22+透射电镜制样+
透射电镜样品制备方法
透射电镜样品制备方法由于电子束穿透能力限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。
常用的超薄切片厚度是50-70nm。
在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。
超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。
一．取材的基本要求组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部的各种酶作用，出现细胞自溶现象。
此外还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏，因此，为了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。
（1）动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（争取1分钟内）投入2.5%戊二醛固定液。
（2）所取组织的体积要小，一般不超过1mm*1mm*1mm。
也可将组织修成1mm*1mm*2mm大小长条形。
因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。
（3）机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。
（4）操作最好在低温（0℃~4℃）下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。
（5）取材部位要准确。
二．取材方法将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用新的、锋利的刀片将组织切下并修小，然后用牙签或者镊子将组织块移至盛有冷的固定液的1.5ml离心管中。
如果组织块带有较多的血液和组织液，应先用PBS洗几遍，然后切成小块固定。
1.动物及人体组织的取材（在冰浴上进行）动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1mm宽，2~3mm长的小块并从中选出受损伤较小的小条，再将其切成1mm3的小块，最后用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的1.5ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0~4℃）2-4小时或以上。
透射电镜制样步骤以及注意事项
杨克勤 2013‐4‐11 Nhomakorabea1）（2） （3）
注1： 鉴于目前实验室各研究方向，该流程仅适用于粉末样品； 注2：铜网有亮面和暗面，请记住样品是滴在暗面还是亮面上， 特别是对于使用 有碳膜的铜网的同学； 注3： 将制好的TEM样放入干燥箱过夜，或者在100 oC 以上的烘箱或者红外灯下 烘烤半个小时以上。
碳膜
常用铜网类别
方华膜 载网
注意事项
9 溶液浓度不要太大，一般溶液颜色略透明即可（部分黑色 物质，如石墨， 颜色可稍深）； 9 洗去样品中的表面活性剂，否则会因碳污染影响观察； 9 放入透射电镜前，铜网务必充分干燥，鉴于温州地区特别潮湿，建议做透射 电镜前铜网一直保存在干燥箱里； 9 选择合适的支持膜； 9 特殊分散剂请向实验人员说明； 9 谢绝磁性、挥发性样品做透射电镜。
透射点镜的生物样本的制样过程
透射电镜生物样品制作过程透射电镜生物样品制作过程大致经过取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤。
一. 取材取材时要注意的要点是：快、小、冷、净、准、避免机械损伤。
取材方法：将固定液滴在冰台上的卡片上，在麻醉后的动物身上快速用剪刀剪取一块组织，用预冷的过的缓冲液将剪下的组织洗净，迅速放到卡片上的固定液中，用刀片切去被镊子夹到和剪刀剪过的组织，后按实验的目的将组织切成0.5~1mm2的立方或横截面为1mm2的长方体。
用牙签将切好的组织块转移到装有固定液的小瓶中，贴好标签并置于4℃的冰箱中。
二．固定以下操作尽可能在4℃的环境下，使用的溶液也要保存在4℃的冰箱中。
1、戊二醛固定：用镊子轻轻的将组织块从固定液中取出，放在卡片上的固定液中，利用双面刀片把组织块切成小块状，放进盛有1~1.5ml的0.1%的戊二醛的固定液的细管中，将吸管放进真空箱中，将大气压抽到760托后取出，使组织块在戊二醛溶液中固定1小时。
