农杆菌介导转基因的原理
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。
二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。
共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。
三、材料及方法1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。
2.植物幼苗。
（一）细菌培养液直接浸染法操作︰（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。
取自无菌试管苗。
取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。
（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。
（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。
取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。
从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。
取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
农杆菌介导法
目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。 其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰丁 香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没食 子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟基 苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。 双子叶植物在在农杆菌侵染时可以形成大量的信号因子， 而使T- DNA可以成功的转入； 而单子叶植物需要加入外源酚类物质，才能激活Vir区 的基因，达到转基因的目的。
1974年，Zaenen et al, Schell, Van Larebeke et al. 从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒 (tumor inducing plasmid)，称为Ti质粒。 Ti=TIP 1977年，Chilton et al.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存 在外源的DNA ,与Ti质粒的DNA有同源性，是整 合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段， T- DNA (transferred DNA),其内有致瘤和冠瘿 碱合成酶等基因。 1981年，Ooms et al.发现Ti质粒上有致瘤区(virulence region)，Vir区。
VirD
4.5
4
16,47,21,75
C/M?
T-DNA border endonuclease (VirD1 and VirD2); pilot protein? nuclear localization?(VirD2)
VirC
2.0
2
26,23
C?
processing of T-DNA(VirC1)
最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接 受环境中的信号分子。 在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状 态，进而激活vir区其他基因表达。 其中virD基因产物virD1蛋白是一种DNA松弛酶，它可使DNA从超螺旋型转变为 松弛型状态；而virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T-DNA，2个边界产生缺口，使 单链T-DNA得以释放。 VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T-DNA结合蛋白。可使T-DNA形成1个细长的 核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。 T-复合体依次穿过根癌农杆菌和植物细胞膜及细胞壁。并进入植物细胞核，最终 整合进入植物核基因组。 T-DNA的转移机理比较复杂，依赖于T-DNA区和vir区共同参与，涉及多个基因表 达及一系列蛋白质和核酸的相互作用。
农杆菌转基因法
农杆菌转化法的原理是构建双元表达载体系统，由两种质粒组成，一种是位于大肠杆菌中的穿梭质粒，另一种是位于农杆菌中的辅助性质粒。
