质粒DNA的提取与酶切鉴定
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep管中； 7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀，室温放 置2min. 8、12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙醇洗涤 一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干， 然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含50 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓 冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)， 存于－20℃或直接用于酶切。
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管, 以混匀 内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变 性并形成交联的网状结构
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置2～3min； 溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部分变性的闭环
试剂： LB培养基 氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL； 溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)，
25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml
2、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链 DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段 的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特 性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、III型三大类， Ⅰ类和III类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及 依赖ATP的限制性内切酶活性。Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识 别位点，但却随机地切割回转到被结合处的DNA。Ⅲ类限制性内 切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ限 制酶在基因工程中基本不用，II类酶在分子克隆中使用广泛。
在20 L 反应液中反应1h，使1 g DNA完全消化所需的酶量.
2、轻轻混匀, 4000g离心10秒 ，置于37℃水浴中酶解2-3h。
3、酶解完成后，电泳检测酶切结果。
六、 实验结果报告
1、质粒浓度的计算（紫外分光光度计法） 紫外分光光度法测定核酸含量 双链DNA含量=OD260nm×样品稀释倍数×50ug／ml=ug/m1 样品
实验四 质粒DNA的提取与酶切鉴定
一. 实验目的和要求
1、了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分离、 提取质粒DNA的方法； 2、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法；
通过本实验了解限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作用。
二.实验原理
1、碱裂解法小量制备质粒DNA：碱裂解法是基于线性大分子染 色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异达到分离目 的的，在pH12.0～12.6的碱性环境中，线型染色体DNA和环型 质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于 其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分 离 ； 当 将 pH 值 调 节 到 中 性 并 在 高 盐 浓 度 下 ， 已 分 开 的 染 色 体 DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，通过离心，大 部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白质-SDS复合物等 一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒DNA在中 性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶 液中，离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。
四、碱裂解法小量制备质粒DNA
1、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基 中，37℃震荡培养12～16小时；
2、将1.5mL菌液加入Ep离心管中，12000 g离心30 Sec，弃上清液， 在吸水纸上扣干； 离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮
3、加入100L预冷的溶液I ，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞， 尽量使细胞分散； 溶液I中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取过程 中的机械剪切力，防止染色体DNA 的断裂；EDTA的作用是与 二价离子（Ca2＋）结合，降低DNase对DNA的降解
2、质粒提取与酶切鉴定电泳结果，贴上打印实验照片并标明 照片上各DNA条带的含义。
七、思考题
1、根据DNA限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰 酶活性可分为几种类型？其中II类限制性内切酶有何特性？
2、在用碱裂解法小量制备质粒过程中I液、II液与III液的作用是什 么？
百度文库
其基本特点如下：
(1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如EcoR I识别与
切割序列为
5`····GAATTC····3`
3`····CTTAAG····5`
(2)、识别的核苷酸数目大多数为4～6个，少数识别8～13个；
(3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶产生
的是具有凸出的粘性末端：
冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，pH8.0；
5×TBE缓冲液：0.45mol/L Tris－硼酸，0.01 mol/L EDTA, pH 8.0； 10×Loading buffer：1% SDS, 0.05%溴酚兰，50％的甘油； 无水乙醇；70％乙醇； 标准分子量片段； 核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解缓冲液(10× buffer H)； 琼脂糖； 溴化乙啶（EB）染色液(10mg/ml)。
质粒图谱:
五、 提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳
1、在1.5mL Ep管中依次加入下列溶液于1.5ml离心管中
提取质粒DNA
4.0 L
10× buffer H
1.0 l
EcoR I
1.0 l （2.0 U）
dd H2O
4.0 L
10 L
1U: 1单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下，
(4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割 的位点也相同，称为同裂酶或异源同工酶，如Hpa II与Msp I；有 的识别位点不同，但对DNA切割后可产生相同的粘性末端，称为同 尾酶，如BamH I与Bgl II。
三．实验材料与设备：
超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡 器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、 电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、Tip头 、烧杯、量筒
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep管中； 7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀，室温放 置2min. 8、12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙醇洗涤 一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干， 然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含50 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓 冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)， 存于－20℃或直接用于酶切。
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管, 以混匀 内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变 性并形成交联的网状结构
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置2～3min； 溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部分变性的闭环
试剂： LB培养基 氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL； 溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)，
25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml
2、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链 DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段 的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特 性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、III型三大类， Ⅰ类和III类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及 依赖ATP的限制性内切酶活性。Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识 别位点，但却随机地切割回转到被结合处的DNA。Ⅲ类限制性内 切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ限 制酶在基因工程中基本不用，II类酶在分子克隆中使用广泛。
在20 L 反应液中反应1h，使1 g DNA完全消化所需的酶量.