2、漂洗：经戊二醛固定的组织块要用1~1.5ml的0.1%PBS缓冲溶液漂洗，漂洗的次数为5次，在漂洗到第四次时可以将组织留在PBS漂洗液中过夜，放入4℃的冰箱中。
第二天早晨再进行第五次漂洗。
3、四氧化锇固定：向漂洗过的组织中加入0.5ml的0.1%四氧化锇固定液，固定时间为2个小时。
由于四氧化锇具有毒性，因此操作在通风橱里进行。
4、漂洗四氧化锇：用0.1%PBS缓冲溶液漂洗剩余的四氧化锇，然后再漂洗两次，其时间间隔为10min。
三．脱水为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。
1、酒精脱水:用浓度梯度依次为30%、50%、70%、90%的酒精，依次浸泡组织，其浸泡的时间一般为10min。
当在70%梯度的酒精时，样品可以放置过夜。
2、丙酮脱水：用浓度梯度为90%、100%的丙酮浸泡组织，在纯丙酮中浸泡三次。
透射电镜样品制备
透射电镜试样制备一、实验内容及目的了解透射电镜对试样的要求，熟悉透射电镜试样的制备过程，制备一个合格的透射电镜试样。
二、薄膜样品的制备用于透射电镜下观察的试样厚度要求在50-200nm之间，试样的制备过程大致可以分为以下三个步骤：第一步从实物或大块样品上切割厚度为0.3-0.5mm厚的薄片。
电火花线切割法是目前用得最广泛的方法，它是用一根往返运动的金属丝作切割工具，以被切割的样品作阳极、金属丝作阴极，两极间保持一个微小的距离，利用其间的火花放电进行切割。
电火花切割可切下厚度小于0.5mm的薄片，切割时损伤层比较浅，可以通过后续的磨制或减薄过程去除。
电火花切割只能切割导电样品，对于陶瓷等不导电样品可用金刚石刃内圆切割机切片。
第二步样品薄片的预减薄。
预减薄的方法有两种，即机械法和化学法。
机械法是通过手工研磨来完成的，把切割好的薄片一面用粘接剂粘在样品座表面，然后在水砂纸磨盘上进行研磨减薄。
应注意把样品平放，不要用力太大，并使它充分冷却。
减薄到一定程度时，用溶剂把粘接剂溶化，使样品从样品座上脱落下来，然后用同样方法研磨另一个面直至样品被减薄至规定的厚度。
（如果材料较硬，可减薄至70μm左右；若材料较软，则厚度不能小于100μm。
另一种预先减薄的方法是化学薄化法。
这种方法是把切割好的金属薄片放入配制好的化学试剂中，使它表面受腐蚀而急需减薄。
因为合金中各组成相的腐蚀倾向是不同的，所以在进行化学减薄时，应注意减薄液的选择。
化学减薄的速度很快，因此操作时必须动作迅速。
化学减薄的最大优点是表面没有机械硬化层，减薄后样品的厚度可以控制在20-50μm 。
经化学减薄的样品最终抛光穿孔后，可供观察的薄区面积较大。
但是化学减薄时必须事先把薄片表面充分清洗，否则将得不到满意的结果。
第三步最终减薄目前效率最高和操作最简便的方法是双喷电解抛光法，图为一台双喷式电解抛光装置的示意图。
将预先减薄的样品剪成直径为3mm的圆片,装入样品夹持器中。
透射电镜制样要求与制样方法
透射电镜制样要求与制样方法1. 样品一般应为厚度小于100nm的固体。
2. 样品在电镜电磁场作用下不会被吸出，附于极靴上。
3. 样品在高真空中能保持稳定。
4. 不含有水分或其它易挥发物，含有水分或其他易挥发物的试样应先烘干。
TEM样品常放置在直径为3mm的200目载网上纳米粉末样品的制备方法1、研磨法将（研磨后的）粉末放在去离子水或无水乙醇溶液里，用超声波分散器将需要观察的粉末分散成悬浮液。
用滴管滴几滴在覆盖有支持膜的电镜载网上，待其干燥(或用滤纸吸干)后, 即成为电镜观察用的粉末样品。
载网种类：方华支持膜：方华支持膜的化学成分是聚乙烯醇缩甲醛，由于是纯的有机膜，所以膜的弹性好，厚度通常为 10nm 左右，透射电镜观察时背底影响小。
但方华膜因导电性不好，在电子束照射下，易因高温或电荷积累，产生样品漂移甚至膜破损，通常在 100kV 电镜和生物样品中使用较多。
碳支持膜：是一种最常用的支持膜，有两层膜结构。
从下至上依次为裸网、方华膜和碳膜，由于碳层具有较强的导电性和导热性，弥补了无碳方华膜的荷电效应以及热效应，增强了膜整体的稳定性，适合大多数纳米材料和生物样品的一般形貌观察用于常规样品制样。
微栅：在膜上制作出微孔，以便使样品搭载在微孔边缘，使样品“无膜”观察，提高图象衬度。
观察管状、棒状、纳米团聚物效果好，特别是观察这些样品的高分辨像及mapping时更是最佳选择。
超薄碳膜：在微栅的基础上叠加了一层很薄的碳膜，一般为3-5纳米。
这层超薄碳膜的目的是用超薄碳膜把微孔堵住。
