抗体纯化技术

亲和层析法
概念
利用蛋白质分子对其配体分子的特异识别和可逆结合的特性建立起来的一种有效的分离纯化方 法。
蛋白A/G亲和层析
Protein A/G是金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合 的结构域，可结合多种免疫球蛋白的Fc部分，特异性结合非常牢固，但其亲和力对pH的变化 敏感，会随pH的降低而急剧下降，因此可用于纯化不同来源的抗体及抗体亚型。该法具有极 高的选择性，通常一步层析就可达到超过95%的纯度。
抗体异质性(heterogeneity)指抗体在结构和功能上差 异的总和。不同抗原表位刺激所产生的抗体分子，其 识别的抗原的特异性不同；不同抗体分子的可变区和 恒定区、重链类别（γ、α、μ、 δ 、 ε ）和轻链型别 （ λ 、 κ ）也存在差异。
五类免疫球蛋白的功能各不相同，IgG是血清和细胞 外液中的主要抗体成分，约占血清Ig总量75%~80% ，是再次体液免疫应答产生的主要抗体，半衰期长、 亲和力高、分布广泛，IgG1、IgG2和IgG4可通过其 Fc段与葡萄球菌蛋白A结合；IgM（5%~10%）主要 在早期防御、初次应答中起作用；IgA（10~15%） 主要参与粘膜免疫。
亲和层析法 离子交换层析法 疏水层析法 反向层析法 ……
工业纯化（略）
模拟移动床色谱 双水相萃取 膜色谱 ……
图5 精细纯化层析方法分类
方法分类-续
图6 纯化设备举例（层析系统、层析柱、移动床设备）
盐析法
概念
盐析是指在高浓度的中性盐存在下，蛋白质等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生 沉淀的过程。
特点：该方法简单易行，可一次处理大量样品，应用范围较广（一般用于纯化IgG1和IgG2b， 不适用于IgM或IgA的纯化，对IgG3的纯化效果也不佳）。
说明：该方法是在硫酸铵沉淀法的基础上结合有机溶剂沉淀法发展而来的经验性方法，在实际 操作中，正辛酸的用量随抗体来源不同有差异。
图7 沉淀法纯化方案选择
聚乙二醇沉淀
概念：在一定盐浓度条件下向溶液加入亲水性极强的聚乙二醇(PEG)引起大分子溶质非特异性 凝聚沉淀的方法。
其他沉淀方法-续
辛酸-硫酸铵沉淀
原理：在酸性条件下（pH4.8）向血清中加入一定量的短链脂肪酸，使血浆蛋白中的清蛋白、 α 及β免疫球蛋白成分沉淀，取以IgG成分为主的上清液再经硫酸铵沉淀得到进一步纯化。
天然的Protein A分子量为42kDa，含有4个Ig Fc结合位点，其中2个有活性。用于纯化抗体的 多为重组的Protein A，含有4个活性结合位点，rProtein A经基因工程改造后含有一个C末端 半胱氨酸，可以单一位点定向偶联于琼脂糖骨架上，有效降低空间位阻，增加了与IgG 的结合 能力；同时配基在发酵和纯化过程中没有引用人源的IgG，避免了人源IgG的污染风险。
应用
25℃时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L，定义为100%饱和度。通常情况下，在24%硫酸铵饱 和度以下很少有蛋白质沉淀下来，而在55%硫酸铵饱和度时会有多数蛋白质沉淀，当硫酸铵饱 和度达到80%以上时，几乎所有的蛋白质都会沉淀下来。
硫酸铵溶解度高，溶于水时产生的热量少，高浓度时可抑制微生物和蛋白酶的活性。
抗体纯化技术
从免疫血清/腹水中提纯抗体的 一般方法及相关探讨
CONTENTS 目录
第一部分 纯化简介 第二部分 主要流程 第三部分 注意事项 第四部分 操作实例 第五部分 互动问答 第六部分 参考资料
第一部分
纯化Hale Waihona Puke Baidu介
抗体简介
免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)即抗体(antibody, Ab)，是血液和组织液中一类糖蛋白，由B细胞接受抗 原刺激后增殖分化为浆细胞所产生，是体液免疫的重 要效应分子。
等电点沉淀
概念：利用蛋白质在等电点(pI)时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离 的方法。
原理：在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，分子净电荷为零，相互之间的作用力减 弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀。
特点：不同蛋白质pI不同，同一蛋白质在不同条件下pI不同；操作中以不引入过多杂质离子并 尽可能降低酸碱条件对蛋白的活性影响为原则；此法分辨率较低，宜与其它方法联用。
制备抗体纯化原则：
明确用途，按需处理 来源不同，方法有别 提高产率，节约成本
图3 实验方案设计原则
纯化选择
表3 蛋白质特性及对应纯化策略
纯化选择-续
图4 纯化步骤（上图）及产率变化（下图）的关系
方法分类
初步纯化
盐析法 有机沉淀法 凝胶过滤法 ……
精细纯化
其他沉淀方法
有机溶剂沉淀
概念：利用与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低 而沉淀的方法，称为有机溶剂沉淀.
原理：脱水作用；使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。 特点：沉淀蛋白质分辨力比盐析法好，溶剂容易除去；易影响蛋白质的活性，故应在低温下操
作并注意搅拌。
图1 抗体的结构
抗体简介-续
图2 抗体的分类 表1 鼠源免疫球蛋白的理化特性
表2 不同来源的抗体样品中的主要杂质
抗体制备
人工制备抗体技术：
多克隆抗体（polyclonal antibodies, PcAbs）
单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）
基因工程抗体（genetic engineering antibody, GEAb）
原理
将大量盐加入蛋白质溶液后，水化力很强的高浓度的盐离子会破坏蛋白质的水化膜，使蛋其周 围的水化膜层减弱乃至消失，暴露出憎水区域，从而容易碰撞聚集；
中性盐加入蛋白质溶液后，会使蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度 降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
特点
沉淀条件温和，不会引起生物物质变性失活； 分离效果一般，通常只是作为初步的分离纯化，但非蛋白的杂质夹带沉淀很少； 适用范围广，操作简单、安全、经济； 盐份含量高，提纯后的样品溶液需脱盐。