将重组质粒电转化到农杆菌感受态细胞中后，用含有重组质粒的农杆菌去侵染植物根部切口，通过辅助性质粒的Vir区表达蛋白与重组质粒T-DNA区（目的片段）的反式作用激活T-DNA的转移（此处可参见词条双元表达载体系统），从而将目的片段整合到紫云英根部细胞基因组中。
随着愈伤组织的形成以及根部细胞的分裂与分化，使得新生根部细胞均含有该目的片段的基因（时圣晴分析）。
农杆菌介导遗传转化原理
!
冠瘿碱代谢基因
农杆菌转化植物的过程 •植物受伤部位酚类化合物的分泌 •附着（chvA、chvB） •VirA/G的双组分系统感受受伤信号 （signal to A Pi to G） •其他Vir基因的表达 •T-DNA链的切出（VirD1+VirD2；Border to Border） •T-complex的形成 •运输（从细菌中输出、进入入植物细胞、入入核） •整合
A
B
C
PCR（A）、RT-PCR（B）和 Southern（C）鉴定结果
影响植物农杆菌转化效率的因素 •植物品种（基因型效应）； •农杆菌菌株及载体； •起始材料； •侵染所用用菌浓度（OD值）； •共培养条件(温度、时间、光照、培养基成分)； •共培养之后的筛选方方式； 等等；
农杆菌介导的 植物遗传转化
农杆菌的分类 革革兰氏氏阴性菌、杆状； 按侵染植物的后果分为： •根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 形成冠瘿（crown gall） •发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes） 形成发根（hairy root）
按合成/代谢冠瘿碱（Opine）的种类，根癌农杆菌分为 ： •章⻥鱼碱（Octopine）型 •胭脂碱（Nopaline）型 •农杆碱（Agropine）型
The Plant Cell, Vol. 18, 3350–3352
冠瘿病的害处： 苗木木感病后发育受阻；生生⻓长缓慢；植株矮小小；严重 时叶片片萎蔫、早衰，甚至至死亡； 大大树受害后树势衰弱，生生⻓长不良，提前落叶，果实 变小小，树龄缩短。主干受害降低材质及工工艺价值。
农杆菌能够导致植物产生生冠瘿病的原因： Ti（Ri）质粒
•T-complex的转运 通过细菌细胞壁上由11个VirB蛋白白和VirD4组成的通 道从农杆菌向外输出
农杆菌介导的植物转基因技术
农杆菌介导的植物转基因技术
农杆菌介导的植物转基因技术（Agrobacterium-mediated plant transformation）是一种常用的植物遗传转化技术。
该技术利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体，将外源基因
导入目标植物细胞，使其产生转基因植物。
农杆菌天然具有植物细胞转化的能力。
当农杆菌感染植物时，其携带的质粒（T质粒）能够在植物细胞中插入外源基因，并
将其转化为转座子形式，随后将其整合入宿主植物基因组中。
转座子通常包含目标基因、转座酶和调控序列，它们共同确保外源基因正确表达。
T质粒还携带有自身所需的发育激素和植
物生长调节物质，以维持转化后细胞的生存和分裂。
农杆菌介导的植物转基因技术具有许多优点。
首先，它可以用于许多不同植物物种的基因转化。
其次，该技术可以实现整株或局部的基因转化，包括细胞、组织、器官或整个植株。
此外，农杆菌介导的转基因技术可实现稳定遗传转化，外源基因可以遗传到植物后代中。
最后，该技术对植物基因组中的特定位点插入外源基因，使得外源基因可以与内源基因进行正常结合。
随着转基因技术的不断发展，农杆菌介导的植物转基因技术仍然广泛应用于研究和农业生产领域。
它为植物功能研究、抗病虫害、提高产量和改善品质等方面提供了有效手段。
然而，农杆菌介导的转基因技术也面临着一些挑战，如转化效率低、插入位点随机性以及响应植物抗性等问题。
因此，研究人员不断探索新的转基因技术和改进农杆菌介导的植物转基因技术的方法，以改善转基因植物的性状和应用。
农杆菌转基因原理
农杆菌转基因原理农杆菌转基因是一种常用的转基因技术，它利用了农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的天然特性，将外源基因导入植物细胞中。
这一技术被广泛应用于农业和生物技术领域，用于改良作物品种、提高农作物产量和抗病性，以及生产重要的药物和化学物质。
农杆菌是一种土壤中常见的细菌，它能够引起植物的根瘤病。
农杆菌感染植物时，会将一段称为T-DNA（转移DNA）的片段导入植物细胞中，从而改变植物的生长和代谢。
研究人员利用这一机制，将感兴趣的基因插入到农杆菌的T-DNA中，再让农杆菌感染植物细胞，从而实现对植物基因的改变。
农杆菌转基因的原理可以分为以下几个步骤：1. 基因的选择：研究人员首先要选择一个合适的基因，这个基因可以是来自同一物种的其他个体，也可以是来自不同物种的外源基因。
基因的选择要根据具体的目的，比如改良作物的耐盐性、抗虫性等特性。
2. 基因的构建：选择好基因后，研究人员需要将基因插入到农杆菌的T-DNA中。