主要针对粒度较小的纳米材料。
如10纳米以下分散性很好的纳米材料，如果用微栅可能从微孔中漏出，如果在微栅孔边缘，由于膜厚可能会影响观察。
所以用超薄碳膜就会得到很好的效果。
纯碳膜：当样品所用的有机溶剂（氯仿、甲苯等）能够溶解方华膜时，载网膜中就要去除方华膜，只剩碳膜，称为纯碳膜，碳膜的厚度通常为 20nm 左右，在高分辨观察时背底的影响也比较明显。
透射电子显微镜样品制备
截面样品专用胶
G1 . G2 (Gatan公司)
M-Bond600/610
G1胶的优点：
1）固化快130°5-10分钟
2）保存时间长（室温一年）
3）高温稳定性好：300°工作十几个小时,400 °几小时
（可在TEM 加热台上升温）
三、薄膜样品——截面样品的制备
截面样品的制备
切好的截面样品重复平面样品的制备工艺,当
3. 凹坑
凹坑后的样品
4. 离子减薄
目的：TEM样品的最终减薄，以获得电子束透明的观察区
域。
特点：不受材料电性能的影响，即不管材料是否导电，金
属或非金属或者二者混合物，不管材料结构多复杂均可用
此方法制备薄膜。制样时惰性气体介质（氩气）对样品组
织结构无影响。
原理：在电场作用下氩气被电离成带Ar+的氩离子，带着一
大钉薄深度：1.1mm×tan4°=77（μm）。因此样品的钉
薄深度不能大于77微米，否则离子束打不到样品中心。
钉轮直径和钉薄深度的关系
不同的钉轮直径可获得的钉薄深度不同
10mm直径的钉轮，钉薄
的深度大于77μm一般不用。
15mm直径的轮子在实践
中效果不错。
钉薄前样品的最佳厚度
起始样品厚度应是钉薄深度
以及氧化膜复型。
一级塑料复型是对样品表面形貌的简单的复制，它表面的形貌
与样品的形貌刚好互补，所以称之为负复型。其厚度可以小到
100纳米。
碳膜一级复型是一种正复型，它与塑料一级复型的区
别是：
1.碳膜复型的厚度基本上相同，而塑料复型的厚度随试样位置
透射电镜生物样品制备步骤
透射电镜生物样品制备步骤
一．取材：
组织块小于1立方毫米
二．固定：
2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或更长时间。
用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分三次
1%锇酸固定液固定2-3小时
用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分三次
三．脱水：
50%乙醇15-20分
70%乙醇15-20分
90%乙醇15-20分
90%乙醇90%丙酮（1：1）15-20分
90%丙酮15-20分
以上在4度冰箱内进行
100%丙酮室温15-20分三次
四．包埋：
纯丙酮+包埋液（2：1）室温3-4小时
纯丙酮+包埋液（1：2）室温过夜
纯包埋液37度2-3小时
五．固化：
37度烘箱内过夜
45度烘箱内12小时
60度烘箱内48小时
六．超薄切片机切片70 nm
七．3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色
八．透射电镜JEOL JEM-1230（80KV）观察。
拍片。
透射电镜常规制样简易流程
透射电镜常规制样简易流程
1.取样
因戊二醛和锇酸的固定深度有限，样品越小越好，尽量取1mm*1mm*1mm。
2.先固定
戊二醛在3%-6%。
参考：25% 戊二醛（必须买Sigma公司的G5885或者更高浓度的戊二醛）和0.2M PBS 配置为戊二醛5%和0.1M PBS缓冲液的混合工作液；时间：常温4小时后，4度冰箱过夜。
3.清洗
PBS缓冲液冲洗。
一定要洗干净，否则戊二醛和锇酸会产生沉淀。
参考：每15-30分钟更换一次，共4次。
4.后固定
参考:锇酸2%，固定4小时。
剧毒，在通风橱操作。
5.清洗
PBS缓冲液冲洗。
6.梯度脱水
参考：乙醇梯度脱水:30-50-70-90-95-100-100%，每次10-15分钟，无水乙醇中加分子筛或者无水硫酸铜，提前一周配置好备用。
7. 渗透
参考：spurr树脂。
包埋板即可。
8. 包埋聚合
参考：70度，24小时。
10.超薄切片
11.染色
（1）醋酸双氧铀封口膜上染色，染色时间参考：10分钟（铀染）
（2）水清洗
（3）柠檬酸铅因其极易和空气产生铅沉淀，染色时旁边放NaOH颗粒，注意避光。
染色时间参考附件。
透射电镜样品制备-生物技术
半薄切片定位：
目的：定位、筛选、比较研究 （0.5～2.0μm）
半薄切片染色程序： 1．捞片 2．展片干燥 3．染色（甲苯胺蓝） 4．水洗、(透明、封固)
