荧光分析法

解：25ml氧化液：荧光读数6.0格，相当于空白背景；
25ml测定液：荧光读数55格，实际核黄素的荧光读数为 55-6.0=49格；
24ml氧化液+1ml标准核黄素：荧光读数92格；
标准核黄素0.5µ g/ml：荧光读数92-6=86格；
样品溶液的浓度为：
49 0.5 0.2849 (g / 25ml) 86
1 分子振动总能量 EV （V ） h 2 当V=0时，分子处于基态， Ev = 1/2hν，即振动体系的能 量仍不为零。当V 0时， 分子处于激发态。
a
分子振动能级差 E振 V h
光子照射能量 E L h L
产生红外光谱前提 E振 EL
即 L V
中红外区：2.5~25μm
远红外区：25~500μm
振动、伴随转动光谱
纯转动光谱
二、红外吸收过程
分子中基团的振动和转动能级跃迁产生：振-转光谱 辐射→分子振动能级跃迁→红外光谱→官能团→分子结构 UV——分子外层价电子能级的跃迁（电子光谱） IR——分子振动和转动能级的跃迁 （振转光谱）
三、红外光谱的作用 1．可以确定化合物的类别（芳香类） 2．确定官能团： 例：—CO—，—C＝C—，—C≡C— 3．推测分子结构（简单化合物）
Fx F0 Cx Cs Fs F0
例题：1g谷物的制品试样，用酸处理，分离出核黄素(VB2) 及少量无关杂质，加入少量KMnO4，将核黄素氧化，过量 的KMnO4用H2O2除去。将此溶液移入50ml容量瓶中，稀释 至刻度。吸取25ml放入样品池中以测量荧光强度（核黄素 中常含有荧光的杂质叫光化黄）。事先将荧光计用硫酸奎宁 调整至刻度100处。测定得到氧化液的读数为6.0格。加入少 量的连二亚硫酸钠(Na2S2O4)，使氧化态核黄素（无荧光） 重新转化为核黄素，这时荧光计读数为55格。在另一样品池 中重新加入24ml被氧化的核黄素溶液，以及1ml核黄素标准 溶液0.5µ g/ml，这一溶液的读数为92格，计算每克样品中含 核黄素的µ g数？(课本P2307题)
F 2.3K ' I 0 ECl KC 为荧光定量分析法的依据。
荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高，是因为： 荧光分析法中与浓度相关的参数是荧光物质发射的荧光强度， 测量的方式是在入射光的直角方向，在黑暗或很弱背景上检测 所发射光(荧光)的强度信号，测定的灵敏度取决于检测器的灵 敏度，可以通过增大检测信号的放大倍数来提高灵敏度，使极 微弱的荧光也能被检测到，可以测定很稀的溶液；而在分光光 度法中与浓度相关的参数是吸光度(A=lgI0/I)，是一个比值，如 果增大检测器的放大倍数，检测到的入射光强度和透射光强度 同时增大，比值仍然不变，对提高检测灵敏度不起作用，所以， 荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高，一般要高2~3数量 级。
F∝(I0-I)
F K ' (I 0 I )
根据Beer定律 将(2)待人(1)，得
' （1） K 为常数，其值取决于荧光效率
I I 0 10 ECl
（2）
F K ' I 0 (1 10 ECl ) K ' I 0 (1 e 2.3ECl )
即
2.3ECl 2.3ECl2 2.3ECl3 F K I 0 1 1 1 ! 2 ! 3 ! 2 3 2 . 3 ECl 2 . 3 ECl ' K I 0 2.3ECl （3） 2 ! 3 !
2.了解荧光分光光度计与荧光分析技术新技术。
一 荧光强度与物质浓度的关系： 由于荧光物质是在吸收光能而被激发之后才发射荧光 的，因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的 程度以及荧光效率有关。 溶液中荧光物质被入射光(I0)激发后，可以在溶液的各 个方向观察荧光强度(F)。但由于激发光的一部分被透过， 因此，在激发光的方向观察荧光是不适宜的。一般是在与 激发光源垂直的方向观测。 设溶液中荧光物质浓度为C，液层厚度为L。荧光强 度正比于被荧光物质吸收的光强度，即：
分子振动总能量 EV U T
当 r re U 0 ， EV T
U 位能 T 动能
当（r re）最大 T 0 ， EV U
A、B两原子距
平衡位置最远
量子力学证明：
1 分子振动总能量 EV （V ） h 2 分子振动频率
V 分子振动量子数 V 0 ， 1 ，2 ，3
第一节 荧光分析法的基本原理（2）
内转换 S2
S1 振动弛豫 内转换 系间跨越
能 量
吸 收
T1 T2 发 射 荧 光 外转换 发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l
l
l 2
l3
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(二) 有机化合物分子结构(molecular structure)与荧 光(fluorescence)的关系
1. 分子产生荧光必须具备的条件 （1）具有合适的结构：强的紫外-可见吸收；
二、定量分析方法
1 依据：荧光强度与荧光物质浓度的关系，在低浓度时二者成 线性关系：F=KC
2 荧光定量分析方法：
(1)校正曲线法：配制空白溶液以及一系列浓度梯度的待测物的 标准溶液，试样经过相同的处理之后分别测定荧光强度：F0、 Fs、Fx，然后作（ Fs - F0）— C 曲线，根据（Fx–F0)，从工 作曲线上求得待测物的浓度（或含量）。 (2) 比例法：如果荧光物质溶液的工作曲线通过原点，就可选 择其线性范围，用直接比较法进行测定： Fs-F0 = KCs ， Fx-F0 = KCx
二、红外吸收光谱产生的条件和吸收峰强度
三、吸收峰的位置 四、特征峰和相关峰
一、分子振动能级和振动形式 1．振动能级(vibrational level)：为了讨论方便，以双原子 分子(或基团)的纯振动光谱为例予以探索。
r 原子间实际距离 re 原子间平衡距离 K 化学键力常数（N / cm）
散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光更长的 拉曼光，因其波长与荧光波长接近，对荧光测定的干扰更大， 必须采取措施消除，一般选择适当的激发波长可消除拉曼光 的干扰。 5种常用溶剂在不同波长激发光照射下拉曼光的波长：
以硫酸奎宁为例：
第二节 荧光定量分析方法 要求：
1.掌握荧光强度与物质浓度的关系，定量分析方法；
概述(introduction)：
红外分光光度法：利用物质对红外光区0.76~500μm (1000μm) 电磁辐射的选择性吸收的特性来进行结构分析、定性和 定量的分析方法，又称红外吸收光谱法。
一、红外光的区划
红外线：波长在0.76~500μm (1000μm) 范围内的电磁波。 近红外区：0.76~2.5μm —OH和—NH倍频吸收区
2 仪器的校正：
(1)灵敏度的校正： (2)波长校正： (3)激发光谱和荧光光谱的 校正：
二 荧光分析新技术简介 1 激光荧光分析法
2 时间分辨荧光分析
3 同步荧光分析 4 胶束增敏荧光分析 作业：课本P229
第十二章 红外吸收光谱法
(Infrared absorption spec-troscopy，IR) 要求： 1.熟悉红外光的区划、吸收过程 、红外光谱的作 用、红外光谱的表示方法以及IR与UV的区别 ； 2.熟悉红外光谱的振动能级以及振动频率的估算。
b
L 红外光的照射频率 分子的振动频率
4 测定无机离子的荧光试剂：
三 影响荧光强度的外部因素：
1.溶剂的影响：一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强 而长移，荧光强度也增强。
2.温度的影响：荧光强度对温度变化很敏感，温度增加，外 转换去活的几率增加，使荧光效率和荧光强度降低。
3. 溶液pH：对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格 控制； 4. 荧光熄灭剂：又称荧光猝灭，是指荧光物质分子与溶剂分 子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。 引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂(quenching medium)。 如果荧光熄灭强度与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系， 可以利用这一性质测定荧光熄灭剂的含量。
简谐振动位能 U
当r re
把A、B两个不同质量的原子近似地看作 两个小球，把连接两者的化学键看成质量 可以忽略不计的弹簧，则两个原子间的 伸缩振动可近似地看成沿键轴方向的简谐 振动，双原子分子可近似地看作为谐振子
1 K (r re ) 2 2
U 0 U 0
当r re 或r re
5. 散射光(scattering light)：当一束平行单色光照射在液体样 品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于光子和物质分 子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射， 这种光称为散射光。有两种情况：
瑞利光(Reyleigh scattering light)：光子和物质分子发生 弹性碰撞时，不发生能量的交换，仅使光子的运动方向发 生改变，这种散射光称为瑞利光（非拉曼光）。 拉曼光(Raman scattering light)：光子和物质分子发生非 弹性碰撞时，在光子运动方向发生改变的同时，光子与物 质分子发生能量的交换，光子把部分能量转移给物质分子 或从物质分子获得部分能量，而发射出比入射光稍长或稍 短的光，这种散射光称为拉曼光。
（2）具有一定的荧光效率。
2. 有机化合物的结构与荧光
(1）跃迁类型： → *跃迁的荧光效率高，系间跨越过程的 速率常数小，有利于荧光的产生；
(2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移
(3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。 (4）取代基效应：芳环 上有供电基团，使荧光 增强。 综上所述：具有π →π *跃迁， 长的共轭结构，刚性平面以 及具有供电子基团的一类化 合物，有利于荧光的产生。
4．定量分析
四、红外光谱的表示方法
T~λ曲线 →前密后疏
T-
曲线

