凝血因子抗体检测(王学锋)
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• 平行曲线：报标准曲线上相对应的因子活 性
• 不平行曲线：提示有抑制物存在，进行抑 制物检测，包括因子抗体和狼疮抗凝物
凝血因子活性检测
• FVIII为例：
Test .
Clotting time(s)
100
Standard
. .
80
.
1/40
.
60
1/20
.
1/10
40
20
5
10
20 30
50
100
量较少，不予使用
76.2 空白=1u/dL，不予使 用
61
尽管 FVIII <1, 但该曲线
过于平坦，不予使用
注意事项
• 使用同一批号的APTT试剂：APTT试剂的 激活程度各批号间存在差异
• 乏因子血浆更换批次时需重新定标
抗体测定原理
• 抗体的确定和定量均是在待检血浆中加入外源性 因子（如正常混合血浆）形成混合物，即刻或经 一定时间孵育后，检测目的因子活性减低的量， 同时检测对照（用确定不含抗体的血浆）中因子 活性减低程度。
• Type 2 抗体：II型酶动力曲线，灭活FVIII量 不呈时间依赖性，表现为所取得的BU值与 稀释度不成正比。
Type I型抗体结果判读
剩余FVIII活性（%） 结果报告
>80
阴性
66-80
阴性，但需同时报告剩 余FVIII水平
<66
BU值
Type II 型抗体结果判读
剩余FVIII BU 活性（%）
1:5
1:10
49.3
54.9
77.3
83.8
48.6
54
95.5
96.8
58.2
67.5
147
150
42.8
49.9
93
93
35.7
39.8
77.8
77.6
1:20
1:40
1:80
61
65.5
70.9
84.8
Blank=4u/dL
59.7
65.7
71.8
96.3
Blank=<1u/dL
76.5
86.7
+
质控标 本300ul
标准品的准备
• 根据待测血浆中FVIII活性基数，制备相应的 标准品
FVIII活性 基数 <10
15
25
Nijmegen 血浆量 100ul
115ul
125ul
FVIII乏因子 血浆量 100ul
85ul
75ul
• 水浴结束后立刻将试管置于冰上，防止 FVIII降解
• 同FVIII活性测定方法检测经孵育后样本中 的剩余FVIII活性。
96.1
No end point
55.5
Blank=<1u/dL
63.0
69.8
94.6
Blank=1u/dL
44.4
50.3
56.1
78
Blank=<1u/dL
1:160
结果
77.3
不予使用，因该乏因子血
浆中FVIII活性为 4u/dL
78.6
可用于重症血友病患者的
检测
105
FVIII<1，但该批号的供应
Brand: Pacific Haemostasis Lot No:800-601x Expiry Date:01/2009 Blank
Brand: Dade Lot No:536550 Expiry Date:22/11/2008 Blank Brand: Technoclone Lot No:486900D Expiry Date:31/12/2008 Blank
（每次均需有新的定标曲线）
结果判读
• 取最接近50%活性的稀释度，在半对数表上读 取相应的Bethedsa单位，然后乘以相应的稀释 倍数即为该份标本的抗体滴度。
稀释度 残余FVIII活性 BU单位
1/4 23.5%
2.02
1/8 49.1%
1
1/16 68.3%
0.68
结果 8
• Type 1 抗体：I型酶动力曲线，FVIII灭活量 呈时间依赖性，表现为所取得的BU值与稀 释度成正比。
9
>2
18
>2
32
1.6
38
1.4
45
1.1
稀释度
原倍 1/2 1/4 1/8 1/16
BU结果
>2 >4 6.4 11.2 17.5
Type II 型抗体结果判读
剩余FVIII活性（%） >80 66-80 <66
结果报告
阴性
阴性，同时报告剩余 FVIII活性
BU 结果：需同时报告下列两个值 1.剩余FVIII水平在30-60%之间的 稀释度所得的BU值 2.最接近50%剩余FVIII活性的稀 释度所对应的BU值
