细胞内细胞因子的检测
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展【摘要】：细胞因子具有调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等多种生物学功能。
因此，细胞因子的研究成果为临床上预防、诊断、治疗疾病提供了科学基础，特别是利用细胞因子治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫性疾病等，具有非常广阔的应用前景[1]。
随着细胞表面标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
流式细胞术也成为了检测单细胞水平细胞因子表达能力的重要检测方法。
本文针对流式细胞术在胞内细胞因子检测中的研究进展作一综述。
【关键词】：流式细胞术；细胞内；细胞因子；检测技术引言：细胞因子(cytokine，CK)是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，能介导细胞之间的相互作用，并在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中起到重要作用。
细胞因子的检测方法一般分为生物学测定法、分子生物学测定法及免疫学测定法。
而目前用于检测单个细胞特定细胞因子表达的手段则包括：多参数流式细胞术，酶联免疫斑点法ELISPOT[2]、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR等生物分析技术。
相较于其它的检测方法，流式细胞术在细胞内细胞因子的检测上具有高效、简便、适应性广等优势。
一、流式细胞术的概述流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定量分析技术之一。
FCM能够快速分析单个细胞或粒子的多种特性，既可以定性，也可以定量，尤其适用于大量样品检测，已在临床检验工作中得到广泛应用。
流式细胞仪（fluorescenceactivated cell sorter，FACS）的检测分析已涉及到细胞生物学、免疫学、肿瘤学、遗传学、血液学、微生物学等学科。
细胞因子7项检测的说明
细胞因子7项检测的说明1. 什么是细胞因子检测？好啦，今天咱们来聊聊一个听起来挺高大上的话题——细胞因子检测。
别担心，不用背什么复杂的术语，咱们就像在茶馆聊天一样，轻松愉快。
细胞因子，简单来说就是咱们身体里的一些小信使，它们帮助调节免疫系统，像个小精灵一样，在体内穿梭，传递信息。
细胞因子检测就像是给这些小精灵做个体检，看看它们的状态如何，能不能把咱们的免疫系统调得更加给力。
1.1 检测的意义说到检测的意义，简直就是一部大片啊！想象一下，你在打游戏，突然屏幕上出现了一个小提示：“你的角色状态不佳，快去补给！”这就是细胞因子检测的作用。
通过检测，我们可以了解到身体的免疫反应是否正常，是否存在潜在的疾病，甚至可以提前预判一些问题，像个神预言家一样，给咱们的健康把把关。
1.2 细胞因子的种类细胞因子可多了，七项检测听上去就像一场音乐会，里面有主唱、吉他手、鼓手等等。
它们分别是：肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL1、IL2、IL6、IL10），还有干扰素（IFN）。
每一项都有自己的特点，像不同乐器演奏出的旋律，合在一起才能奏响健康的交响曲。
2. 检测的过程说到检测，很多人会担心，啊呀，要抽血吗？对的，没错，细胞因子检测确实是需要抽血的，听起来有点紧张，但实际上，抽血就像是捡个小便宜，可能有点疼，但为了健康，值得啊。
首先，你得去医院或者诊所，前台的小姑娘会给你登记，像是在填一份VIP通行证，接着就是护士小姐姐出场，温柔地告诉你，稍微捏一下拳头，深呼吸，不用太紧张哦。
然后就抽一管血，咕咚一下，搞定！2.1 检测结果解读等着结果的时候，就像等快递，心里七上八下的。
结果出来后，你可能会看到一些数据，别慌，这些数字就像考试卷上的分数，医生会根据你的情况来给你解读。
比如说，如果某项细胞因子的水平偏高，那可能说明你的身体在和某种疾病作斗争，或者免疫系统在“开会”呢。
如果一切正常，那就恭喜你，继续保持健康的生活方式，咱们要做个“健康达人”！2.2 注意事项不过，做检测也有一些小窍门，首先，最好提前预约，不然一到医院就像去赶集，热闹得很。
10种常用细胞因子检测方法盘点
10种常用细胞因子检测方法盘点细胞因子是一类在细胞间相互作用中发挥重要作用的蛋白质，对免疫调节、炎症反应、细胞增殖和分化等过程起着关键的调控作用。
因此，检测细胞因子的水平对于研究疾病发病机制、诊断和治疗具有重要意义。
以下是常用的10种细胞因子检测方法盘点：1. 酶联免疫吸附法（ELISA），ELISA是一种常用的细胞因子检测方法，通过将待检测的细胞因子与特异性抗体结合，然后用酶标记的二抗结合，最后通过底物染色来检测细胞因子的含量。
2. 免疫荧光法（IF），IF方法利用激光共聚焦显微镜观察标记的抗体与细胞因子结合的情况，适用于定量和定位分析。
3. 流式细胞术（FCM），FCM结合荧光标记的抗体，可以对多种细胞因子进行快速、高通量的检测和分析。
4. 生物传感器技术，生物传感器技术结合了生物学和传感器学的优势，可以实现对细胞因子的高灵敏度、高选择性检测。
5. 蛋白质芯片技术，蛋白质芯片技术可以同时检测多种细胞因子的含量，具有高通量、高灵敏度的特点。
6. 质谱法，质谱法可以通过检测细胞因子的质荷比来定量和鉴定细胞因子。
7. 生物学功能法，生物学功能法通过观察细胞因子对细胞生物学功能的影响来间接检测细胞因子的活性。
8. 核酸杂交技术，核酸杂交技术可以通过检测细胞因子的mRNA水平来间接反映细胞因子的表达水平。
9. 免疫印迹法（Western blot），Western blot可以用于检测细胞因子的蛋白质水平，结合特异性抗体可以实现对细胞因子的定量分析。
10. 细胞因子生物学活性检测，通过细胞因子对细胞增殖、分化、凋亡等生物学活性的影响来检测细胞因子的活性水平。
以上是常用的10种细胞因子检测方法，它们各自具有特定的优势和局限性，在实际应用中可以根据需要选择合适的方法进行检测分析。
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测一、简介随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。
在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。
