RT-PCR实验步骤
RT-PCR的具体步骤
4.弃上清的操作，我们一般将EP管倒置在平铺于桌面的卷纸上，吸干。
5.最后一步弃酒精，将RNA溶于DEPC水的操作，我们的做法是：先按4的步骤吸干酒精，
其实这样还是不彻底的，再将EP管小离心后用20μl小枪头（DEPC处理过的）吸出多余的酒 精。最后用200μl中枪头（DEPC处理过的）吸11.5μl（20μl体系，如果是40μl体系则加倍）的DEPC水至EP管中，吹打助溶，然后转移至200μl的EP管（这些EP管中可以事先加好Oligo（dT）15，以节省枪头）中。
脂糖凝固）后现进行电泳。
2．1.5%:同上，将琼脂糖的量改为1.5g
六．需购置材料
Taq酶（-20度保存）（配10×buffer和MgCl2）：不需要使用高保真Taq酶，一般的就行。个人感觉天为时代的普通Taq酶就很不错。
dNTP（4度保存）：向生物公司购买，原装和分装均可。
oligo（dT）15（-20度保存）：可以向生物公司购买Invitrogen合成的廉价货， 每支10元，稀释后 使用（注意稀释浓度），也可以购买Promega的原装货，稀释10倍后使用， 稀释液4度保存。
1．DEPC水：吸出1ml DEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水，并充分振荡混匀备用。
2．75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存（DEPC水需先高压，高压时注意：
1.装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在40-45分钟， 所以水要适当多
干，EP管和匀浆管装入饭盒后甩干，然后在37度孵箱烘干）。高压后烤干备用。如果DEPC处理过的物品时间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。
RT-PCR步骤
RT-PCR实验步骤佚名一、组织抽提：1.取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末2.移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆3.移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打4.冰上孵育5分钟5.离心12,000g 4℃ 5分钟取上清液移入1.5ml新离心管6.加0.2 ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟7.离心<12,000g 4℃ 10分钟取上层液相移入1.5ml新离心管8.加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟9.离心<12,000g 4℃ 5分钟弃去上清液10.加入1 ml 75%乙醇，震荡11.离心<7,500g 4℃ 5分钟弃去上清液12.室温下使之变透明13.加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA（可保存在液氮或低温冰箱）14.走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度二、RT反应体系（第一步）：约20分钟1.65℃ 15分钟2.立即放入冰浴RT反应体系（第二步）：约2小时1.37℃ 1.5小时2.94℃ 5-10分钟3.反应物保存于-20℃或进行PCR三1、PCR反应体系：约4.5小时1.94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟为第一个步1个循环2.94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟为第二步30个循环3.72℃ 10分钟4.取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳三2、PCR反应体系：约5小时1.94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟为第一个步1个循环2.94℃ 45秒，50℃ 40秒，72℃ 1分钟为第二步40个循环3.72℃ 10分钟4.取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳四、电泳：约1.25小时1.配0.5×TBE电泳缓冲液300 ml2.胶浓度1.7%（40ml 0.5×TBE加0.68g胶）3.微波炉中火2分钟溶解胶4.冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0.5μg/ml）5.放入梳子，浇板，待凝固6.加8μl PCR反应产物+2μl溴酚兰7.电泳50-80V（每㎝ 5V）。
RT-PCR的具体步骤
RT-PCR的具体步骤RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常见的分子生物学技术，用于检测RNA分子。
在本文中，我们将介绍RT-PCR的具体步骤，以便您更加全面地了解这种技术。
1.总RNA提取首先需要从细胞中提取RNA。
这可以通过商用试剂盒或手工方法实现。
如果使用试剂盒，则遵循其说明书中的步骤。
如果手工提取RNA，则需要使用三个基本试剂：细胞裂解缓冲液、氯仿和异丙醇。
步骤如下：•将细胞收集在管中，加入裂解缓冲液。
•冷冻-解冻样品3次，使细胞壁破裂并释放RNA。