FVIII抗体单位
• 新的和旧的Oxford单位：已弃用 • Bethesda单位：目前ISTH推荐的世界统一
的标准单位
1BU定义：37℃孵育2小时后，中和正常血浆 （FVIII活性100%）中50%的FVIII所需抑制物的 量
Nijmegen方法
• 1.Nijmegen混合血浆的制备：
采集20人份健康人（安静状态下）全血5-10ml/ 人份，用咪唑枸橼酸钠抗凝（PH7.4），采血后立 即置于冰上，3000rpm离心20min，取血浆混匀， 分别置于10ml离心管中再进行3000rpm离心20min， 取上清液混匀，分装1ml/管，取一份进行FVIII活 性测定，余-80℃冻存备用，标明制备日期。
凝血因子活性和抗体检测
上海交通大学医学院附属瑞金医院 王学锋
凝血因子活性测定原理
• 基于APTT的凝血因子活性测定：内源性凝 血因子，包括
FVIII:C, FIX:C, FXI:C, FXII:C, FX:C
• 基因PT的凝血因子活性测定：外源性凝血 因子，包括
FVII:C, FII:C, FV:C, FX:C
FVIII抗体检测 Nijmegen法
• 老的Bethesda法缺点：在低抗体滴度的情况 下可出现假阳性结果
• 1996年ISTH推荐用改良的Bethesda法：采用 Nijmegen混合血浆，其为经过PH缓冲的正 常人混合血浆，稳定性、特异性和敏感性 更好。该方法的名称为Nijmegen法。
适用于所有产生抗体的病人体内抗体水平检测：无论其 所用的为何种替代治疗产品（包括Refacto）
• 检测因子活性的方法可以采用一步法（APTT）或 发色底物法。
• 免疫法检测不适合于抗体测定，因为其不能区分 所检测的抗体是否具有生物学活性
抗体类型
• 时间依赖型抗体：FVIII
• 时间非依赖性抗体：其他相关凝血因子抗 体
抗体检测临床意义
• 抗体阳性：获得性 因子替代治疗后产生抗体
• 指导免疫抑制剂的使用 • 指导所需因子的使用量 • 监测出血倾向
1
111
9
2
116
10
3
100
11
4
110
12
5
108
13
6
110
14
7
105
15
8
120
16
mean
Factor VIII activity 110 120 110 120 113 110 110 112
110
在使用时，需将Nijmegen血浆进行稀释，使其终浓 度为100%
3.检测：
准备患者血浆、标准品和质控品，若怀疑 FVIII抗体滴度较高，需将患者血浆进行一定 比例的稀释，常用稀释度为：1/2，1/4，1/8， 1/16，加入等量Nijmegen血浆后置于37℃水 浴2小时（加盖）
Factor VIII activity (%)
Ratio 1/1 1/2 1/4
SCr=-1.000
Clot time 99.0 sec
Activity % 9.5%
103.0 sec
15.3%
106.0 sec
26.1%
Mean 17.0% Test r=-0.996
STD .
ຫໍສະໝຸດ Baidu
自动化血凝仪检测FVIII：C结果及其 结果分析，如图显示，该样本为lupus 阳性，FVIII：C在正常范围,对于此类 样本解决方法：
注：制备过程中最好使用塑料容器
• 2.Nijmegen血浆定标：
取制备好的Nijmegen血浆一份，检测其 FVIII活性，需采用两种标准品分别进行检 测，多次检测后取平均值
Calibration of Nijmegen
sample
1/5
标准品 1(118) Nijmegen 标准品2(52) 51.1 Nijmegen 标准品2(50) 51.1 空白
• 2.准备乏因子血浆，根据说明书进行复溶， 置室温一定时间后备用
• 3.将试剂和样本置于仪器中的相应位置，先 进行标准曲线定标，后再进行样本检测
结果分析
• 标准曲线：在半对数表（因子活性取对数， APTT时间取直线）上做出标准曲线
• 在半对数表上作样本的曲线（三个稀释度 对应三点APTT值）
结果分析
1、发色底物法检测
2、两步法
3、高浓度的磷脂以中和LAC：LAC非 敏感的APTT试剂
sample
+
+
+
100
.