目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。
随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。
早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。
尽管研究应用T 淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－ )与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。
近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin 阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。
在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。
这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。
在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。
且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。
流式胞内细胞因子检测
流式胞内细胞因子检测流式胞内细胞因子检测是一种用于研究细胞因子在单个细胞水平上的表达和分泌的技术。
细胞因子是一类产生于免疫细胞和其他细胞类型中的小分子蛋白质，对于细胞的发育、增殖、分化和功能调节具有重要作用。
流式胞内细胞因子检测可以帮助科研人员了解细胞因子的表达模式、功能和调控机制，从而深入研究细胞免疫学、炎症反应、感染和免疫相关疾病等领域。
流式胞内细胞因子检测的原理是利用单克隆抗体与特定细胞因子结合，然后使用荧光标记的二抗检测这种结合。
首先，需要选取合适的抗体对细胞因子进行检测。
抗体通常选择单克隆抗体，因为其高度特异性和亲和性。
对于胞内细胞因子的检测，首先需要破坏细胞膜，使细胞内的细胞因子释放到胞外液中。
一般来说，可以通过细胞固定和渗透化处理来实现这一步骤。
接着，使用标记有荧光染料的二抗与细胞因子结合，产生荧光信号。
最后，使用流式细胞仪对细胞进行分析，并得到细胞因子的表达和分泌水平。
流式胞内细胞因子检测的优势之一是可以在单个细胞水平上进行分析。
通过研究单个细胞的细胞因子表达水平，可以得到更准确、具体的结果，避免了整体细胞群体的平均值的混淆。
此外，流式胞内细胞因子检测还可以同时分析多种不同细胞因子的表达和分泌水平，可以全面了解细胞因子的调控网络。
另外，流式胞内细胞因子检测还具有高灵敏度和高速度的特点，可以快速得到结果，并且对于微量样品的检测也有很好的表现。
流式胞内细胞因子检测在多个研究领域发挥了重要作用。
在免疫学领域，可以通过检测不同类型免疫细胞中细胞因子的表达水平，了解它们在免疫应答中的作用和调控机制。
在炎症反应研究中，可以检测炎症细胞中细胞因子的表达水平，从而了解炎症反应的机制，并寻找调控炎症的目标。
此外，流式胞内细胞因子检测还可以应用于感染和免疫相关疾病的研究，帮助科研人员了解疾病的发病机制和炎症信号通路。
然而，流式胞内细胞因子检测也存在一些局限性和挑战。
首先，流式胞内细胞因子检测需要选择合适的抗体对特定细胞因子进行检测。
流式细胞术检测胞内细胞因子的经验分析
流式细胞术检测胞内细胞因子的经验分析颜彩玲;张慧;周瑞祥【摘要】目的探讨流式细胞术检测胞内细胞因子的注意事项.方法制备小鼠脾脏淋巴细胞悬液.采用细胞表面抗原CD4、CD25及细胞核内因子FOXP3染色检测调节T细胞,胞内因子TNF-α的检测采用PMA/Iono-mycin,anti-CD3/CD28,PMA/Ionomycin与anti-CD3/CD28联合3种方案进行刺激,比较不同刺激条件下TNF-α胞内因子的表达情况,培养后各组细胞悬液采用固定破膜处理技术进行细胞表面抗原CD3、CD4及细胞内因子TNF-α染色.结果脾脏淋巴细胞悬液制备中研磨、裂解红细胞及染色过程中破膜等操作的不当,均导致前向/侧向(FSC/SSC)点图中目的细胞群模糊不清,从而影响后续分析.新鲜脾脏淋巴细胞得率、CD3+T淋巴细胞得率及TNF-α表达率与冻存的脾脏各类细胞比较,差别无统计学意义(P>0.05).胞内因子TNF-α检测结果显示,刺激组PMA/Ionomycin以及anti-CD3/CD28表达率显著高于未刺激组(P<0.05),PMA/Ionomycin与anti-CD3/CD28联合刺激组的表达率也显著高于未刺激组和独立刺激组(P<0.05).结论流式细胞术胞内细胞因子的检测有很多影响因素,包括脾脏细胞悬液制备中的研磨、裂解红细胞操作,染色处理过程中的破膜、固定,上机检测过程中补偿的调节、对照的设置等均影响实验结果,检测前应注意摸索选择适合待测胞内因子的测定条件.%Objective To investigate factors that may affect the detection of intracellular cytokines with flow cytometry . Methods Splenocytes from mice were disaggregated , and regulatory T cells (Treg) were detected by staining of CD4 ,CD25 ,and intranuclear transcription factor FOXP3 . Forthe detection of TNF-α,splenocytes were stimulated withPMA/Ionomycin ,anti-CD3/CD28 or PMA/Ionomy-cin plus anti-CD3/CD28 ,respectively . Following activation ,the cells were stained with anti-CD3 APC and anti-CD4 FITC ,then intracellularly stained to detect TNF-α after fixation and permeabilization . Controls were designed for both experiments . Results The improper operations in the grinding ,lysing erythrocytes ,fixing