这一步通常通过基因工程技术来完成，利用限制性内切酶将基因与载体DNA连接，然后将连接好的DNA转化到农杆菌细胞中。
3. 农杆菌的培养：转基因农杆菌需要在含有适当营养物质的培养基上培养，以增加其数量和活性。
培养过程中，研究人员还可以添加适当的抗生素来筛选出含有目标基因的农杆菌。
4. 植物的感染：培养好的农杆菌通常通过注射或浸泡等方式感染植物细胞。
在感染过程中，农杆菌会释放出T-DNA，将其导入植物细胞中。
T-DNA在植物细胞中的导入过程是通过一系列的生化反应和蛋白质相互作用完成的。
5. 基因的整合：一旦T-DNA进入植物细胞核，它会与植物细胞的基因组进行重组，将外源基因整合到植物染色体中。
整合的位置和数量是随机的，这也是转基因植物表现多样性的原因之一。
6. 转基因植物的筛选：为了筛选出含有目标基因的转基因植物，研究人员通常会在培养基中添加抗生素或选择性物质，只有含有目标基因的植物细胞才能生长和繁殖下去。
农杆菌转化法的原理
农杆菌转化法的原理
农杆菌转化法是一种利用外源DNA和农杆菌介导的在细胞内表达的方法。
该方法最早由美国生物化学家Herbert Boyer于1973年提出，并于1977年被用于创造第一个基因突变植物。
自此，农杆菌转化技术在分子生物学、分子遗传学、细胞生物学等领域取得了巨大成功，成为近十几年来生物技术发展中最重要的技术之一。
农杆菌转化法的原理是将外源DNA片段植入特定的农杆菌中，然后让农杆菌介导将外源DNA片段植入到宿主细胞中，以达到改变宿主基因的目的。
具体而言，首先需要在细胞中引入一种叫做“质粒”的载体，它可以携带外源DNA片段，然后在细胞中的特定位置，利用农杆菌提供的一些促进基因转移的酶将质粒植入细胞中。
农杆菌转化法为研究植物基因组提供了一种灵活、可靠、快速且高效的方法，可以用来改变植物的遗传特性，控制植物的生长发育状态，以及提高植物的产量和质量。
而且，农杆菌转化技术还可以用来为研究人员提供精确的模型，以更好地理解植物的基因表达和调控机制。
此外，农杆菌转化法还可以用于制造生物材料和医药，以及制造其他用途的产品。
因此，农杆菌转化法在生物技术领域具有重要的应用价值，是生物技术发展中最重要的技术之一。
农杆菌转化的原理
农杆菌转化的原理农杆菌转化是利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体将外源基因导入植物细胞的一种生物技术。
农杆菌转化的原理主要是由于农杆菌能够侵入植物细胞并将其特定DNA片段（Ti质粒）导入到植物细胞中。
农杆菌转化技术主要有两种，包括：有细胞壁组织的植物的整体组织转化和无细胞壁组织的植物的单细胞转化。
1. 整体植物组织转化整体植物组织转化是将植物芽的组织脱离植物本体，并在含有农杆菌的营养液中分化培养，使之获得外源基因之后，再将其重新接种到富含植物激素的培养基上生长。
在培养的过程中，细胞会产生突变，使得植物具有新的花色、形态等改变。
整体植物组织转化主要是利用农杆菌特定的质粒（Ti质粒），其中含有内生基因（T-DNA），这些内生基因经调节作用，可以进入植物细胞，并在转化后整合到目标植物细胞的基因组中。
2. 单细胞转化单细胞转化是将农杆菌侵入植物菌落的单细胞中，通过合适的培养条件将其转化为整株植物。
农杆菌转化的基本操作步骤包括：选择适合农杆菌转化的植物细胞，在压滴培养基上培养植物细胞，调节菌落的密度和浓度，将农杆菌和外源基因DNA共同渗透进入细胞内，并通过特定的转运蛋白将外源基因导入到植物细胞中。
该方法的优点是转化效率较高，可以在短期内获得多条转化株，是现在主要的转基因植物育种技术。
农杆菌转化技术虽然早已在实践中被广泛应用，但它仍存在着一些困难，如在转化过程中植物组织的内源抗菌物质会阻碍农杆菌人工导入外源基因。
相关研究显示，采用基因炮技术或利用激光微刻等技术进行基因导入也是可以实现植物基因转化的，但农杆菌转化技术仍是当前基因转化领域中被广泛采用的一种技术。
转基因的方法和原理
转基因的方法和原理在当今科技迅速发展的时代，转基因技术已经成为了一个备受关注的领域。
它不仅在农业、医学等领域有着广泛的应用，也引发了众多的讨论和争议。
那么，转基因到底是怎么一回事呢？让我们一起来了解一下转基因的方法和原理。
转基因技术，简单来说，就是将一种生物的基因转移到另一种生物的基因组中，从而赋予后者新的性状或特征。
这就像是给一个生物体进行了一场“基因改造手术”，让它拥有了原本没有的能力或特性。
要实现转基因，首先得有基因这个“原材料”。
基因是控制生物性状的基本遗传单位，它们就像是一个个小的指令代码，决定着生物体的外貌、生长发育、对环境的适应能力等。
科学家们要做的第一步，就是找到他们想要转移的特定基因。
找到目标基因后，接下来就是把它从原来的生物体中提取出来。
这可不是一件容易的事情，需要用到一系列复杂的生物技术手段。
常用的方法有从细胞中提取 DNA ，然后通过特定的酶将包含目标基因的片段切割下来。
有了目标基因，还得有个“运输工具”把它送到受体生物的细胞中去。
这个“运输工具”通常被称为载体。
常见的载体有质粒、病毒等。