•加入氯仿并混合。
•离心样品，使沉淀分离出来。
•将上层溶液转移到另一个管中，加入异丙醇。
•冷藏或冷冻，然后离心。
•去除上层液体，并在无水酒精中对RNA进行洗涤和沉淀。
2.反转录在提取出RNA后，需要将其转录为DNA，即逆转录。
这可以通过使用反转录酶（RT）实现。
在反转录步骤中，会加入反转录引物和其他试剂来增强逆转录效果。
这些引物是由需要扩增的RNA序列的反向互补核酸序列构成的。
这些步骤如下：•将RNA加入反转录反应混合物中，该混合物包含反转录酶、引物和其他必要试剂。
•反转录混合物通常通过加热来促进逆转录引物结合到RNA模板上，并形成RNA-DNA杂交链。
随后，反转录酶在杂交链上寻找RNA模板，并通过降低杂交链的熔点来将反转录引物延伸为cDNA链。
3.PCR扩增完成逆转录后，需要进行PCR扩增以增加cDNA的数量。
PCR是一种将 DNA 扩增到数以百万计的技术，能够扩增非常小的DNA模板。
PCR的步骤如下：•在PCR反应混合物中加入适当的引物和其他必要试剂。
•该反应混合物包括DNA聚合酶、模板DNA、引物和核苷酸。
•反应混合物被放入PCR机器中，按照特定的程序进行加热和冷却，使DNA链复制为两条新的DNA链。
•扩增程度由PCR反应的周期数决定。
4.分析最后，将扩增的DNA分离并分析它们的大小、类型和量。
这可以通过游离电泳或毛细管电泳等技术实现。
RT-PCR实验步骤
RT-PCR实验步骤一、总RNA提取1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。
2. 震荡30s。
3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。
4. 12000×g，4℃离心，15min。
5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。
6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。
7. 12000×g，4℃离心，10min。
在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。
9. 7500×g，4℃离心，10min。
10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。
11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD28012. 计算浓度与纯度，-70℃保存。
二、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下混匀快速离心一次反应条件如下-20℃ 冰箱冻存三、PCR反应混匀快速离心一次反应条件如下PCR产物-20℃冰箱保存取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。
100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。
RT-PCR实验方法总结1,2RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
RT-PCR步骤
RNA提取（-80℃保存）1.取50-100mg组织加入1ml Trizol，剪碎，振荡30s2.转入一新EP管中（），室温保存5min3.加氯仿，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min4.12000 rpm 4℃离心15min5.转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇,振荡混合，室温保存10min6.12000rpm 4℃ 离心15min7.倒掉上清，加1ml 75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合，7500rpm 4℃ 离心5min8.倒掉上清，室温或37℃放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥9.加20ul DEPC水至EP管中10.在50℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解注意：操作过程中带手套口罩，所用到的仪器设备须经去除RNA酶处理（灭菌或DEPC水浸泡）测RNA浓度（以750ul体系为例）11.调零：750ul DEPC水12.测量：745ul DEPC水 + 5ul RNA13.总RNA浓度= OD260×40×稀释倍数（150倍）ug/ml14. = OD260×40×150 ug/ml15. = OD260×6 ug/ul16.A260/A280应在之间逆转录（cDNA：一周内-20℃保存，长期-80℃保存）方法一：以通用试剂盒为例，反应体系20ul1.RNA短暂离心2.RNA模板,再加入Oligo(dt) 1ul,加DEPC水补齐至10ul.轻轻混合均匀，短时间离心3.将反应液置于65℃ 5min 冰上1min,短时间离心4.按顺序加入：5×buffer 4ul200ul核糖核苷酸酶抑制剂10mm dNTP MIX 1ul逆转录酶 1ulRNase-free H2O轻轻混合均匀，短时间离心5.将混合物置于37℃，60min6.75℃加热15min,中止上述反应，置于冰上注意事项1.RNA提取和逆转录时所用器具均应在1‰DECP水中避光浸泡过夜，再高压烘干2.DECP水配制（先加DEPC，再加水，避光过夜，然后高压）3. 75%无水乙醇配制（DEPC水：无水乙醇=1:3）4. RNA提取和逆转录时应全程佩戴一次性手套和口罩聚合酶链反应PCR(产物-20℃保存)方法一：1．25ul的反应体系，冰上操作，稍后短时间离心Template 1ul/3ulPrimer 1 1ulPrimer 2 1ul10*Taq Buffer 5uldNTPs(10mM) 1ulTaq酶 1ulddH2O 补至25ul循环:① 94℃ 5min② 94℃ 45s③Tm+4℃ 45s④72℃ 45s 2 29-34 (从第2步开始循环30-35个循环)⑤ 72℃ 10min⑥ 4℃ 12hPCR结束后-20℃保存或置于冰上开始电泳。