90
80
.
Activity %
10
70
.
.
60
20
30 40 50
70 90 120
注意事项
• 确定乏因子血浆为真正的乏因子血浆 important
Brand: Technoclone Lot No:4875A00 Expiry Date:30/6/2009 Blank Brand: Precision Biologic Lot No:D8-19 Expiry Date:04/2010 Blank
dilutions
1/10 1/20 48.4 54.9
49.5 55.6 56.4 61.6 49.3 55.5 55.8 61.2 92.5
result
1/40 标准品1 标准品2
60.4
61.8
110
120
61.3
110
120
<1
<1
Calibration of Nijmegen pool
Factor VIII activity
Nijmegen 血浆 300ul
+
原倍血 浆300ul
Nijmegen 血浆 300ul
+
½稀释 300ul
Nijmegen 血浆 300ul
+
¼稀释 300ul
Nijmegen 血浆300ul
+ 1/8稀释 300ul
Nijmegen 血浆 300ul
+
1/16稀释 300ul
Nijmegen 血浆 300ul
筛选试验
• 混合试验：不需要乏因子血浆
APTT 50/50： PT 50/50：同APTT 50/50
A：患者血浆
B：正常混合 血浆
C：患者血浆 和正常混合血 浆1：1混合
37度孵 育2小时
APTT检测：
1：取A管和B管中等量 的血浆混匀，检测 APTT（即刻结果）
2：直接测定C管的 APTT值（孵育后结果）
FVIII:C 检测原理
• 基于APTT测定
待检血浆 （FVIII缺乏）
+
乏FVIII因子血浆
（含有除FVIII因 子外的所有因子）
APTT检测
方法
• 1.样本、标准品和质控标本准备： 用因子稀释液对样本进行稀释： 标准品：1/10（100%） 样本：1/10，1/20，1/40（非常重要）
浓度极低时可采用1/5，1/10，1/20 质控标本：根据要求
• 不平行曲线：提示有抑制物存在，进行抑 制物检测，包括因子抗体和狼疮抗凝物
凝血因子活性检测
• FVIII为例：
Test .
Clotting time(s)
100
Standard
. .
80
.
1/40
.
60
1/20
.
1/10
40
20
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20 30
50
100
量较少，不予使用
76.2 空白=1u/dL，不予使 用
61
尽管 FVIII <1, 但该曲线
过于平坦，不予使用
注意事项
• 使用同一批号的APTT试剂：APTT试剂的 激活程度各批号间存在差异
• 乏因子血浆更换批次时需重新定标
抗体测定原理
• 抗体的确定和定量均是在待检血浆中加入外源性 因子（如正常混合血浆）形成混合物，即刻或经 一定时间孵育后，检测目的因子活性减低的量， 同时检测对照（用确定不含抗体的血浆）中因子 活性减低程度。
• Type 2 抗体：II型酶动力曲线，灭活FVIII量 不呈时间依赖性，表现为所取得的BU值与 稀释度不成正比。
Type I型抗体结果判读
剩余FVIII活性（%） 结果报告
>80
阴性
66-80
阴性，但需同时报告剩 余FVIII水平
<66
BU值
Type II 型抗体结果判读
剩余FVIII BU 活性（%）
1:5
1:10
49.3
54.9
77.3
83.8
48.6
54
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96.8
58.2
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147
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42.8
49.9
93
93
35.7
39.8
77.8
77.6
1:20
1:40
1:80
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65.5
70.9
84.8
Blank=4u/dL
59.7
65.7
71.8
96.3
Blank=<1u/dL
76.5
86.7
+
质控标 本300ul
标准品的准备
• 根据待测血浆中FVIII活性基数，制备相应的 标准品
FVIII活性 基数 <10
15
25
Nijmegen 血浆量 100ul
115ul
125ul
FVIII乏因子 血浆量 100ul
85ul
75ul
• 水浴结束后立刻将试管置于冰上，防止 FVIII降解
• 同FVIII活性测定方法检测经孵育后样本中 的剩余FVIII活性。
96.1
No end point
55.5
Blank=<1u/dL
63.0
69.8
94.6
Blank=1u/dL
44.4
50.3
56.1