以质粒为例，科学家们会对质粒进行改造，让它能够携带目标基因并且能够在受体细胞中稳定存在和复制。
把目标基因连接到载体上后，就形成了一个重组的 DNA 分子。
然后，通过一些方法，比如物理方法（如电击、显微注射等）、化学方法（如使用化学试剂促进基因进入细胞），将这个重组的 DNA 分子导入到受体细胞中。
受体细胞可以是植物细胞、动物细胞或者微生物细胞。
以植物细胞为例，常用的转基因方法有农杆菌介导法。
农杆菌是一种在自然界中存在的细菌，它能够将自己的一部分 DNA 转移到植物细胞中。
科学家们利用农杆菌的这个特性，将含有目标基因的载体导入农杆菌，然后让农杆菌感染植物细胞，从而实现基因的转移。
在动物细胞中，常用的转基因方法有显微注射法。
这种方法是使用非常细小的针头，将重组的 DNA 分子直接注射到受精卵的细胞核中，然后将这些经过处理的受精卵移植到雌性动物的子宫内，让其发育成个体。
农杆菌介导水稻转基因技术的原理与运用分析
·29·所谓的转基因技术实际上是DNA 技术的重组方式，从外源克隆到的优良基因直接地注入到植物体的基因组织当中来，对作物的遗传性特征进行改变，使其向着人类更加向往的发展方向。
转基因技术自从问世以来实现了非常快速的发展，目前全球种植转基因的作物越来越多。
农杆菌介导是转基因技术之一，其在水稻转基因当中的应用，采取的是外源基因转化的方式，使外源基因的转化更具更正性，降其为稳定性等，进而实现大片段的基因转换等。
近年来水稻转基因技术不断地发展，并取得了相当大的成效，其中农杆菌介导水稻转基因技术发胡了重要的作用，以下降低基本的原理以及运用情况进行重点分析。
1.基本原理农杆菌介导是一种天热性的基因转化系统。
在具体的划分过程中可以分诶根瘤农杆菌和发根农杆菌。
首先，根瘤农杆菌当中有一种肿瘤诱导颗粒，这种颗粒具有可转移性的DNA 以及毒性区和冠瘿碱代谢基因。
在T -DNA 的两端是在两个数为25bp 的重复性序列，分别位于左右两个边界当中，两个边界的序列之间又是生长素和细胞分裂素合成的共性基因以及冠瘿碱合成性基因。
不同的区域内存在多个基因段，每一个基因段当中又有非常多基因。
一旦植物出现被伤害的情况，就会分泌出具有酚类化合物的一种汁液，此种汁液是通过染色体的毒性基因等介导㢟进行传输的，从而使农杆菌可以向只的其他部位上进行移动，并附着在其表面之上。
在T -DNA的转移上两个边界序列与之关系非常密切，特别是右侧的边界对于T -DNA 的精准转移是必不可少的重要条件，而且在边界序列之间也存在着一定的基因，但这些基因对于T -DNA 的转移并不发生太大的影响。
因此，T -DNA 区域的基因是可以采取外源性基金进行替代的，之后再利用农杆菌将已经改造后的T -DNA 转移到植物的基因组织当中，进而获取到转基因的植株。
伴随着科学技术水平的不断提升，农杆菌转化也进入到了非常关键的阶段，人们对此进行了多次地改造，并使其载体不断地创新与完善，转化的效率不断地提升，这样应用的范围也会越来越广泛。
农杆菌介导的植物转基因技术实验指导
农杆菌介导的植物转基因技术一、实验目的1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。
2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。
二、实验原理农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。
农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。
因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
实验一培养基配制一、仪器和试剂1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台2、药品：Beef extract (牛肉浸膏) 5g/L ，Yeast extract (酵母提取物) 1g/L ，Peptone (蛋白胨) 5g/L ，Sucrose (蔗糖) 5g/L ， 100ml ，Agar (琼脂) 100ml， MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA（6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif），链霉素（str）。
二、实验方法第一组配制YEB固体培养基1、配制250mlYEB固体培养基：先称取 Beef extract (牛肉浸膏)； Peptone (蛋白胨)； Yeast extract (酵母提取物)； Sucrose (蔗糖)；1g ；琼脂粉；将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml，用NaOH调pH=。
2、灭菌：将盛有250ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。