（2）超薄切片：
超薄切片机
厚度的辨认：
体视学显微镜下观察干涉色
暗灰色：＜400Å
灰 色：400～500Å
银 色：500～700Å
金 色：700～900Å
（2）锇酸（又称四氧化锇。OSO4, ）
1） 1%锇酸固定液的配制：（见书） 2）固定原理及优缺点
a、经典的固定剂。对蛋白质和脂质亲和力强。 b、有强烈的电子染色作用。 c、渗透较慢，0.25～0.5mm/h左右。常用作后固定。 d、对糖类和核酸保存很差，不保存酶活性。 e、固定时间不宜超过2小时。 f、提前配置，应低温、密封、避光保存。
② 包埋与固化： 组织块用牙签挑入包埋管中，注满包埋液，置温箱
中 固 化 。 37℃ 、 12 小 时 后 ， 移 入 45℃ ， 24 小 时 ， 60℃，24小时。
（4）包埋操作中的注意事项：
调整a液、b液的比例。
a. 器材和试剂均应注意防潮。（干燥器、烤箱） b. 配制包埋液时，防止气泡产生。
【2】常用固定剂的特点
（1）戊二醛（Glutraldehyde） 1）2.5%戊二醛固定液的配制（见书） 2）固定原理及优缺点
a、戊二醛对于蛋白质、多糖、核酸以及细胞内微管、滑面内质 网、纺缍丝、胞饮小泡和细胞基质固定良好。 b、穿透力强，可达4mm/h，常用作前固定。 c、固定后可在4℃冰箱长时间保存（数周～数月）。 d、对酶的活性保存较好，适用于电镜细胞化学研究。 e、对脂肪不起固定作用。 f、无“电子染色”作用。 g、不稳定、易氧化。
透射电镜样品制备方法
¾透射电子显微镜成像时，电子束是透过样品成像。
¾由于电子束的穿透能力比较低，用于透射电子显微镜分析的样品必须很薄。
¾根据样品的原子序数大小不同，一般在50～500nm之间。
透射电镜样品的要求：¾1. 样品必须对电子束透明。
¾2. 所制得样品必须具有代表性，以真实反映所分析材料的特征。
主要方法：粉末样品、复型、离子减薄、电解双喷。
¾透射电镜观察用的样品很薄，需放在专用的样品铜网上。
¾透射电子显微镜使用的铜网一般直径为3毫米，上面铳有许多微米大小的孔，在铜网上覆盖了一层很薄的火棉胶膜并在上面蒸镀了碳层以增加其膜的强度，被分析样品就承载在这种支撑膜上。
样品铜网的作用：¾承载样品，并使之在物镜极靴孔内平移、倾斜、旋转，寻找观察区。
¾样品通常放在外径3mm ，200目方孔或圆孔的铜网上，铜网牢固夹持在样品座中保持好的热、点接触，减少因电子照射引起的热或电荷积累而产生样品漂移或损伤。
样品台透射电子显微镜样品制备电镜观察时样品受到的影响：(1)真空的影响。
含有挥发溶剂或易升华的试样必须冷冻后观察。
(2)电子损伤的影响。
试样在电镜中受到l0－3～1A/cm2的电子束照射，电子束的能量部分转化为热，使试样内部结构或外形发生变化或污染。
观察有机物或聚合物试样时，为防止电子束对试样的损伤和污染，应提高电压。
(3)电子束透射能力的影响。
由于电子束透射能力较弱，一般100kv加速电压时，试样厚度必须在20～200nm之间。
粉末样品制备¾随着材料科学的发展，超细粉体及纳米材料发展很快，而粉末的颗粒尺寸大小、尺寸分布及形态对最终制成材料的性能有显著影响，因此，如何用透射电镜来观察超细粉末的尺寸和形态便成了电子显微分析的一的一项重要内容。
¾其关键工作是是粉末样品的制备，样品制备的关键是如何将超细粉的颗粒分散开来，使其均匀分散到支持膜上，各自独立而不团聚。
透射电镜常规样品制备流程(精)
透射电镜样品制备流程由于透射电镜能观察的样品必须很薄（60～70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一，仅有一下两种方法：一．负染色技术负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。
样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。
尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。
②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。
操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜观察。
二、超薄切片技术超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构最常用的技术。
