胚胎移植

流式细胞仪精子分离技术
根据X、Y精子表面所带电 荷不同将他们分离开。
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三、显微受精的方法学
显微操作工具制备
注射管（针）5-6微米 固定管（针）120微米
显微操作的基本方法
部分透明带切除(PZD); 透明带下精子注射(SUZI); 卵胞浆单精子注射(ICSI)。
四、影响显微受精的因素
显微操作方法和技术水平的影响（带下或者 胞质内） 精子状态
精子获能和顶体反应的影响 活动能力与冷冻精子的影响 精子的死活对受精的影响 精子发生阶段对受精的影响
与精子分离技术的结合 与重构卵母细胞技术的结合 与早期胚胎遗传检测技术的结合 与性成熟前雌性动物活体采卵技术结合
1、以圆形精子细胞进行ICSI
应用卵细胞质内注入法将圆形精子细胞(核)注入卵 细胞内, 因圆形精子细胞经过了两次减数分裂,染色 体同精子一样为单倍体,与卵核的融合应该没有困 难。但仅仅注入核不能使卵细胞活化,所以必须事 先给卵细胞以电刺激使之活化。注入圆形精子细胞 (核)的卵细胞与普通的显微法注入精子的卵细胞相 同, 形成两个原核, 成为正常核型的受精卵。胚胎 的获得率与通常的ICSI同样良好,向母鼠子宫内胚 胎移植,产仔率为28.2%。
3、以初级精母细胞进行ICSI
应用初级精母细胞受精的研究,Sosagana等取得了显 著成绩。把初级精母细胞核注入到第二次减数分裂 中期的卵细胞中,则与次级精母细胞的情形相同可形 成纺缍体。进行人工活化后可放出含半数染色体的 极体。但是初级精母细胞染色体为次级精母细胞的2 倍,具有精子4倍DNA 的减数分裂前细胞, 进行1 次分 裂后注入核的DNA 为2 倍体,与雌性前核融合后,形成 三倍体的胚。为了获得正常核型的受精卵,他们采用 了以下方法: 即取出有2 倍DNA 的极体的核, 注入到 新生的第2 次减数分裂中期的卵细胞中, 再一次让其 在卵细胞内进行减数分裂,从而获得一个正常核型的 胚胎。此方法需2个卵母细胞和两次注射过程。
球形精子注射后原核形成过程与正常受精卵的对比
2、以次级精母细胞进行ICSI
木村等还用第一阶段未成熟的次级精母细胞进行了小鼠实验。 次级精母细胞为第二减数分裂之前的细胞,有精子和精子细胞2 倍DNA。因此若想获得正常的受精卵,必须让次级精母细胞的 染色体在卵子内进行减数分裂变成与精子相同的单倍体。将次 级精母细胞核注入到第2次减数分裂中期的卵细胞质内,1小时 后核染色体发生前成熟染色质浓缩(PCC),90～120分钟后注入 的染色体与卵子的染色体即第二次减数分裂中期的染色体一样 出现赤道面并排, 形成纺缍体。这时与卵子的染色体相同,分裂 停止,人为地加之于电刺激使之活化, 随着卵细胞减数分裂的再 进行,注入的核染色体也进行减数分裂卵细胞的第二极体与来 自于次级精母细胞的极体共同放出,卵子内形成两个原核,这两 个核均为单倍体, 融合后形成二倍体的正常核型的受精卵, 此 可谓划时代的实验。用此方法可见,80%形成纺缍丝,加之电刺 激后,75%成为正常的原核期卵,其中又有98%成为2细胞期 胚,65%可发育成胚泡,并且把2～4细胞期胚胎进行移植,可有 24%能正常产子。
卵母细胞状态 卵母细胞的激活
五、小鼠显微受精的方法示例
卵母细胞准备
超排；回收COCs；去卵丘；
培养液
CZB；Hepes-CZB
精子准备 固定针与注射针的准备 精子注入 胚胎培养 胚胎移植
Pizeo-drilled injection
精子注射过程图示：
六、显微受精相关问题探讨
球形精子细胞的显微受精 次级精母细胞的显微受精后发育模式 初级精母细胞的显微受精后发育模式 显微受精与其他技术的结合
第二篇
胚胎移植 及相关技术
第四章
哺乳动物显微受精
一、显微受精概念
显微受精（Microfertilization）是20世纪 80年代后期才发展起来的一种新型的体外 受精技术，即借助显微操作仪将精子或生 精细胞直接注入卵母细胞质内或卵周隙来 实现受精的过程。
二、显微受精技术发展简史
1988 Mann，小鼠单精子带下受精成功，Iritani 兔单精子胞质内注射成功； 1990 Goto，牛单精子胞质内注射成功； 1990 Lippi，人单精子胞质内注射成功； 1990 Ogura，小鼠精子细胞融合法获得仔鼠； 1995 Kimura，小鼠次级精母细胞注射获得仔鼠； 1997 黄振勇，小鼠初级精母细胞融合法“受精后” 形成原核；
• 再一种方法即不采用第二次减数分裂中期的卵细胞, 而用第一次减数分裂中期的卵细胞。这样注入初级 精母细胞核后在卵细胞中与卵细胞核一同进行2次减 数分裂,第一次减数分裂不停止直接放出极体,第二次 减数分裂中仍然有一个停歇,这时进行人工活化,卵母 细胞、精母细胞的核都将分裂,放出第2极体。这时残 留的染色体为单倍体,融合后可形成正常的受精卵。 因为操作复杂,体外培养的时间长, 比圆形精子细胞及 次级精母细胞注入的生存率和胚胎发生率低则不可 避免。获得的258个2细胞期胚移植后,有2个正常产子, 但遗憾的是一只出生后不久就死去, 另一只3周后死 亡原因不明。与产子率低综合来看,用初级精母细胞 进行ICSI的困难是很明显的。