and perming the cells all leaded to indistinct target cells of interest in the FSC /SSC dot plots ,which affected the subsequent analysis . There were no significant differences in the percentages of lymphocytes ,CD3+ T lymphocytes ,and TNF-α p roducing cells between the fresh and frozen samples (P>0 .05) . Expression of TNF-αin cells stimulated by PMA/Ionomycin ,anti-CD3/CD28 ,or combined stimulation groups were significantly higher than controls (P<0 .05) . Conclusion Many factors may af-fect the detection of intracellular cytokines by flow cytometry ,including the spleen ,lysing erythrocytes in the preparation of splenocytes suspension ,fixing and perming the cells duringdyeing ,adjusting the com-pensation values ,designing controlled trials and so on . Therefore ,attentions should be paid to explore and select the suitable conditions for studying intracellular factors before testing .【期刊名称】《福建医科大学学报》【年(卷),期】2017(051)005【总页数】8页(P303-310)【关键词】流式细胞术;细胞因子类;小鼠【作者】颜彩玲;张慧;周瑞祥【作者单位】福建医科大学基础医学院 ,福州 350122;福建医科大学新药安全性评价中心,福州 350122;福建医科大学基础医学院 ,福州 350122【正文语种】中文【中图分类】R332;R341.1;R392.21;R977.6辅助性T淋巴细胞(T helper, Th)是人体内免疫系统的重要组成部分。
细胞内细胞因子染色法07
Fluorescence detector ( FL1,FL2,FL3,FL4)
检测信号
双参数点图
标本制备
标本来源:外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300 目过滤) 制成单细胞悬液
标本浓度：106/ml-外周血白细胞计数，白血病人血标 本需PBS稀释
抗凝剂：EDTA、肝素-若抗凝不佳，有凝块，则不可检 测。
溶血剂：保持细胞形态、红细胞裂解完全。 反应温度：26~27ºC，室温避光。
结果示范
1.56
0.25
8.23
0.26
左图显示在抗原刺激前，CD4+和CD4-细胞中能产生IFN-γ的细胞占PBMC的 0.25%和1.56%
右图显示在抗原刺激后，CD4-细胞中能产生IFN-γ的增加到8.23%，提示该 抗原能促进CD4-细胞分泌IFN-γ
– 产生并收集光学信号
电子系统;
– 将光信号转换成电信号,使之数字化,输入计算机并分 析。
细胞分选系统。
FLOW CELL(流动室)
Injector Tip
鞘液
荧光信号 聚焦的激光光束
荧光 并激发后 会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定 的发射波长.
实验原理
细胞因子跨膜分泌阻滞剂BFA，使新产生 细胞因子滞留在细胞内；
破膜剂使荧光抗体可以进入细胞内，并 可以检测相应细胞因子；
流式细胞记数技术可以记数细胞，分析 相应细胞的质和量。
方法特点
1. 单细胞水平计数 2. 简单、快捷、灵敏 3. 实验结果客观
实验过程
取淋巴细胞，刺激剂作用，37℃孵育1小时 加入BFA继续培养5小时，用PBS洗涤。 4%多聚甲醛室温固定8分钟后，PBS洗涤。
细胞因子检测方法
细胞因子检测方法细胞因子是一类存在于细胞内的小分子蛋白质，它们在细胞间扮演着重要的信号传递和调节作用。
细胞因子的产生和释放常常与某些疾病的发生和发展密切相关。
因此，对细胞因子的检测成为了许多疾病的诊断和治疗的重要手段之一。
本文将介绍几种常用的细胞因子检测方法。
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的细胞因子检测方法。
该方法通过专门的ELISA 试剂盒，利用特异性的抗体对目标细胞因子进行检测。
ELISA方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点，可以用于检测多种细胞因子，如白细胞介素、肿瘤坏死因子等。
二、流式细胞术流式细胞术（Flow Cytometry）是一种通过检测细胞表面或细胞内标记物来分析和鉴定细胞的方法。
在细胞因子检测中，可以通过标记抗体来检测细胞表面的特定细胞因子。
流式细胞术具有高通量、高灵敏度、多参数等优点，可以同时检测多种细胞因子的表达水平，并对细胞因子的分布、数量等进行分析。
三、PCR方法聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种常用的分子生物学技术，可以通过扩增目标DNA片段来检测细胞因子的基因表达水平。
PCR方法可以通过设计特异性引物，扩增细胞因子基因的特定区域，并通过凝胶电泳等方法来检测扩增产物的存在与否。
PCR方法具有高灵敏度、高特异性等优点，可以用于定量和定性分析细胞因子的表达水平。
四、蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术（Protein Microarray）是一种高通量的蛋白质检测技术，可以同时检测多种细胞因子。
蛋白质芯片技术通过将不同的细胞因子蛋白固定在芯片上，然后与标记有荧光物质的样品中的细胞因子进行特异性结合，最后通过荧光扫描仪来检测荧光信号的强度，从而获得细胞因子的表达水平。
蛋白质芯片技术具有高通量、高灵敏度等优点，可以用于筛选和鉴定细胞因子。
细胞因子九项检测科普
细胞因子九项检测科普细胞因子九项检测是一种常规的免疫检测方法，可以评估人体细胞因子水平。