78
Blank=<1u/dL
1:160
结果
77.3
不予使用，因该乏因子血
浆中FVIII活性为 4u/dL
78.6
可用于重症血友病患者的
检测
105
FVIII<1，但该批号的供应
Brand: Pacific Haemostasis Lot No:800-601x Expiry Date:01/2009 Blank
Brand: Dade Lot No:536550 Expiry Date:22/11/2008 Blank Brand: Technoclone Lot No:486900D Expiry Date:31/12/2008 Blank
（每次均需有新的定标曲线）
结果判读
• 取最接近50%活性的稀释度，在半对数表上读 取相应的Bethedsa单位，然后乘以相应的稀释 倍数即为该份标本的抗体滴度。
稀释度 残余FVIII活性 BU单位
1/4 23.5%
2.02
1/8 49.1%
1
1/16 68.3%
0.68
结果 8
• Type 1 抗体：I型酶动力曲线，FVIII灭活量 呈时间依赖性，表现为所取得的BU值与稀 释度成正比。
9
>2
18
>2
32
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38
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45
1.1
稀释度
原倍 1/2 1/4 1/8 1/16
BU结果
>2 >4 6.4 11.2 17.5
Type II 型抗体结果判读
剩余FVIII活性（%） >80 66-80 <66
结果报告
阴性
阴性，同时报告剩余 FVIII活性
BU 结果：需同时报告下列两个值 1.剩余FVIII水平在30-60%之间的 稀释度所得的BU值 2.最接近50%剩余FVIII活性的稀 释度所对应的BU值
FVIII抗体单位
• 新的和旧的Oxford单位：已弃用 • Bethesda单位：目前ISTH推荐的世界统一
的标准单位
1BU定义：37℃孵育2小时后，中和正常血浆 （FVIII活性100%）中50%的FVIII所需抑制物的 量
Nijmegen方法
• 1.Nijmegen混合血浆的制备：
采集20人份健康人（安静状态下）全血5-10ml/ 人份，用咪唑枸橼酸钠抗凝（PH7.4），采血后立 即置于冰上，3000rpm离心20min，取血浆混匀， 分别置于10ml离心管中再进行3000rpm离心20min， 取上清液混匀，分装1ml/管，取一份进行FVIII活 性测定，余-80℃冻存备用，标明制备日期。
凝血因子活性和抗体检测
上海交通大学医学院附属瑞金医院 王学锋
凝血因子活性测定原理
• 基于APTT的凝血因子活性测定：内源性凝 血因子，包括
FVIII:C, FIX:C, FXI:C, FXII:C, FX:C
• 基因PT的凝血因子活性测定：外源性凝血 因子，包括
FVII:C, FII:C, FV:C, FX:C
FVIII抗体检测 Nijmegen法
• 老的Bethesda法缺点：在低抗体滴度的情况 下可出现假阳性结果
• 1996年ISTH推荐用改良的Bethesda法：采用 Nijmegen混合血浆，其为经过PH缓冲的正 常人混合血浆，稳定性、特异性和敏感性 更好。该方法的名称为Nijmegen法。
适用于所有产生抗体的病人体内抗体水平检测：无论其 所用的为何种替代治疗产品（包括Refacto）
• 检测因子活性的方法可以采用一步法（APTT）或 发色底物法。
• 免疫法检测不适合于抗体测定，因为其不能区分 所检测的抗体是否具有生物学活性
抗体类型
• 时间依赖型抗体：FVIII
• 时间非依赖性抗体：其他相关凝血因子抗 体
抗体检测临床意义
• 抗体阳性：获得性 因子替代治疗后产生抗体
• 指导免疫抑制剂的使用 • 指导所需因子的使用量 • 监测出血倾向
1
111
9
2
116
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105
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8
120
16
mean
Factor VIII activity 110 120 110 120 113 110 110 112
110
在使用时，需将Nijmegen血浆进行稀释，使其终浓 度为100%
3.检测：
准备患者血浆、标准品和质控品，若怀疑 FVIII抗体滴度较高，需将患者血浆进行一定 比例的稀释，常用稀释度为：1/2，1/4，1/8， 1/16，加入等量Nijmegen血浆后置于37℃水 浴2小时（加盖）
Factor VIII activity (%)
Ratio 1/1 1/2 1/4
SCr=-1.000
Clot time 99.0 sec
Activity % 9.5%
103.0 sec
15.3%
106.0 sec
26.1%
Mean 17.0% Test r=-0.996
STD .