广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。
一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。
超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。
但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。
具体操作步骤、注意事项如下：1．取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。
要求：①取材前一定要和工作人员取得电话联系！②取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。
③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。
场发射透射电镜(TEM)测试制样说明
场发射透射电镜（TEM)测试制样说明测试样品范围：各种材料内部微结构进行观察；粉末、纳米颗粒形貌和粒径观察选区电子衍射和晶体结构分析；金属、陶瓷、半导体、塑料、农作物、细胞等显微结构；配合EDS能谱仪可以对各种元素进行定性和半定量微区分析，元素检测范围：B～U元素。
透射电镜（TEM)测试制样要求：1. 透射电镜能够观察200nm以下的样品；2. 对于粉末和液体样品，要求样品均匀分散在支持膜上并且干燥；3. 块体样品，要求样品大小为直径3mm的圆，厚度为200nm以下；高分辨样品要求厚度在10nm以下；4. 含磁样品需要在委托测试单中重点标识，需要特殊处理，否则不予测试；5. 需要离子减薄的金属、陶瓷样品，需要已预减到150微米以下，否则不予制样和测试。
透射电镜生物样品制备步骤：1．取材：组织块小于1立方毫米2．固定：2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或更长时间。
用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分三次1%锇酸固定液固定2-3小时用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分三次3．脱水：50%乙醇15-20分70%乙醇15-20分90%乙醇15-20分90%乙醇90%丙酮（1：1）15-20分90%丙酮15-20分以上在4度冰箱内进行100%丙酮室温15-20分三次4．包埋：纯丙酮+包埋液（2：1）室温3-4小时纯丙酮+包埋液（1：2）室温过夜纯包埋液37度2-3小时5．固化：37度烘箱内过夜45度烘箱内12小时60度烘箱内24小时6．超薄切片机切片70 nm7．醋酸铀-柠檬酸铅双染色负染色的操作方法用一根细滴吸管吸一滴样品悬液滴在有膜的铜网上，滴样时要防止铜网被液体吸到管上来或翻转而被污染。
如果用Formvar膜时，在制好膜后，可以直接在粘于滤纸上的铜网进行负染色操作。
如果用碳膜时，要用镊子夹着铜网，滴液后静置数分钟，然后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2分钟用滤纸吸去负染色液，再用蒸馏水滴在铜网上洗1～2次，用滤纸吸去水，待干后可用于电镜观察。
透射电镜的制样方法
透射电镜的制样方法一、超薄切片法。
1.1 取材。
这可是制样的头一遭，就像盖房子打地基一样重要。
取材的时候得特别小心，要选取咱们感兴趣的部位。
这部位得有代表性啊，不能瞎取。
比如说研究细胞结构的，就得找到细胞长得好、特征明显的那块组织。
而且动作要快，就像抢红包似的，手慢无。
为啥呢？因为组织一旦离开生物体，就开始发生变化了。
1.2 固定。
固定这一步可不能含糊。
就像给组织“定个型”，让它保持生前的状态。
通常会用到化学固定剂，像戊二醛啥的。
把组织泡在里面，就像把东西放在保险柜里一样，稳稳当当的。
这一步要是没做好，后面的观察就全乱套了，那可就是“一着不慎，满盘皆输”。
1.3 脱水。
脱水就像给组织“脱衣服”，把水分一点一点去掉。
用的是一系列不同浓度的乙醇或者丙酮。
这个过程得循序渐进，不能操之过急，不然组织就会被破坏。
这就好比爬山，得一步一个脚印，急不得。
1.4 浸透与包埋。
浸透呢，就是让包埋剂慢慢渗到组织里。
包埋就像给组织做个“小房子”，把它保护起来。
常用的包埋剂有环氧树脂之类的。
这一步就像给宝贝裹上一层保护膜，得仔仔细细的。
1.5 超薄切片。
这可是个精细活，切片要薄得像蝉翼一样。