4 10 (cm 1 ) l ( m)
T~
苯酚的红外光栅光谱 T-
曲线 →前疏后密


曲线

五、IR与UV的区别 IR UV
起源
分子振动能级伴随 转动能级跃迁
所有的有机化合物 及某些无机化合物 特征性强 鉴定化合物类别 鉴定官能团 推测结构
分子外层价电子能级跃迁
适用
具n-π*跃迁有机化合物 具π-π*跃迁有机化合物 简单、特征性不强 定量 推测有机化合物共轭骨架
特征性 用途
第一节 红外分光光度法基本原理 principle of IR
红外光谱——由吸收峰位置和吸收峰强度共同描述
红外分光光度法——研究物质结构与红外光谱之间关系
一、分子振动能级和振动形式
1g谷物配成50ml溶液，取25ml测定，故谷物中核黄素为：
0.2849
50 0.5698 (g / g ) 25
第三节 荧光分光光度计和荧光分析新技术
一 荧光分光光度计(fluorospectrophotometer): 1 主要部件：主要由四个部分组成即激发光源、样品池、 双单色器系统、检测器。 特点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角
(三) 荧光试剂：为了提高测定的灵敏度和选择性， 常使弱荧光物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧 光性产物，扩大荧光分析法的应用范围。常用的荧 光试剂有： 1 荧光胺(fluorescamine)：能与脂肪族和芳香族伯胺 形成高度荧光衍生物； 2 邻苯二甲醛(OPA)： 3 1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯）：
'
若浓度C很小，ECl之值也很小，当ECl≤0.05时，上 式第二项以后的各项可以忽略。所以
F 2.3K ' I 0 ECl KC
（4）
根据 F 2.3K ' I 0 ECl KC ，在低浓度时，溶液的荧 光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系；但当 ECl>0.05时，(3)式括号中第二项以后的数值就不能忽略， 此时荧光强度与溶液浓度之间不呈线性关系。