细胞因子是一类信号蛋白，能够刺激或抑制体内免疫反应，起着极其重要的作用。
而细胞因子水平的高低与很多疾病的发生和发展密切相关，包括肿瘤、炎症性疾病和自身免疫病等。
细胞因子九项包含的检测指标分别是干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）、白介素10（IL-10）、白介素12（IL-12）、干扰素α（IFN-α）和白介素4（IL-4）。
其中，前六项是评估炎症水平的重要指标，后三项则是评估免疫功能的关键指标。
这项检测通常采用外周血检测或分泌物检测方式进行。
外周血检测需要采集一定量的血液样本，经过离心等处理方法分离出白细胞，然后通过酶联免疫吸附试验（ELISA）等技术检测不同细胞因子的浓度。
而分泌物检测则需采集相应分泌物的样本，如唾液、泪液、脑脊液、尿液等，利用同样的检测方法进行分析。
临床上，细胞因子九项检测广泛应用于炎症性疾病、自身免疫疾病和肿瘤等的辅助诊断、预后评估及治疗监测。
例如，对于患有类风湿性关节炎的患者，检测IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的浓度可以帮助评估疾病活动度和治疗效果；对于肝硬化或乙型肝炎患者，测定IFN-γ和IL-10的水平可以判断病情的稳定或恶化；对于乳腺癌等恶性肿瘤患者，检测IL-12和IFN-α的含量可以评估治疗反应。
需要提醒的是，细胞因子九项检测并不是万能的，其结果必须与临床表现、检验和其他检查结果综合考虑。
同时，在进行检测前需要咨询医生，了解相关的注意事项和检测费用等信息。
综上，细胞因子九项检测是一项非常重要的免疫检测方法，可以对很多疾病的诊断、治疗和预后评估提供有益的帮助。
但同时，我们也需要认识到检测结果是辅助诊断、预测和治疗的重要参考，不能替代临床医生的判断和治疗方案。
流式胞内细胞因子检测
流式胞内细胞因子检测I.导言单细胞胞内细胞因子分析方法在持续不断改进中，分析技术包括ELISPOT，原位杂交(in situ hybridization)，免疫组织化学(immunohistochemistry)，有限稀释分析和单细胞PCR等。
相比较流式细胞术是一种强大的分析技术，可以同时分析单个细胞的多个参数，包括大小和粒度，以及由荧光抗体表征的表面和细胞内标记物的表达。
胞内细胞因子和趋化因子对应的荧光标记单克隆抗体应用已经非常成熟，也适用于混合细胞群内胞内染色和多色分析。
表面和胞内相结合的多色免疫荧光染色提供了一种高分辨率方法，用于鉴定表达特定细胞因子的细胞的性质和频率。
已经有非常多的应用案例如细胞因子表达受限制的（如，Th4与Th2样）或不受限制的（如，Th0）各种细胞类型的分析。
除了能够同时对单个细胞进行高特异性和高灵敏的多个参数同时测量外，该方法还能够快速收集大量细胞信息，进行统计学意义上的分析。
胞内细胞因子的染色取决于细胞因子特异性单克隆抗体的鉴定，及其与固定-透化过程的相容性。
已经报道了使用多聚甲醛固定和用去污剂皂苷对细胞膜透化的组合的最佳细胞内细胞因子染色。
多聚甲醛固定允许保持细胞形态和细胞内抗原性，同时还使细胞能够承受去污剂的透化作用。
皂苷的膜透化使细胞因子特异性单克隆抗体穿透内质网和高尔基体的细胞膜，胞质溶胶和膜。
细胞因子染色的关键参数包括：细胞类型和激活方案-活化后细胞收获的时间-细胞活化过程中包含蛋白质转运抑制剂-和抗细胞因子抗体的选择等。
II.一般方法A.刺激细胞已经报道了各种用于刺激细胞产生细胞因子的体外方法。
多克隆活化剂包括有：佛波酯和钙离子载体；植物血凝素;葡萄球菌肠毒素B；和针对TCR/CD3复合物亚基的单克隆抗体（有或没有针对共刺激受体如CD28的抗体）。
注意：据报道，单独使用PMA进行细胞活化会导致小鼠T细胞表面CD4表达的瞬时丧失；用PMA和钙离子载体一起活化细胞会引起CD4表达的更大和更持久的降低，以及小鼠胸腺细胞、小鼠和人外周T淋巴细胞中CD8表达的降低。
细胞因子检测试剂盒的原理与检测方法探析
细胞因子检测试剂盒的原理与检测方法探析细胞因子检测是一种常见的生物学研究方法，用于评估生物体内细胞因子的水平和活性。
细胞因子是一类由多种细胞合成的蛋白质或肽类分子，它们在机体的免疫反应、炎症反应、细胞增殖以及组织修复等过程中发挥重要的调节作用。
细胞因子检测试剂盒是一种常用于测量细胞因子浓度的试剂盒，其原理和检测方法对于细胞因子的研究和应用具有重要意义。
一、细胞因子检测方法的原理1.ELISA法ELISA法是一种常用的细胞因子检测方法，其原理是利用特定的抗体与待测细胞因子发生特异性结合，然后通过酶标记二抗与抗体复合物反应发生颜色反应，最后通过读取吸光度来间接测定细胞因子浓度。
ELISA法具有高灵敏度、高特异性和高重现性的优点，广泛应用于细胞因子的检测。
2.免疫荧光法免疫荧光法是一种直接观察和定量细胞因子的检测方法。
该方法利用细胞因子与特异性荧光染料或标记有荧光物质的抗体特异性结合，形成对应的荧光复合物。
通过荧光显微镜等设备观察并测定细胞因子的分布和定量情况。
免疫荧光法具有高灵敏度和高分辨率的优势，适用于细胞因子的多点和多通道检测。
3.流式细胞术流式细胞术是一种通过携带特异荧光标记的抗体与细胞因子结合，然后通过流式细胞仪对细胞群体进行快速检测的方法。
在流式细胞术中，细胞因子与特定抗体结合后，可以通过流式细胞仪进行单细胞的分析和定量，同时还可以与其他细胞参数进行联合检测。
流式细胞术具有高通量、高灵敏度和高精准度的优点，被广泛应用于细胞因子的研究。
二、细胞因子检测方法的操作步骤1.样品处理细胞因子检测试剂盒需要对待测样品进行前处理，通常包括样品收集、加入稳定液或溶液进行稀释、离心等步骤。
样品的前处理能够提高细胞因子的测定灵敏度和可信度。
2.试剂准备细胞因子检测试剂盒需要根据说明书准备试剂，包括稀释缓冲液、标准品、酶联免疫试剂等。
3.标准曲线制备标准曲线是细胞因子浓度与检测结果之间的关系。
根据试剂盒提供的标准品，将其按一定浓度系列进行稀释，并配制出一系列细胞因子浓度不同的标准品。
细胞内细胞因子的流式检测讲解
刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和
刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测 IFN-γ 则可选择 PMA 和Ionomycin 同时刺激；如果用 CD4 做表面标记，由于多数病人的
CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，