ຫໍສະໝຸດ Baidu
自动化血凝仪检测FVIII：C结果及其 结果分析，如图显示，该样本为lupus 阳性，FVIII：C在正常范围,对于此类 样本解决方法：
注：制备过程中最好使用塑料容器
• 2.Nijmegen血浆定标：
取制备好的Nijmegen血浆一份，检测其 FVIII活性，需采用两种标准品分别进行检 测，多次检测后取平均值
Calibration of Nijmegen
sample
1/5
标准品 1(118) Nijmegen 标准品2(52) 51.1 Nijmegen 标准品2(50) 51.1 空白
• 2.准备乏因子血浆，根据说明书进行复溶， 置室温一定时间后备用
• 3.将试剂和样本置于仪器中的相应位置，先 进行标准曲线定标，后再进行样本检测
结果分析
• 标准曲线：在半对数表（因子活性取对数， APTT时间取直线）上做出标准曲线
• 在半对数表上作样本的曲线（三个稀释度 对应三点APTT值）
结果分析
1、发色底物法检测
2、两步法
3、高浓度的磷脂以中和LAC：LAC非 敏感的APTT试剂
sample
+
+
+
100
.
90
80
.
Activity %
10
70
.
.
60
20
30 40 50
70 90 120
注意事项
• 确定乏因子血浆为真正的乏因子血浆 important
Brand: Technoclone Lot No:4875A00 Expiry Date:30/6/2009 Blank Brand: Precision Biologic Lot No:D8-19 Expiry Date:04/2010 Blank
dilutions
1/10 1/20 48.4 54.9
49.5 55.6 56.4 61.6 49.3 55.5 55.8 61.2 92.5
result
1/40 标准品1 标准品2
60.4
61.8
110
120
61.3
110
120
<1
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Calibration of Nijmegen pool
Factor VIII activity
Nijmegen 血浆 300ul
+
原倍血 浆300ul
Nijmegen 血浆 300ul
+
½稀释 300ul
Nijmegen 血浆 300ul
+
¼稀释 300ul
Nijmegen 血浆300ul
+ 1/8稀释 300ul
Nijmegen 血浆 300ul
+
1/16稀释 300ul
Nijmegen 血浆 300ul
筛选试验
• 混合试验：不需要乏因子血浆
APTT 50/50： PT 50/50：同APTT 50/50
A：患者血浆
B：正常混合 血浆
C：患者血浆 和正常混合血 浆1：1混合
37度孵 育2小时
APTT检测：
1：取A管和B管中等量 的血浆混匀，检测 APTT（即刻结果）
2：直接测定C管的 APTT值（孵育后结果）
FVIII:C 检测原理
• 基于APTT测定
待检血浆 （FVIII缺乏）
+
乏FVIII因子血浆
（含有除FVIII因 子外的所有因子）
APTT检测
方法
• 1.样本、标准品和质控标本准备： 用因子稀释液对样本进行稀释： 标准品：1/10（100%） 样本：1/10，1/20，1/40（非常重要）
浓度极低时可采用1/5，1/10，1/20 质控标本：根据要求