3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60℃时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100μg/ml kan+50μg/ml Str+50μg/ml rif），以免温度过高导致抗生素失效。
农杆菌介导法讲解
因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人 们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的 感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过 细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来， 农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也 得到了广泛应用。
长度：160-250 kb 6大功能区： 1)致癌区，这个区主要合成植物
生长素和细胞分裂素； 2)冠瘿碱合成区； 3)冠瘿碱分解区； 4)Ti质粒接合转移区(tra)； 5)毒性区（Vir）； 6)DNA复制区（Rep）。
T-DNA
在致癌区和冠瘿碱合成区的两侧 存在着一个24 bp直接重复序列， 由这三部分所构成的DNA区域叫 做T-DNA， 插入植物染色体中的Ti质粒片段 只有T-DNA。 由于T-DNA插入植物细胞染色体 中的位置不相同的，因此植物染 色体上可能并没有可供T-DNA插 入的专一性DNA序列。
农杆菌介导转化法
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤 部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
农杆菌 感染柳树
产生 冠瘿瘤
原理： 根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和
Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口 进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。
1974年，Zaenen et al, Schell, Van Larebeke et al. 从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒 (tumor inducing plasmid)，称为Ti质粒。 Ti=TIP
1977年，Chilton et al.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存 在外源的DNA ,与Ti质粒的DNA有同源性，是整 合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段， T- DNA (transferred DNA),其内有致瘤和冠瘿 碱合成酶等基因。
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化
一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。
二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。
共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、茎段等共同培养的一种转化方法（图6－1）三、材料及方法1．含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。
2．植物幼苗。
（一）细菌培养液直接浸染法操作：（1）无菌受体材料的准备：叶片、茎段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。
①取自无菌试管苗。
②取自田间或温室栽培植株：叶片、茎尖、茎段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。
（2）受体材料预培养：将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、茎切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下：预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。
（3）农杆菌培养：①从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培为0.6～0.8。
②取OD600养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入600100～500μmol/的AS；（4）侵染：于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。