4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析。
当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。 ③同型对照 ：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的
免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表减少非特异性的背景染色，保证结
果的准确性
① Fc 受体阻断 ： 使用试剂阻断 Fc 受体可以有效减少非特异荧光染色，在
小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig 或血清。
② 表面结合的细胞因子的阻断 ：使用相同克隆的纯化的细胞因子抗体，
阻断细胞表面结合的细胞因子，阻断由于荧光抗体与表面细胞因子结合 引起的背景。
荧光素的选择： 检测相对低表达细胞因子如 IL-4时，应选用PE或APC
Monensin Brefeldin-A(BFA) 6、固定剂
固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在 细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。 一般使用含4%的多聚甲醛PBS溶液
7、破膜剂
将细胞膜穿孔，以利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与 相应的细胞因子结合。 一般使用含1％皂甙、0.05％NaN2的Hanks溶液/HBBS
标记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记
细胞内IL-1β的细胞内染色结果
未使用阻断剂
使用阻断剂
阴影部分代表的是同型对照染色结果； 黑色代表的是未使用破膜剂的染色 结果； 灰色代表的是使用破膜剂的染色结 果。
检测细胞因子的方法
检测细胞因子的方法
检测细胞因子的方法有多种，以下是常用的几种方法：
1. 酶联免疫吸附测定法（ELISA）：ELISA方法根据酶标记抗体与目标细胞因子的特异性结合来检测细胞因子的浓度。
这种方法广泛应用于研究和临床实验室中。
2. 流式细胞术（Flow cytometry）：流式细胞术可以通过标记抗体与细胞因子结合来分析和计数特定细胞子群。
这种方法可以定量分析细胞因子的分布和表达水平。
3. 实时荧光定量PCR法（Real-time PCR）：通过实时荧光定量PCR方法可以检测目标细胞因子mRNA的表达水平。
这种方法可以快速、准确地分析细胞因子的转录水平。
4. 细胞因子芯片（Cytokine array）：细胞因子芯片是一种高通量方法，可以在同一实验中同时检测多个细胞因子。
这种方法可以用来研究细胞因子的分泌模式和相互作用。
5. 免疫组织化学染色法（Immunohistochemistry）：免疫组织化学染色法可以在组织切片中检测细胞因子的表达情况。
这种方法可以定位细胞因子在组织中的分布和定量分析其表达水平。
细胞因子的检测技术原理
细胞因子的检测技术原理
细胞因子的检测技术原理包括以下几个方面：
1. 免疫测定法：利用抗体和抗原的专一性结合来检测细胞因子。
常用的方法有酶联免疫吸附测定法（ELISA）和流式细胞术。
ELISA通过将待检测的细胞因子与特异性抗体结合，然后加入酶标记的次抗体来进行检测。
流式细胞术则通过细胞表面标记的抗体将细胞因子浓度进行定量。
2. 核酸杂交和聚合酶链反应（PCR）：利用核酸杂交和PCR技术可以检测和定量特定的细胞因子mRNA。
核酸杂交通过将待检测的RNA与标记的互补DNA 探针结合来检测特定的mRNA序列。
PCR则通过扩增待测细胞因子的mRNA 序列来增加其浓度，然后通过电泳或其他方法定量测定。
3. 生物传感器：生物传感器是一种能够检测细胞因子的改变的装置，它可以通过与生物分子的特殊相互作用来转换信号，并将其传递到检测设备上。
常见的生物传感器包括表面等离子体共振传感器和电化学传感器。
4. 质谱法：质谱法是一种通过测定样品中细胞因子的质量和相对丰度来检测的方法。
常用的质谱方法包括质谱成像和串联质谱。
质谱成像利用质谱仪将待测样品分析成荷电粒子并进行质量测定。
串联质谱则通过将分析样品的质谱数据进行串联来确定细胞因子的结构和浓度。
10种常用细胞因子检测方法盘点
10种常用细胞因子检测方法盘点研究细胞因子为临床上疾病的预防、诊断、机理研究以及治疗等奠定了良好的基础，应用前景非常广泛。
目前检测细胞因子的方法有很多，根据检测原理和手段的不同，检测技术大致可分为四类：免疫学方法、生物学方法、分子生物学方法及质谱法。
细胞因子是由免疫细胞（如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）和某些非免疫细胞（内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等）经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。
细胞因子一般通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，调控免疫应答。
这些细胞因子的种类很多，包括肿瘤坏死因子—α(TNF-α)、白介素—1β(IL-1β)、白介素—6(IL-6)、转化生长因子—β(TGF-β)等。
细胞因子(cytokine，CK)是主要由机体中固有免疫细胞和适应性免疫细胞合成、分泌的一类具有多种活性功能的小分子多肽或糖蛋白。
细胞因子能介导细胞间的相互作用，具有多种生物学功能，如调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等。
研究细胞因子为临床上疾病的预防、诊断、机理研究以及治疗等奠定了良好的基础，应用前景非常广泛。
目前检测细胞因子的方法有很多，根据检测原理和手段的不同，检测技术大致可分为四类：免疫学方法、生物学方法、分子生物学方法及质谱法。
本篇我们就和大家一起来汇总一下10种方法的技术原理及方法特点：1、7种基于免疫学的常用的细胞因子检测方法Western Blot法、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、酶联免疫斑点技术（ELISpot）、超敏电化学发光技术（MSD）、Luminex液相芯片检测技、Olink技术、Simoa技术（Simoa）7种常用的细胞因子检测方法差异对比2、2种基于生物学的检测方法反转录·聚合酶链反应（RT-PCR）Cytometric Bead Array（CBA）系统3、质谱法4、12项细胞因子检测的临床意义一、基于免疫学的检测方法炎症因子作为一种蛋白质抗原，可以特异性与其单克隆抗体结合，利用抗原抗体反应检测细胞因子，近年来发展比较快，其方法包括Western Blot法、酶联免疫吸附测定法、酶联免疫斑点技术、超敏电化学发光技术、Luminex液相芯片检测技术、Olink技术、Simoa技术。