rt-pcr反应步骤
rt-pcr反应步骤
RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种用于检测RNA的技本。
它可以将RNA转录成DNA，然后进行聚合酶链式反应来扩增特定的DNA片段。
以下是RT-PCR的一般步骤：
1. 样品处理，首先需要从样品中提取RNA。
这包括细胞或组织
的裂解以释放RNA，并使用适当的试剂将RNA纯化出来。
2. 逆转录，提取的RNA经过逆转录反应，使用逆转录酶（如
M-MLV逆转录酶）将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
3. PCR准备，为了进行PCR，需要将逆转录产生的cDNA与引物（primer）和DNA聚合酶（如Taq聚合酶）放入PCR反应管中。
引
物是一小段与目标DNA序列互补的DNA片段，它们将指导DNA聚合
酶在特定区域合成新的DNA链。
4. PCR扩增，PCR反应进行数个循环，每个循环包括三个步骤，变性、退火和延伸。
在变性步骤中，反应混合物被加热以使DNA解链。
在退火步骤中，引物与目标DNA结合。
在延伸步骤中，DNA聚
合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
这些循环会使目标DNA片段
指数级增加。
5. 结果分析，最后，通过凝胶电泳或其他技术，可以分析PCR 反应产生的DNA片段，确定是否存在感兴趣的基因或RNA。
总的来说，RT-PCR是一个用于检测和定量RNA的强大技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的步骤，可以在研究和临床诊断中发挥重要作用。
rt-pcr的步骤和注意事项
RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。
下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。
步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。
常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。
2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。
逆转录反应需要逆转录酶和引物。
在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。
3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。
退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。
4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。
PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。
5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。
注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。
为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。
2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。
阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。
质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。
3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。
引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。
此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。
4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。
反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。
RT-PCR实验原理与步骤
RT-PCR实验原理与步骤【实验原理】RT-PCR 是以RNA 为模板经逆转录反应（Reverse Transcription，RT）产生cDNA第一链，再以cDNA 为模板进行PCR 扩增以检测目的基因的表达情况。