从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。
取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
（5）共培养：将侵染过的外植体接种在愈伤组织诱导或分化培养基上（烟草为MS 十IAA0.5mg/L BA2.0mg/L) ，在28℃暗培养条件下共培养2～4 天（光对某些植物的转化有抑制作用，故需暗培养，共培养时间因不同植物而异）。
农杆菌介导转化方法
农杆菌介导转化方法农杆菌介导转化方法是一种常用的基因转化技术，广泛应用于植物、微生物等领域。
本文将介绍农杆菌介导转化方法的原理、步骤和应用。
一、原理农杆菌介导转化方法是利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体，将外源基因导入目标细胞中的一种方法。
农杆菌是一种自然界广泛存在的土壤细菌，它能将其自身的DNA转移到植物细胞中，从而导致植物发生病理性变化。
利用这一特性，科学家将目标基因插入到农杆菌的载体DNA中，通过农杆菌的感染作用，将目标基因导入到目标细胞中。
二、步骤农杆菌介导转化方法通常包括以下几个步骤：1. 农杆菌培养：首先需要将含有目标基因的农杆菌培养至适宜的生长期，以保证其感染能力。
2. 植物处理：将目标植物的组织经过表面消毒处理，然后将其切割成小片或小块，以增加接触面积。
3. 农杆菌感染：将培养好的农杆菌与植物组织接触，使其感染植物细胞。
通常使用浸泡法或注射法进行感染。
4. 抗生素筛选：在感染后的组织中加入适当浓度的抗生素，以筛选转化成功的细胞。
只有携带目标基因的细胞才能够存活下来。
5. 培养和再生：将筛选出的转化细胞进行培养和再生，形成转基因植株。
三、应用农杆菌介导转化方法已成功应用于多种植物和微生物中，具有以下几个优点：1. 高效性：农杆菌介导转化方法可以在较短时间内实现大量基因转化，且转化效率较高。
2. 转基因稳定性：通过农杆菌介导转化方法获得的转基因植株通常具有较高的遗传稳定性，能够稳定地传递给下一代。
3. 广泛适用性：农杆菌介导转化方法适用于多种植物和微生物，包括农作物、果树、花卉等。
可以用于改良作物的品种、抗病性、耐逆性等性状。
4. 无需种子：与传统的植物遗传改良方法相比，农杆菌介导转化方法无需使用种子，能够直接利用植物的组织进行转化，节约了时间和资源。
5. 无需外界辅助：农杆菌介导转化方法不需要借助特殊设备或昂贵试剂，只需在实验室条件下进行即可。
农杆菌介导的转化作用原理
农杆菌介导的转化作用原理
农杆菌介导的转化是一种生物技术方法，用于将外源DNA引入植物细胞中。
其原理是利用农杆菌生长势旺盛、易于培养的特点，将目标外源DNA导入到农杆菌的质粒中，形成重组质粒。
然后通过将转化质粒与植物细胞接触，使其外源DNA传递到植物细胞内部。
具体步骤如下：
1. 构建重组质粒：在质粒中插入目标外源DNA，通常使用限制性内切酶将目标基因插入到质粒的多克隆位点（多克隆位点是一段DNA序列，能够容纳外源DNA）。
2. 转化农杆菌：将质粒导入到农杆菌中，使其质粒与细菌细胞融合，形成重组菌株。
3. 培养菌株：培养重组菌株，使其扩增到大量细胞。
4. 处理植物组织：将希望转化的植物组织（例如幼嫩的叶片或胚）与农杆菌接触，使农杆菌与植物细胞发生互作用。
5. 重组质粒转入植物细胞：通过机械方法（例如悬浮培养）或生理方法（例如创伤诱导），使农杆菌穿过植物细胞的细胞壁，使重组质粒进入植物细胞。
6. 重组质粒在植物细胞中复制和表达：重组质粒在植物细胞中复制，并将插入的目标基因转录和翻译为蛋白质。
通过农杆菌介导的转化方法，可以有效地将外源基因导入到植物细胞中，实现基
因转移和基因表达的目的。
这种方法在植物基因工程和转基因技术中得到广泛应用。
农杆菌介导遗传转化原理
农杆菌介导遗传转化原理农杆菌介导遗传转化是一种常用的遗传工程技术，用于将外源基因导入植物细胞中。
它的原理是利用农杆菌与植物之间相互作用的特点，通过构建适当的载体将外源基因导入农杆菌，然后通过农杆菌感染植物的细胞，将外源基因转移到植物细胞内，使其表达。
农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，具有携带可导致植物组织的病变形成的质体。
这种质体称为农杆菌的转座质粒（Ti质粒），其中包含了表达病原蛋白的基因。
在自然界中，农杆菌通过感染植物细胞并将自身质粒中转座基因转移到植物细胞中，从而引起植物组织的异常增生和瘤形成。
1.构建适当的载体：首先需要构建一个适合农杆菌介导遗传转化的载体，该载体通常包含农杆菌的图纸质粒与外源基因。
2. 转座基因的导入：将外源基因转移到农杆菌中，一般利用基因工程技术将外源基因插入到农杆菌的质粒中，通常选用表达农杆菌亲和素（VirA/VirG）基因的质粒。
这些基因能够诱导农杆菌感染植物细胞并转座到植物基因组中。