检测细胞因子的方法
检测细胞因子的方法
检测细胞因子的方法有很多种。
下面是一些常用的方法：
1. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：ELISA是一种常用的检测细胞因子的方法。
它通过将特异性抗体固定在试验板上，然后将待测样品加入到板上，利用特异抗体与待测细胞因子结合，再加入特异性检测抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，最后添加底物，测定光密度来确定细胞因子的浓度。
2. 流式细胞仪：流式细胞仪可以用来检测细胞因子在单个细胞水平上的表达情况。
它通过标记特定的细胞因子抗体或标记分子，在细胞水槽中运行待测细胞悬液，然后通过激光束照射细胞，测量细胞因子的荧光强度来确定其表达水平。
3. 实时荧光定量PCR（qPCR）：qPCR可以用来测定细胞因子的mRNA水平。
它通过与待测细胞因子的mRNA序列特异性杂交，然后使用荧光探针或染料来检测PCR扩增产物的累积量，进而确定细胞因子的mRNA水平。
4. 蛋白质芯片：蛋白质芯片是一种高通量检测细胞因子的方法。
通过将已知细胞因子的抗体固定在芯片上的不同点位上，然后将待测细胞因子加入到芯片上进行反应，最后使用荧光标记的二抗来检测反应产物，从而确定细胞因子的浓度。
5. 化学发光：化学发光法可以用于检测细胞因子的浓度。
它通过在反应体系中加入底物，在酶催化下发生发光反应，发光强度与细胞因子的浓度成正比。
需要根据实验要求和资源条件选择合适的方法进行细胞因子的检测。
细胞因子12项检测解读
细胞因子12项检测解读细胞因子，又称生物因子、活性物质，是一种分子结构占有重要位置的分子，可以对许多物质发挥调控作用，其中最重要的细胞因子是细胞因子12项检测，以下详细解读细胞因子12项检测。
细胞因子12项检测是一种常见的诊断检测，它由12个不同的项目组成，包括：白介素-2（IL-2）、白介素-6（IL-6）、白介素-7（IL-7）、单核细胞介素-1α（IFN-α）、单核细胞介素-β（IFN-β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、肿瘤坏死因子-β（TNF-β）、转化生长因子-β（TGF-β）、髓系调节素（GM-CSF）、炎症因子（IP-10）、造血因子（EPO）和血栓因子（PAI-1）。
这12种细胞因子都与身体某些重要系统有关联，如免疫系统、血液凝固系统和内分泌系统，其检测结果也对未来的诊断和治疗有着重要的意义。
IL-2是一种由T细胞产生的能够促进免疫系统反应的因子，而IL-6则是一种可以抑制T细胞的因子。
IL-7能够促进T细胞的生长和发育，并且可以调节白细胞的活性，帮助防御病毒感染。
IFN-α和IFN-β具有一定的抗病毒作用，并可以激活免疫系统以抵抗病毒侵袭。
TNF-α和TNF-β可以诱导细胞凋亡，促进炎症反应，这对抵抗病毒感染有重要的作用。
TGF-β能够调节免疫反应，有助于抗炎和抗病毒；GM-CSF能够刺激多种淋巴细胞的增殖，有助于免疫细胞抵抗病原体；IP-10可以调节细胞激活，可以诱导细胞对病原体的免疫反应；EPO在机体内，它扮演着调节血红蛋白生成和血小板生成重要作用；PAI-1有助于调节血液粘稠度，可以帮助防止出血和血栓形成。
以上便是12项检测中细胞因子12种各自的特性和作用。
此外，细胞因子12项检测不仅能够提供细胞因子的数值，还可以对细胞因子的互相关系进行分析，从而更好地了解细胞因子对身体健康的影响。
而至于检测的方法，则依赖于临床医师的诊断，检测方法可以是血液鉴定、免疫组织化学分析，或者是其他类型的实验室检测。
细胞因子检测的原理、特点及检测方法-临时分类-
第一节 细胞因子检测概述
一、细胞因子的类型与作用特点 二、细胞因子检测的特点与方法
细胞因子
由非神经—内分泌细胞产 生的一大类与免疫应答活动 密切相关的低分子蛋白与多 肽。
细胞因子的类型与作用特点
1、细胞因子的分类 2、细胞因子的作用特点
以生物学作用进行划分的分类
白细胞介素（Interleukin）—— IL-1、IL-2、…… IL-18 干扰素（Interferon）—— IFN- 、IFN- 、IFN肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor）—— TNF- 、 TNF集落刺激因子（Colony-stimulating factor）—— M-CSF、G-C 转化生长因子（Transforming growth factor）—— TGF趋化因子（Chemokine）—— IL-8、GROs、MCP-1 生长因子（Growth factor）—— EGF、FGF、IGF、PDGF
弃取上清，加入VSV 37ºC，24-48小时
观察细胞病变（镜检或比色）
待检样品（细胞上清） 指示细胞（L929） 按不同稀 释度加入
37ºC，肿24小瘤时坏死因子的测定
弃取上清，洗涤
加入结晶紫染液，洗涤
加入细胞裂解液，比色
第四节 细胞因子受体的检测
一、细胞因子受体的类型 二、细胞因子受体的检测
细胞因子检测的方法
免疫学检测方法——抗原性检测 细胞生物学检测方法——生物活性检测 分子生物学检测方法——基因表达检测
第二节 细胞因子检测的方法与原理
一、细胞因子的细胞生物学检测 二、细胞因子的免疫学检测 三、细胞因子的分子生物学检测
细胞因子的细胞生物学检测
1、检测方法与原理 2、检测中的操作注意要点
细胞因子检测
细胞因子检测细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质分泌的蛋白质,在体内广泛参与免疫调节及炎症反应、组织修复、刺激造血系统、刺激细胞的增殖与凋亡等重要生理活动,•在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中均起重要作用。
某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达,或表达减少,从而参与疾病的发病及病理过程。
1、免疫学检测法其基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。