用超薄切片机来切，切的时候得全神贯注，稍有不慎就会前功尽弃。
切出来的片子就像一片片小雪花，又薄又脆弱。
二、负染法。
2.1 样品准备。
先把要观察的样品处理好，比如说提纯之类的。
这就像把菜洗干净，准备下锅一样。
得把杂质去掉，让咱们想看的东西“干干净净”地呈现出来。
2.2 负染。
用重金属盐溶液来进行负染。
这就像给样品穿上一件深色的“衣服”，让它在电镜下更明显。
染的时候要控制好量，多了少了都不行，就像炒菜放盐，得恰到好处。
三、冷冻制样法。
3.1 冷冻固定。
直接把样品快速冷冻，让它瞬间定格。
这就像给样品来了个“急冻魔法”。
这样能最大程度地保持样品的原始状态，避免化学固定带来的一些变化。
3.2 冷冻超薄切片。
在冷冻的状态下进行超薄切片。
这可不容易，就像在冰上雕刻一样，需要特殊的设备和技术。
透射电镜常规样品制备流程(精)
透射电镜样品制备流程因为透射电镜能察看的样品一定很薄（ 60～ 70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单调，仅有一下两种方法：一．负染色技术负染色技术简单迅速，能够显示生物大分子、细菌、分别的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、构造、大小以及表面构造的特点。
特别在病毒学中，负染色技术有着宽泛的应用。
样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，可是假如杂质太多，如大批的细胞碎片，培育基残渣，糖类以及各样盐类结晶的存在都会扰乱染色反响和电镜的察看。
特别是不可以有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类简单碳化而有碍察看，所以样品要适合提纯。
②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品聚积影响察看。
操作流程：汲取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，而后用滤纸吸去剩余的液体，滴上负染色液，染色1～2min 后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜察看。
二、超薄切片技术超薄切片技术是为透射电镜察看供给薄样品的特意技术，是生物学中研究细胞超微构造最常用的技术。
宽泛应用于生物体的各样细胞的超微构造察看。
一般厚度在10～100nm 的切片称为超薄切片，制作这类切片的技术叫做超薄切片技术。
超薄切片制作的过程包含取材、固定、脱水、浸透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的白腊切片过程相像。
可是，超薄切片切片过程更加仔细与复杂，要求更严格，并且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。
详细操作步骤、注意事项以下：1．取材和前固定：迅速的切取大小为0.5～1.0mm3 的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入 2.5％戊二醛（入口质量）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。
要求：①取材前必定要和工作人员获得电话联系！②取材选择部位要正确靠谱，保证每块资料都是要察看的部位。
③全部植物样品必定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空 15mins，不可以沉底的样品必定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不可以成块的样品，加戊二醛固定液，离心积淀后送到平台，由平台工作人员办理。
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晶体薄膜法
薄膜样品制备步骤：
① 切取：切取薄块（厚度<0.5mm） ② 预减薄：用机械研磨、 Dimpling、化学抛光
等减薄成“薄片”（0.1mm） ③ 终减薄：用电解抛光、离子轰击减薄成“薄
膜”（<500nm）（视材料而定，对于塑性较 好而又导电的材料，一般采用双喷电解抛光， 而对于陶瓷等脆性较大，又不导电的材料一般 用离子减薄的方法。 ）
二、间接样品(复型)的制备
在电镜中易起变化的样品和难以制成薄膜的试 样采用此方法.
