农杆菌介导转基因的原理

农杆菌介导转基因的原理？

转基因技术的飞速发展为生物定向改良和分子育种提供了一种较佳的方法，并使其成为基因工程和育种的最有效途径，目前应用较广泛的转基因技术有农杆菌介导法、花粉通道法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法等等，其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐。农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体，通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触，以完成可遗传细胞的转化，然后利用组织培养的方法培育出转基因植株，并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

农杆菌转化的详细机理已有大量综述, 并介绍新进展. 野生型根癌农杆菌能够将自身的一段DNA转入植物细胞. 因为转入的这一段DNA含有一些激素合成基因, 因而导致转化细胞自身激素的不平衡从而产生冠瘿瘤. 这些致瘤菌株都含有一个约200 kb的环状质粒, 被称为Ti(tumor inducing)质粒, 包括毒性区(Vir 区)、接合转移区(Con区)、复制起始区(Ori区)和T-DNA区4部分. 其中与冠瘿瘤生成有关的是Vir区和T-DNA区. 前者大小为30 kb, 分virA～J等至少10个操纵子, 决定了T-DNA的加工和转移过程. T-DNA可以将携带的任何基因整合到植物基因组中, 但这些基因本身与T-DNA的转移与整合无关, 仅左右两端各25 bp的同向重复序列为其加工所必需, 其中14 bp是完全保守的, 分10和4 bp不连续的两组. 两边界中以右边界更为重要.

VirA作为受体蛋白接受损伤植物细胞分泌物的诱导, 自身磷酸化后进一步磷酸化激活VirG蛋白; 后者是一种DNA 转录活化因子, 被激活后可以特异性结合到其他vir基因启动子区上游的一个叫vir框(vir box)的序列, 启动这些基因的转录. 其中, virD基因产物对T-DNA进行剪切, 产生T-DNA单链. 然后以类似于细菌接合转移过程的方式将T-DNA与VirD2组成的复合物转入植物细胞], 在那里与许多VirE2蛋白分子(为DNA单链结合蛋白)相结合, 形成T链复合物(T-complex). 在此过程中VirE1作为VirE2的一个特殊的分子伴侣具有协助VirE2转运和阻止它与T-DNA链结合的功能. 实验表明, 转基因植物产生的VirE2蛋白分子也能在植物细胞内与VirD2-T-DNA形成T链复合物. 之后, 这一复合物在VirD2和VirE2核定位信号(NLS)引导下以VirD2为先导被转运进入细胞核. 转入细胞核的T-DNA以单或多拷贝的形式随机整合到植物染色体上. 研究表明T-DNA优先整合到转录活跃区, 而且在T-DNA的同源区与DNA的高度重复区T-DNA的整合频率也比较高. 整合进植物基因组的T-DNA也有一定程度的缺失、重复、填充和超界等现象发生, 例如在用真空渗透法转化的拟南芥中有66%出现超界现象, 甚至有整个Ti质粒整合进植物基因组的报道, T-DNA超界转移现象的机理尚不完全清楚, 可能与其左边界周边序列有关.

现在, 对农杆菌感染过程中其本身因子的转录与调控已研究得相当深入, 但

是对被感染植物细胞中有关的分子过程以及作用机理知之甚少, 尽管已经有许多工作表明农杆菌的侵染与植物的基因型有关. 最近人们用拟南芥菜(Arabidopsis)研究这一问题, 取得了可喜的成就. 利用T-DNA插入突变, 有人分离出一些农杆菌感染缺陷的拟南芥菜突变体. 在这些突变体中, 农杆菌感染的阻断有的发生在感染早期, 表现为农杆菌向根部附着的频率降低, 有的则发生在随后T-DNA向植物细胞核转运和整合的过程中. 对这些突变体做进一步的研究, 无疑对弄清植物细胞在农杆菌侵染过程中所参与的因子有很大的帮助. 利用酵母双杂交系统(yeast two hybrid system), 研究者从拟南芥菜cDNA文库中分离出了和VirD2和VirE2特异互作的蛋白质, 如AtKAPa 和VirD2的核定位信号(NLS)特异结合, 转运T-链复合物到细胞核中; 另有几种被称为亲环素(cyclophlins), 能和VirD2和VirE2的非NLS结合, 详细功能尚不十分清楚. 关于T-DNA向基因组的整合, 虽然拟南芥菜uvh1基因一度被认为与此有关, 但是近来Preuss等人[22]证明, uvh1突变体在T-DNA的整合上与野生型农杆菌没有什么区别; 需要注意的是前者使用根为外植体, 而后者在拟南芥菜开花期使用真空渗透法, 被感染的是生殖细胞, 因此它们之间很可能并非是简单的否定关系, 而仅仅反映了有关的基因产物具有组织表达的特异性. 由这些结果看来, 不少植物因子直接参与了T-DNA在植物细胞中的转移和整合过程. 由于农杆菌在转化很不相同生物(真菌、裸子植物和单、双子叶被子植物)时自身内的转录调控过程基本相同, 因此发生在被感染细胞中的分子过程就成为决定农杆菌转化能否成功的最终因素, 所以对其进行研究对扩大农杆菌宿主范围具有重要意义.

根癌农杆菌的Ti质粒上有一段转移DNA（T-DNA），具有向植物细胞传递外源基因的能力，而细菌本身并不进入受体细胞。农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，主要包括：

①受伤的植物细胞为修复创伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。

②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。

③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。

④转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。因为单子叶植物不是农杆菌的天然寄主，况且其不能合成起诱导作用的信号分子，所以限制了农杆菌介导法在单子叶植物中的应用。不过近年来大量成功转化的实例表明，植物、真菌、哺乳动物甚至人类细胞都可以作为农杆菌的受体