•如免疫斑点法、ELISA法、RIA法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。
2.、生物学测定法其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株(即靶细胞)•的促增殖作用,以增殖细胞中的DNA的合成或酶活性为指标,间接推算出细胞因子的活性单位,如对IL-1、IL-2等细胞因子活性的检测。
亦可根据某些细胞因子对特定靶细胞的杀伤效应或对病毒的抑制作用进行测定,如对肿瘤坏死因子及干扰素的生物活性测定。
3、分子生物学测定法目前采用的技术有各种印迹法、斑点杂交、原位杂交和PCR 等。
通过检测细胞内细胞因子的基因组成或mRNA量,推算出细胞因子的合成量。
一、IL-1的检测(生物活性测定)产生IL-1的细胞种类很多,其中最主要的为单核-巨噬细胞。
IL-1可分为IL-1α(•也称酸性IL-1,pI=5.0)和IL-1β(中性IL-1,pI=7.0)。
两者的分子量和生物活性相似,•只能用抗体检测方法才能区别,常用的生物学测定法对两者都适用。
IL-1•的生物学活性广泛,其检测方法亦较多,包括有小鼠胸腺细胞增殖法、D10G4.1细胞增殖法及L929细胞增殖法等。
IL-1反应细胞增殖可以通过活性染料染色,显微镜直接计数,3H-TdR或125I-UdR的DNA掺入量或以活性细胞代谢率为指标来表示。
本试验介绍L929细胞增殖MTT比色法。
（一）IL-1的诱生体外试验可用LPS等有丝分裂原诱导单核-巨噬细胞产生IL-1,或用P388D1(鼠),THP-1(人)细胞株制备IL-1。
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细胞内细胞因子的检测细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。
研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。
早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。
尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如Th1(IL-2，IFN-γ)与Th2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难推广，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还不清楚。
活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞因子分泌至细胞外，方法为破坏高尔基体，因细胞因子（即各种蛋白）在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。
因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。
近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。
这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
胞内细胞因子染色与传统的检测可溶性蛋白的方法如ELISA相比，具有显著优越性。
该法从单个细胞水平检测内多个细胞因子的同时，还可标记各种细胞表面分化抗原以及活化分子、趋化因子受体和黏附分子等，从而区分表达特定细胞因子的细胞亚群及其表型特征。
使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。
早在1986年，Mosmann等应用Th细胞克隆技术和细胞因子产生的不同，发现小鼠CD4细胞是一个不均一的亚群，可分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
后来在人类的CD4细胞群中也发现了Th1和Th2细胞亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应，在抗胞内病原菌感染中发挥重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能是刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫有关。
应用该方法，在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。
且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。
本章中，我们以人外周血Th1/Th2细胞因子（IFN-γ/IL-2）的检测为例，介绍细胞内细胞因子染色的一般方法。
1试剂与仪器1.1 主要试剂：NaN3购自广州化学试剂厂；吐温-20为Invitrogen公司产品；Saponin购自Sigma公司；4% Paraformaldehyde自行配制；BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Kit（包括Fixation and Permeabilization Solution，Cat.No. 554722；Perm/wash Buffer（10×），Cat.No. 554723；BD Golgiplug protein transport inhibit containing brefeldin A）；FACS溶血素（BDIS Catalog No.349202）。
1.2 主要耗材及仪器：37℃、5%CO2孵箱（Biotech）；FACS流式细胞仪（BD FACS ARIA2）。
1.3 溶液配制：1.3.1 磷酸盐缓冲液(PBS)配制：准确称量NaCl 8.0g ，Na2HPO4 1.16g，KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，加入到超纯水900mL中，充分混匀，定容至1000mL，调PH 值至7.2-7.4。
高压灭菌20分钟，冷却后保存。
1.3.2 流式细胞术缓冲液配制缓冲液Ⅰ：PBS（PH：7.2-7.4）1000 mL。
分装为500 mL/瓶，4℃保存。
缓冲液Ⅱ：PBS（PH：7.2-7.4），加入1% BSA，0.05% NaN3，完全溶解后，分装500 mL/瓶，4℃保存。