表面显微组织浮雕的复型膜，只能进行形貌观 察和研究复型的制备方法，复型主要分为：
一级复型
二级复型
萃取复型（半直接样品）
一级复型
一级复型是指在试样表面的一次直接复型。
避免引起组织结构变化，不用或少用机械方法。 终减薄时去除损伤层。
电解双喷
1。电解双喷时，一般要进行冷却，常用液氮 加酒精的方法来冷却，尤其是钢铁材料，必须冷 却，而且最好用液氮。
2。电解双喷时，要调好电流和电压的值，只 有电流和电压的值处于电解抛光的平台时，才能 制造出好的样品。
常用电解减薄液
粉末（纤维）样品的断面
2. 晶体薄膜样品
块状材料多采用此方法。 通过减薄制成对电子束透明的薄膜样品。 薄膜样品制备方法要求： ①薄膜样品的组织结构必须和大块样品相同，且制
备过程中不引起材料组织的变化。 ② 薄，相对电子束而言必须有足够的“透明度”，
且避免薄膜内不同层次图像的重叠，干扰分析。 ③ 具有一定的强度。
2.塑料复型不破坏样品；而碳膜复型破坏样品（分 离膜与样品时要电解腐蚀样品）。
3.塑料复型因塑料分子较大，分辨率低（1020nm)；碳离子直径小，碳膜复型分辨率高 (2nm)
② 二级复型
先一次复型，然后进行二 次碳复型，把一次复型溶去， 得到第二次复型。 为了增加衬度可在倾斜 15-45°的方向上喷镀一层 重金属，如Cr、Au等。
序号
1
2 3 4
电解液成分与配比
适用材料
乙醇（80ml），冰醋酸(80ml)，高氯酸 (15ml)，甘油(10ml)
正磷酸(480ml)，硫酸(50ml)，铬酐(80g)， 水(60ml)
高氯酸(80ml)，冰醋酸(70ml)
高氯酸(10ml)，乙醇(90ml)
高温合金，耐热钢 ，铝及其合金。
铝及铝合金
30CrMnSi钢回火组织
低碳钢冷脆断口
③ 萃取复型
用碳膜把经过深度侵蚀 （溶去部分基体）试样表 面的第二相粒子黏附下来。 既复制表面形貌，又 保持第二相分布状态，并 可通过电子衍射确定物相。 兼顾了复型膜和薄膜的优点。
萃取复型
二、直接样品的制备
1.粉末样品制备 粉末样品制备的关键是如何将超细粉的颗粒分散开来，各自独立而不
一级复型复型主要分为塑料（火棉胶）一级复型 和碳膜一级复型。
其中，塑料一级复型，相对于试样表面来讲，是
一种负复型，即复型与试样表面的浮雕相反；它
是对样品表面形貌的简单的复制，其表面的形貌 与样品的形貌刚好互补，所以称之为负复型。而
碳膜一级复型是一种正复型。
① 塑料一级复型
样品上滴浓度为1%的火棉 胶醋酸戍酯溶液或醋酸纤维 素丙酮溶液，溶液在样品表 面展平，多余的用滤纸吸掉， 溶剂蒸发后样品表面留下一 层100nm左右的塑料薄膜。 分辨率低（10－20nm），电子束照射下易分解
支持膜法
支持膜的作用是支撑粉末试样，铜网的作用是 加强支持膜。将支持膜放在铜网上，再把粉末 均匀分散地捞在膜上制成待观察的样品。