3. 农杆菌感染植物细胞：利用农杆菌对植物细胞的感染能力，将转座基因导入植物细胞中。
通常使用离体培养的植物组织进行转化，如幼苗的叶片、幼芽、胚轴等。
在转化过程中，植物组织被浸泡在含有农杆菌的培养液中，农杆菌利用其细菌素（VirE/VirF）蛋白，将转座质粒导入植物细胞中。
4.外源基因的整合与表达：经过转化的植物细胞在激素的诱导下会形成植物的癌瘤样结构，其中农杆菌转座质粒中的外源基因将被整合到植物基因组中。
随着癌瘤的生长，外源基因会在植物组织中得到表达。
5.植物再生和筛选：癌瘤样组织可通过激素的去除和调节激素比例来诱导植物再生。
然后通过选择合适的培养基和条件培养植物胚，获得含有外源基因的转基因植株。
农杆菌介导遗传转化技术广泛应用于植物基因工程中，可用于植物基因功能研究、育种改良、生产含有特定蛋白质的转基因植物等。
这种遗传转化技术具有高效性、简便性和广泛适用性的优点，已被应用于多种作物植物的转基因研究和应用实践中。
农杆菌转化法的原理
农杆菌转化法的原理农杆菌转化法是一种常用的植物基因转化技术，它利用土壤中的一种土壤细菌——农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）来将外源基因导入植物细胞中，从而实现对植物基因的改造。
这项技术在农业、园艺和植物生物技术领域有着广泛的应用，对于植物抗病、抗虫、抗逆境等性状的改良具有重要意义。
农杆菌转化法的原理主要包括以下几个步骤：1. 识别和感知，农杆菌在土壤中感知到植物根系分泌的酚类化合物，这些化合物是植物受伤后释放的信号物质，会引起农杆菌的趋化性，使其向植物根系靠近。
2. 结合和转移，农杆菌表面的Ti质粒（Tumor inducing，肿瘤诱导）含有一系列基因，其中的T-DNA（transfer DNA，转移DNA）是农杆菌用来转移到植物细胞中的外源基因的载体。
当农杆菌接近植物细胞时，T-DNA会被转移到植物细胞内。
3. 整合和表达，一旦T-DNA进入植物细胞内，它会在植物细胞染色体中随机整合，并开始在植物细胞中表达。
这样，外源基因就被导入了植物细胞中，从而实现了基因的转化。
农杆菌转化法的原理简单清晰，但其中涉及到的分子生物学和遗传学机制却十分复杂。
在实际操作中，研究人员需要精确地构建植物表达载体，包括选择适当的启动子和终止子，设计合适的选择标记基因，以及将目标基因插入到植物基因组中。
此外，还需要选择合适的农杆菌菌株和适宜的植物材料，进行细胞培养和再生等一系列复杂的操作步骤。
农杆菌转化法的原理虽然已经被深入研究和广泛应用，但在实际操作中仍然存在一些技术难题，比如转化效率低、随机整合和基因沉默等问题。
因此，未来的研究方向之一就是提高农杆菌转化的效率和精准性，以及改善转基因植物的遗传稳定性和安全性。
总之，农杆菌转化法作为一种重要的植物基因转化技术，其原理和应用具有重要的科学意义和实际价值。
随着生物技术的不断发展和进步，相信农杆菌转化法在农业生产和植物遗传改良领域将会发挥越来越重要的作用。
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农杆菌介导转基因的原理？
转基因技术的飞速发展为生物定向改良和分子育种提供了一种较佳的方法，并使其成为基因工程和育种的最有效途径，目前应用较广泛的转基因技术有农杆菌介导法、花粉通道法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法等等，其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐。
农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体，通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触，以完成可遗传细胞的转化，然后利用组织培养的方法培育出转基因植株，并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。
因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
农杆菌转化的详细机理已有大量综述, 并介绍新进展. 野生型根癌农杆菌能够将自身的一段DNA转入植物细胞. 因为转入的这一段DNA含有一些激素合成基因, 因而导致转化细胞自身激素的不平衡从而产生冠瘿瘤. 这些致瘤菌株都含有一个约200 kb的环状质粒, 被称为Ti(tumor inducing)质粒, 包括毒性区(Vir 区)、接合转移区(Con区)、复制起始区(Ori区)和T-DNA区4部分. 其中与冠瘿瘤生成有关的是Vir区和T-DNA区. 前者大小为30 kb, 分virA～J等至少10个操纵子, 决定了T-DNA的加工和转移过程. T-DNA可以将携带的任何基因整合到植物基因组中, 但这些基因本身与T-DNA的转移与整合无关, 仅左右两端各25 bp的同向重复序列为其加工所必需, 其中14 bp是完全保守的, 分10和4 bp不连续的两组. 两边界中以右边界更为重要.