缓冲液Ⅲ：PBS（PH：7.2-7.4），加入1% BSA，0.05% NaN3，1% Saponin，完全溶解后，分装500 mL/瓶，4℃保存。
1.3.3 固定液（4%多聚甲醛）：准确称量多聚甲醛40 g，加入PBS 1000 mL，加热至完全溶解，冷却后调PH为7.2-7.4，分装50 mL/管离心管内-20℃保存。
1.3.4 试剂的选择、制备、储存：1)Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)(Sigma Catalog No.P-8139)a.于DMSO中调节浓度0.1mg/mLb.分装，－20℃储存，勿反复冻融c.PMA终浓度20ng/mL细胞悬液。
2)Ionomycin (sigma Catalog No.I-0634)a. 于乙醇中配制成浓度1mg/mLb. －20℃储存c. Ionomycin终浓度1μg/mL细胞悬液3）布雷菲德菌素A，Brefeldin-A(BFA) (sigma Catalog No.B-7651) 或BD Golgiplug TM（containing brefeldin A, Cat.No.: 555029）a. 于DMSO中调节浓度10mg/mLb. 分装，-20℃储存，勿反复冻融c. 激活最后4－5小时BFA终浓度10mg/mLd. 检测TNF-α时必须使用BFA来进行阻断e. BFA抑制CD69在细胞表面的表达，却不会影响它在胞内的表达f. BFA过度孵育会导致细胞活力下降（不超过12小时）2 方法操作流程制备细胞刺激细胞，37℃培养表面分子的染色固定、破膜*胞内因子染色重悬细胞，上机检测分析注释：*该步骤有两种方法可供选择：1、加入4%多聚甲醛室温固定8分钟后，PBS洗涤细胞两次，加入100μL/管含0.1% saponin的PBS（BufferⅢ）4℃破膜1小时或过夜，即固定、破膜分两步进行；2、使用商品化试剂如BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Kit，固定、破膜一步完成，即直接加入100μL/管固定破膜液（Fixation and Permeabilization Solution），置于4℃、20min，用Perm/wash Buffer（1×）洗涤两次即可。
2.1 细胞制备2.1.1全血培养使用肝素钠抗凝真空采血管(BD V ACUTAINER Catalog No.367673)，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。
如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
全血与等体积RPMI 1640混合，备用。
2.1.2 新鲜分离外周血单个核细胞（PBMCs）用Ficoll液分离PBMCs，调整细胞浓度2×106细胞/mL，重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640。
2.1.3 冻存PBMCs 将细胞置于37℃水浴中进行融解，直至剩下豌豆大小的冰片残留；将细胞转移至Falcon管中，将预热的培养液缓慢加入细胞中，室温（24℃）、1800rpm离心8min，弃去上清，并将细胞悬于培养液中，重复离心一次；培养液重悬细胞，台盼蓝计数液计数，调整细胞浓度，以2×106/mL的浓度放于T-25培养瓶中，37℃、5%CO2孵箱中过夜；第二天首先进行计数，观察细胞存活情况。
2.2 细胞刺激按实验要求加入刺激剂PMA（20ng/mL）和Ionomycin（1μg/mL），同时设阴性对照，混匀，37℃、5%CO2孵箱中培养1小时后，加入阻断剂BFA，继续培养3-5小时（如果使用多肽进行刺激，由于多肽不需要在内涵体进行加工，因此阻断剂可以在刺激同时加入）。
培养结束后，细胞可以在1-9℃冰箱中保存18小时。
2.3 新鲜分离或冻存PBMC的染色1)培养结束后，将Falcon管取出；2)4℃、1800rpm离心8min；（要点：每次离心后，要保证有肉眼可见细胞沉积。
如无法看到，再次离心，固定细胞后，细胞团块看起来比较松散，但还是可见）3)吸弃上清，加入BufferⅡ并混匀，4℃、1800rpm离心8min，重复两次；BufferⅡ重悬细胞，按实验所需将细胞分至流式管，100μL/管；4)加入相应表面染色抗体，混匀；5)4℃、避光孵育20min；6)加入BufferⅠ并混匀，4℃、1800rpm离心8min，重复两次；7)吸弃上清，每管中加入500μL 4%多聚甲醛，混匀；8)室温避光孵育8分钟；9)加入BufferⅠ并混匀，4℃、2100rpm离心8min，重复两次；10)吸弃上清，每管中加入100μL Buffer Ⅲ，4℃、至少1小时至过夜；11)每管中加入胞内染色抗体，混匀；12)4℃、避光孵育20分钟；13)每管中加入1mL Buffer Ⅲ、4℃、2100rpm离心8min，重复两次；14)吸弃上清，将细胞重悬于250μL1%多聚甲醛，将流式管用锡箔避光保存于4℃直至上机；15)48小时内检测样本管；16)使用FlowJo分析样本数据；注意：步骤7）-10）可以代替为：加入100 μL Fixation and Permeabilization Solution，4℃、避光20min，加入1mL Perm/wash Buffer（1×）洗涤两次2.4 全血培养细胞的染色1)加表面染色试剂（CD3 FITC,CD8 PE-Cy7各10ul）于200μL激活的全血中，混匀，4℃、暗处孵育20分钟2)加2mL 1×FACS 溶血素，室温、暗处孵育10分钟。
3)离心1800rpm，8min，弃上清，4)加100μL 破膜剂（Fixation and Permeabilization Solution）4℃、暗处孵育20分钟。
5)加1mL Perm/wash Buffer（1×），离心2100rpm，8min，弃上清，重复洗涤一次。
6)加入荧光标记的细胞因子抗体（APC-IL4, PE-IL-17A, FTIC-IFN-r），混匀，4℃、暗处孵育20min。
7)加1mL Perm/wash Buffer（1×），离心2100rpm，8min，弃上清，加入250μL1% PFA。
（注意：样本上机分析前可以在4℃避光放置24小时）2.5 染色条件1)CD3-FITC,IL-17A-PE,CD8-PE-Cy7,IL-4 APC2)IFN-r FITC,IL-17A-PE,CD8-PE-Cy7,IL-4 APC3）CD34杨昊臻配色方案CD8A PE-CY7CD4 PERCP-CY5.5IL-17A PECD3E FITCIFN-r FITC ?IL-4 APCCD34 PE。