20170301CTC单细胞mRNA测序技术路线

CTC单细胞mRNA测序技术路线

从这里之后的数据分析部分都没有哦~

单细胞转录组mRNA测序

一、技术简介

单细胞转录组是指某个细胞在某一生理功能状态下所有转录的mRNA产物的集合，是基因组遗传信息传递和表达的重要步骤和过程。

单细胞转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一单个细胞在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。

转录组测序针对的是有参考基因组的物种。与参考基因组比较，可以得到基因表达差异、可变剪接、融合基因等遗传调控信息。

二、MALBAC技术

1.运用Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles, MALBAC多重退火环状循环

扩增技术，精确反转录某一单个细胞在某一状态下的几乎所有转录本序列信息mRNA并进行扩增。

解决了扩增对微量初始模板过大的扩增偏移，使得单细胞中90%的基因组能够被测序，样品起始量可低至0.5pg；

2.无物种的限定；要求mRNA有Poly A尾结构，GC％为35％-65％。

3.分辨率高：单碱基分辨率；

4.覆盖度高：能覆盖到几乎所有转录本片段序列；

5.检测范围广：从几个到数十万个拷贝精确计数，可同时鉴定及定量正常和稀有转录本；

三、技术参数

1.样品要求

样品类型：已分离的单细胞样本或去蛋白并进行DNase处理后的完整Total RNA；

样品需求量（单次）：使用MALBAC进行微量扩增，样品建议为单细胞或总量≥10pg，最低起始量≥0.5pg；

2.测序策略

PE151。

推荐数据量

6G clean data以上。

3.项目执行周期

每个样品数据量6G以下，样品量小于10个，标准流程的执行周期约为50 个工作日；

样品数量多于10个时，项目的执行周期需根据项目的规模而定。

4.项目合格指标

产生不低于合同规定的clean data。

四、主要技术流程

单细胞裂解-MALBAC扩增-文库构建-高通量测序-数据处理-生物信息分析

五、信息分析

标准信息分析：

1.对原始数据去除接头序列、污染序列及低质量reads；

2.测序数据统计；

3.对于有参考基因组的转录组分析，须明确具体物种，因为即使有参考，很多物种SNP或Indel等注

释信息也不像人的那么全、那么规范。生物信息部需确定特定物种的某些分析是否可做。

单细胞转录组建库其实是：单细胞转录组扩增+基因组建库（扩增后产物是DNA）。单细胞不能做链特异性转录组测序。