支持膜法
支持膜材料必须具备的条件： ① 无结构，对电子束的吸收不大； ② 颗粒度小，以提高样品分辨率； ③ 有一定的力学强度和刚度，能承受电子束的
照射而不变形、破裂。 常用的支持膜材料：火棉胶、碳、氧化铝、聚
图 塑料-碳二级复型制备过程示意图
塑料-碳二级复型
塑料-碳二级复型结合两种一级复型的优点。 不破坏样品原始表面；最终复型碳膜，稳定性 和导电导热性都很好，电子束照射下不易分解 和破裂；分辨率和塑料一级复型相当。
适于粗糙表面和断口的复型。
二级复型照片
回火组织中析出的颗粒状碳化物
解理断口上的河流花样
乙酸甲基乙烯酯等。 在火棉胶等塑料支持膜上镀一层碳，提高强度
和耐热性，称为加强膜。
支持膜法
支持膜上的粉末试样要求高度分散，可根据不 同情况选用分散方法：
① 悬浮法：超声波分散器将粉末在与其不发生 作用的溶液中分散成悬浮液，滴在支持膜上， 干后即可。为了防止粉末被电子束打落污染镜 筒，可在粉末上再喷一层碳膜，使粉末夹在中 间。
钢，硅钢 镍基合金，硅钢，
马氏体时效钢
离子减薄法
首先一般是用金刚石锯将块状样品切成0.5~1mm的薄片 ，接下来用手工研磨的方法将薄片研磨到50μm左右，然 后用小刀片将其划为略小于3毫米的小块，用树脂胶或者 A、B胶将小块样品粘于铜环或者钼环上，接着用手工研 磨的方法将其研磨至小于20μm之后，用挖坑仪将其减薄 至小于10μm，然后用离子减薄仪将其减薄至穿孔为止。 离子减薄是采用高能量的Ar离子轰击样品表面，把样品表 面上的原子团或分子团剥离样品。
团聚。 胶粉混合法：在干净玻璃片上滴火棉胶溶液，然后在玻璃片胶液上放
少许粉末并搅匀，再将另一玻璃片压上，两玻璃片对研并突然抽开， 稍候，膜干。用刀片划成小方格，将玻璃片斜插入水杯中，在水面上 下空插，膜片逐渐脱落，用铜网将方形膜捞出，待观察。 支持膜分散粉末法： 需TEM分析的粉末颗粒一般都远小于铜网小孔， 因此要先制备对电子束透明的支持膜。常用的支持膜有火棉胶膜和碳 膜，将支持膜放在铜网上，再把粉末放在膜上送入电镜分析。
② 散布法：直接撒在支持膜表面，叩击去掉多 余，剩下的就分散在支持膜上。
悬浮法注意事项：
在分散粉末时要特别注意，如果分散不好的，在
电镜下将观察不到单个的粉末颗粒。为了确保 粉末分散，一般用小的容器盛满酒精 或丙酮，然后往里面放入极少量的粉 末样品，之后将其置于超声波振荡器 中振动15分钟以上，再用带支持膜的 铜网在溶液中轻轻地捞一下即可。
和破裂。
碳一级复型
样品放入真空镀膜装置中， 在垂直方向上向样品表面蒸镀 一层厚度为数十纳米的碳膜。 把样品放入配好的分离液中进 行电解或化学分离。 分辨率高（2－5nm）， 电子束照射下不易分解和 破裂，样品易遭到破坏。
碳膜与塑料一级复型的区别：
1.碳膜复型的厚度基本上相同，而塑料复型的厚度 随试样位置而异。