细胞内细胞因子的检测

细胞内细胞因子的检测

细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如Th1(IL-2，IFN-γ)与Th2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难推广，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还不清楚。

活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞因子分泌至细胞外，方法为破坏高尔基体，因细胞因子（即各种蛋白）在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。

胞内细胞因子染色与传统的检测可溶性蛋白的方法如ELISA相比，具有显著优越性。该法从单个细胞水平检测内多个细胞因子的同时，还可标记各种细胞表面分化抗原以及活化分子、趋化因子受体和黏附分子等，从而区分表达特定细胞因子的细胞亚群及其表型特征。使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。早在1986年，Mosmann等应用Th细胞克隆技术和细胞因子产生的不同，发现小鼠CD4细胞是一个不均一的亚群，可分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。后来在人类的CD4细胞群中也发现了Th1和Th2细胞亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应，在抗胞内病原菌感染中发挥重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能是刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫有关。应用该方法，在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被

逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。

本章中，我们以人外周血Th1/Th2细胞因子（IFN-γ/IL-2）的检测为例，介绍细胞内细胞因子染色的一般方法。

1试剂与仪器

1.1 主要试剂：NaN3购自广州化学试剂厂；吐温-20为Invitrogen公司产品；Saponin购自Sigma公司；4% Paraformaldehyde自行配制；BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Kit（包括Fixation and Permeabilization Solution，Cat.No. 554722；Perm/wash Buffer（10×），Cat.No. 554723；BD Golgiplug protein transport inhibit containing brefeldin A）；FACS溶血素（BDIS Catalog No.349202）。

1.2 主要耗材及仪器：37℃、5%CO2孵箱（Biotech）；FACS流式细胞仪（BD FACS ARIA2）。

1.3 溶液配制：

1.3.1 磷酸盐缓冲液(PBS)配制：准确称量NaCl 8.0g ，Na2HPO4 1.16g，KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，加入到超纯水900mL中，充分混匀，定容至1000mL，调PH 值至7.2-7.4。高压灭菌20分钟，冷却后保存。

1.3.2 流式细胞术缓冲液配制

缓冲液Ⅰ：PBS（PH：7.2-7.4）1000 mL。分装为500 mL/瓶，4℃保存。

缓冲液Ⅱ：PBS（PH：7.2-7.4），加入1% BSA，0.05% NaN3，完全溶解后，分装500 mL/瓶，4℃保存。

缓冲液Ⅲ：PBS（PH：7.2-7.4），加入1% BSA，0.05% NaN3，1% Saponin，完全溶解后，分装500 mL/瓶，4℃保存。

1.3.3 固定液（4%多聚甲醛）：准确称量多聚甲醛40 g，加入PBS 1000 mL，加热至完全溶解，冷却后调PH为7.2-7.4，分装50 mL/管离心管内-20℃保存。1.3.4 试剂的选择、制备、储存：

1)Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)(Sigma Catalog No.P-8139)

a.于DMSO中调节浓度0.1mg/mL

b.分装，－20℃储存，勿反复冻融

c.PMA终浓度20ng/mL细胞悬液。

2)Ionomycin (sigma Catalog No.I-0634)

a. 于乙醇中配制成浓度1mg/mL

b. －20℃储存

c. Ionomycin终浓度1μg/mL细胞悬液

3）布雷菲德菌素A，Brefeldin-A(BFA) (sigma Catalog No.B-7651) 或BD Golgiplug TM（containing brefeldin A, Cat.No.: 555029）

a. 于DMSO中调节浓度10mg/mL

b. 分装，-20℃储存，勿反复冻融

c. 激活最后4－5小时BFA终浓度10mg/mL

d. 检测TNF-α时必须使用BFA来进行阻断

e. BFA抑制CD69在细胞表面的表达，却不会影响它在胞内的表达

f. BFA过度孵育会导致细胞活力下降（不超过12小时）

2 方法

操作流程

制备细胞

刺激细胞，37℃培养

表面分子的染色

固定、破膜*

胞内因子染色

重悬细胞，上机检测分析

注释：*该步骤有两种方法可供选择：1、加入4%多聚甲醛室温固定8分钟后，PBS洗涤细胞两次，加入100μL/管含0.1% saponin的PBS（BufferⅢ）4℃破膜