷酸序列的单链DNA或 RNA混合在一起，其相应 的同源区段就会退火形成 双链结构。如果退火的核 酸来自不同的生物有机体， 所形成的双链分子就被称 为杂种核酸分子。
10
三、Southern blotting DNA印迹与杂交
1975年，英国Edwen Southern创建 定义：检测DNA杂交方法，即将DNA电泳
凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为 较短的单链 DNA，中性缓冲液中和凝胶中的 缓冲液。
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4. Southern转膜(印迹)
待测定核酸分子通过一定的方法转移并结 合到一定的固相支持物（如纤维素膜）上， 即印迹。
21
4.1 固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性
①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 非特异吸附少
毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测
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（a）
Southern 凝 （b） 胶转移杂交
技术
基因组DNA
DNA限制片段
（c）
（d） 硝酸纤维素滤膜
（e）
同探针同源杂交的 基因DNA片段
X光底片
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步骤解析
1. 待测DNA样品的制备、酶切
27
28
各种转移方法的比较 i) 毛细管虹吸法：操作简便，不需要特殊转 移仪器，但转移效率低,（扩散法为70%， 毛细管法80%）耗时多。 ii) 电转移法：效率高，耗时少，需特殊转 移仪，对转移条件要求较严。 iii) 真空转移法：效率高，耗时最少，需特 殊真空转移仪。
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转移的最佳条件
i) 固定基质的选择 ii) 转移前预处理：DNA和RNA分子变性，蛋白质 则需除去凝胶中的SDS。 iii)大分子的转移 对于分子量较大的DNA片段，必须进行原位断裂 后再进行转移，断裂DNA分子最佳长度为1-2kb。 其步骤是： 0.25M HCl处理凝胶两次（每次15分钟） →水洗→0.5M NaOH/1M NaCl两次，每次15分钟→ 转移。
标准程序：酚——酚-氯仿——氯仿。
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2. 待测DNA 样品的电泳分离： 琼脂糖凝胶电泳
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B
C
M 琼脂糖凝胶电泳
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— 994 — 695
— 515
— 377 — 237
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3. 凝胶中DNA的变性：碱变性
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（2）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到
固相支持物上。
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（3）真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜
在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上， 利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝 胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段 转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。
第二 是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的DNA或 RNA探针进行杂交
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杂交模式图
－
DNA印迹转移
探针杂交
放射自显影
＋
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Southern bloting的主要步骤
1.待测DNA样品的制备、酶切 2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜(印迹)：
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Hybridization of Nucleic Acids
DNA1
DNA2
DNA RNA
探针
probe
Northern
Southern
hybridization
hybridization
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（一）DNA变性与复性
DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的
氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性。
第三节 核酸分子杂交技术
DNA印迹与杂交技术 RNA印迹与杂交技术
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一、 分子杂交的基本方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
固相杂交
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二、核酸分子杂交的基本原理
• 具有互补序列两条单链核酸分子在一定 条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链 的过程。 • 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列， 已知核酸序列称探针。
分离、转印到固相支持物上，用探针进行检 测的方法。 应用：基因组DNA的定性和定量分析
基因诊断、分子克隆、法医学等
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在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或 RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而 且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此， 核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。 材料：尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE） 步骤： 第一 将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上－核酸印迹转移 电泳凝胶核酸印迹法、 斑点和狭线印迹法、 菌落和噬菌斑印迹法
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复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定
条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸 的过程，称复性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成 双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、 寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。
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2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 （3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列 （4）形成完整的双链分子
ຫໍສະໝຸດ Baidu23
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的 DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器 中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠， 上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤 纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动 凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA 片段移出凝胶而滞留在膜上。
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2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
双链核酸分子链间的氢键断裂。
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3、变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加
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4.2 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
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核酸的分子杂交
将带有互补的特定核 苷酸序列的单链DNA或 RNA混合在一起，其相应 的同源区段就会退火形成 双链结构。如果退火的核 酸来自不同的生物有机体， 所形成的双链分子就被称 为杂种核酸分子。
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三、Southern blotting DNA印迹与杂交
1975年，英国Edwen Southern创建 定义：检测DNA杂交方法，即将DNA电泳
凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为 较短的单链 DNA，中性缓冲液中和凝胶中的 缓冲液。
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4. Southern转膜(印迹)
待测定核酸分子通过一定的方法转移并结 合到一定的固相支持物（如纤维素膜）上， 即印迹。
21
4.1 固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性
①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 非特异吸附少
毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测
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（a）
Southern 凝 （b） 胶转移杂交
技术
基因组DNA
DNA限制片段
（c）
（d） 硝酸纤维素滤膜
（e）
同探针同源杂交的 基因DNA片段
X光底片
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步骤解析
1. 待测DNA样品的制备、酶切
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各种转移方法的比较 i) 毛细管虹吸法：操作简便，不需要特殊转 移仪器，但转移效率低,（扩散法为70%， 毛细管法80%）耗时多。 ii) 电转移法：效率高，耗时少，需特殊转 移仪，对转移条件要求较严。 iii) 真空转移法：效率高，耗时最少，需特 殊真空转移仪。
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转移的最佳条件
i) 固定基质的选择 ii) 转移前预处理：DNA和RNA分子变性，蛋白质 则需除去凝胶中的SDS。 iii)大分子的转移 对于分子量较大的DNA片段，必须进行原位断裂 后再进行转移，断裂DNA分子最佳长度为1-2kb。 其步骤是： 0.25M HCl处理凝胶两次（每次15分钟） →水洗→0.5M NaOH/1M NaCl两次，每次15分钟→ 转移。