2、轻轻混匀, 4000g离心10秒 ，置于37℃水浴中酶解2-3h。
3、酶解完成后，电泳检测酶切结果。
六、 实验结果报告
1、质粒浓度的计算（紫外分光光度计法） 紫外分光光度法测定核酸含量 双链DNA含量=OD260nm×样品稀释倍数×50ug／ml=ug/m1 样品
实验四 质粒DNA的提取与酶切鉴定
一. 实验目的和要求
1、了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分离、 提取质粒DNA的方法； 2、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法；
通过本实验了解限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作用。
二.实验原理
1、碱裂解法小量制备质粒DNA：碱裂解法是基于线性大分子染 色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异达到分离目 的的，在pH12.0～12.6的碱性环境中，线型染色体DNA和环型 质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于 其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分 离 ； 当 将 pH 值 调 节 到 中 性 并 在 高 盐 浓 度 下 ， 已 分 开 的 染 色 体 DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，通过离心，大 部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白质-SDS复合物等 一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒DNA在中 性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶 液中，离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。
四、碱裂解法小量制备质粒DNA
1、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基 中，37℃震荡培养12～16小时；
2、将1.5mL菌液加入Ep离心管中，12000 g离心30 Sec，弃上清液， 在吸水纸上扣干； 离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮
3、加入100L预冷的溶液I ，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞， 尽量使细胞分散； 溶液I中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取过程 中的机械剪切力，防止染色体DNA 的断裂；EDTA的作用是与 二价离子（Ca2＋）结合，降低DNase对DNA的降解
2、质粒提取与酶切鉴定电泳结果，贴上打印实验照片并标明 照片上各DNA条带的含义。
七、思考题
1、根据DNA限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰 酶活性可分为几种类型？其中II类限制性内切酶有何特性？
2、在用碱裂解法小量制备质粒过程中I液、II液与III液的作用是什 么？
百度文库
其基本特点如下：
(1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如EcoR I识别与
切割序列为
5`····GAATTC····3`
3`····CTTAAG····5`
(2)、识别的核苷酸数目大多数为4～6个，少数识别8～13个；
(3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶产生
的是具有凸出的粘性末端：
冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，pH8.0；
5×TBE缓冲液：0.45mol/L Tris－硼酸，0.01 mol/L EDTA, pH 8.0； 10×Loading buffer：1% SDS, 0.05%溴酚兰，50％的甘油； 无水乙醇；70％乙醇； 标准分子量片段； 核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解缓冲液(10× buffer H)； 琼脂糖； 溴化乙啶（EB）染色液(10mg/ml)。
质粒图谱:
五、 提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳
1、在1.5mL Ep管中依次加入下列溶液于1.5ml离心管中
提取质粒DNA
4.0 L
10× buffer H
1.0 l
EcoR I
1.0 l （2.0 U）
dd H2O
4.0 L
10 L
1U: 1单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下，
(4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割 的位点也相同，称为同裂酶或异源同工酶，如Hpa II与Msp I；有 的识别位点不同，但对DNA切割后可产生相同的粘性末端，称为同 尾酶，如BamH I与Bgl II。
三．实验材料与设备：
超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡 器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、 电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、Tip头 、烧杯、量筒