VirA作为受体蛋白接受损伤植物细胞分泌物的诱导, 自身磷酸化后进一步磷酸化激活VirG蛋白; 后者是一种DNA 转录活化因子, 被激活后可以特异性结合到其他vir基因启动子区上游的一个叫vir框(vir box)的序列, 启动这些基因的转录. 其中, virD基因产物对T-DNA进行剪切, 产生T-DNA单链. 然后以类似于细菌接合转移过程的方式将T-DNA与VirD2组成的复合物转入植物细胞], 在那里与许多VirE2蛋白分子(为DNA单链结合蛋白)相结合, 形成T链复合物(T-complex). 在此过程中VirE1作为VirE2的一个特殊的分子伴侣具有协助VirE2转运和阻止它与T-DNA链结合的功能. 实验表明, 转基因植物产生的VirE2蛋白分子也能在植物细胞内与VirD2-T-DNA形成T链复合物. 之后, 这一复合物在VirD2和VirE2核定位信号(NLS)引导下以VirD2为先导被转运进入细胞核. 转入细胞核的T-DNA以单或多拷贝的形式随机整合到植物染色体上. 研究表明T-DNA优先整合到转录活跃区, 而且在T-DNA的同源区与DNA的高度重复区T-DNA的整合频率也比较高. 整合进植物基因组的T-DNA也有一定程度的缺失、重复、填充和超界等现象发生, 例如在用真空渗透法转化的拟南芥中有66%出现超界现象, 甚至有整个Ti质粒整合进植物基因组的报道, T-DNA超界转移现象的机理尚不完全清楚, 可能与其左边界周边序列有关.
现在, 对农杆菌感染过程中其本身因子的转录与调控已研究得相当深入, 但
是对被感染植物细胞中有关的分子过程以及作用机理知之甚少, 尽管已经有许多工作表明农杆菌的侵染与植物的基因型有关. 最近人们用拟南芥菜(Arabidopsis)研究这一问题, 取得了可喜的成就. 利用T-DNA插入突变, 有人分离出一些农杆菌感染缺陷的拟南芥菜突变体. 在这些突变体中, 农杆菌感染的阻断有的发生在感染早期, 表现为农杆菌向根部附着的频率降低, 有的则发生在随后T-DNA向植物细胞核转运和整合的过程中. 对这些突变体做进一步的研究, 无疑对弄清植物细胞在农杆菌侵染过程中所参与的因子有很大的帮助. 利用酵母双杂交系统(yeast two hybrid system), 研究者从拟南芥菜cDNA文库中分离出了和VirD2和VirE2特异互作的蛋白质, 如AtKAPa 和VirD2的核定位信号(NLS)特异结合, 转运T-链复合物到细胞核中; 另有几种被称为亲环素(cyclophlins), 能和VirD2和VirE2的非NLS结合, 详细功能尚不十分清楚. 关于T-DNA向基因组的整合, 虽然拟南芥菜uvh1基因一度被认为与此有关, 但是近来Preuss等人[22]证明, uvh1突变体在T-DNA的整合上与野生型农杆菌没有什么区别; 需要注意的是前者使用根为外植体, 而后者在拟南芥菜开花期使用真空渗透法, 被感染的是生殖细胞, 因此它们之间很可能并非是简单的否定关系, 而仅仅反映了有关的基因产物具有组织表达的特异性. 由这些结果看来, 不少植物因子直接参与了T-DNA在植物细胞中的转移和整合过程. 由于农杆菌在转化很不相同生物(真菌、裸子植物和单、双子叶被子植物)时自身内的转录调控过程基本相同, 因此发生在被感染细胞中的分子过程就成为决定农杆菌转化能否成功的最终因素, 所以对其进行研究对扩大农杆菌宿主范围具有重要意义.
根癌农杆菌的Ti质粒上有一段转移DNA（T-DNA），具有向植物细胞传递外源基因的能力，而细菌本身并不进入受体细胞。
农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，主要包括：
①受伤的植物细胞为修复创伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。
②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。
③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。
④转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。
因为单子叶植物不是农杆菌的天然寄主，况且其不能合成起诱导作用的信号分子，所以限制了农杆菌介导法在单子叶植物中的应用。
不过近年来大量成功转化的实例表明，植物、真菌、哺乳动物甚至人类细胞都可以作为农杆菌的受体。