【实验仪器】1. 恒温金属浴2. PCR 扩增仪【试剂及配制】RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0试剂包括：1. AMV 反转录酶XL (5 U/ul)2. 10×反转录反应缓冲液3. RNAase 抑制剂(40 U/ul)4. 随机引物9 mers (50 pmol/ul)5. RNAase Free dH2O6. TaKaRa Ex TaqTM HS (5 U/ul)7. 5×PCR 反应缓冲液8. dNTP Mixture (各10 mM)【实验步骤】1. 反转录反应1）按下列组成配制反转录反应液MgCl2 2ul2. PCR 反应1）按下列组成配制PCR 反应液2）把此反应液加入到第一阶段反转录结束后的PCR 反应管中，轻轻混匀；3）按以下条件进行PCR 反应：94 ℃ 2 min，94℃ 30 sec、55 ℃ 30 sec、72℃ 4 min、30 cycles，72℃ 5 min。
4）琼脂糖凝胶电泳检测结果。
【注意事项】1. PCR 条件设定退火温度可根据实际情况适当地提高或降低（50℃～60℃）。
延伸时间因目的序列长度不同而不同。
cDNA 量较少时，循环次数可增加为40～50 次。
2. 当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液（MasterMix），然后再分装到每个反应管中。
3. 使用酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取前要小心地离心搜集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
4. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回－20℃中保存。
5. 分装试剂时务必使用新的Tip 头，防止样品间污染。
RT-PCR步骤
RT-PCR实验步骤1、引物设计2、 RNA提取1) 离心管中，取150ul的淋巴细胞，加入1ml Trizol试剂2) 静置5分钟或马上-70℃保存3) 12000 rpm 离心15分钟,分相为三层，取上清液至新管4) 加入200ul氯仿，振荡混均30秒5) 室温静置3-5分钟分层6) 12000rpm离心15分钟，取上清液至新管，中间层和红色下层4℃保存，便于提取DNA 和蛋白质7) 上清液加入约的异丙醇（预冷）,振荡混均30秒，室温下静置15分钟8) 12000rpm离心10分钟，弃上清，RNA沉淀管底。
9) 如沉淀不明显，则再离心数秒吸出上清10) 加入1ml 75%乙醇（预冷），温和震荡悬浮沉淀11) 8000 rpm离心5 min,弃上清12) 短暂快速离心（5秒），吸弃上清13) 室温放置2分钟晾干14) 沉淀加入15ul DEPC处理水，轻弹管壁溶解15) 少量样品55-60℃孵育10～15分钟16) 测量OD A260/A280值后，样品放置－70℃保存。
(保存时间不应超过一星期)3、反转录用琼脂糖电泳抽样检测RNA的纯度，如果杂质较多，则需要加DNA酶进行去杂。
然后在进行反转录步骤（购买反转录试剂盒）。
反转录步骤初步定为：1）离心管加入1μl总RNA，1μl随机引物oligo(dt），10μlDEPC处理水。
2）混匀，瞬时离心5秒。
3）70℃水浴5min。
4）迅速冰浴2min。
5）瞬时离心，加入4 ul 5× Buffer, 2 ul DTT, 2 ul 10Mm dNTPs。
6）混匀，温浴2min。
7）加入1 ul 反转录酶，42℃温育50min。
8）70℃孵育10min灭活。
9）-70℃冰箱。
4、 PCR条件优化为了寻求PCR最适DNA模版浓度和引物浓度，采用交叉法分别对模版和引物进行梯度稀释，交叉进行PCR反映，确定最佳浓度搭配。
(1) 反应体系：SYBR Premix Ex Taq 10μl PCR Forward Primer μlPCR Reverse Primer μl ROX Reference Dye μlDNA模板μl dH2O μlTotal 20μl(2) 反应条件Stage 1：预变性 Reps：195℃，30sStage 2：PCR反应 Reps：4095℃ 5s 60℃ 30s(3) 2块96孔板反应最佳条件，即模板（cDNA）浓度和不同目的基因引物浓度a：DNA模版浓度（稀释倍数）b：特异性引物浓度c：不同基因A、B、C、D：DNA模版浓度梯度A1、A2、。
RT-PCR实验步骤
(1)RNA提取1、取出新鲜肝组织，放在液氮中冻存备用。
2、取匀浆器，加入lml的Trizol Reagent，置冰上预冷。
3、取100mg新鲜肝组织，加入到匀浆器中。
4、充分研磨直至无可见组织块，转移到1.5ml EP管中。
(2)两相分离每lml的Trizol Reagent试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4C下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的Trizol Reagent试剂的60％。
(3)RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30C孵育10分钟后，于4C下12000rpm离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
(4)RNA清洗移去上清液，每lml Trizol Reagent试剂裂解的样品中加入至少lml的75％乙醇(75％乙醇用DEPC H2O配制)，清洗RNA沉淀。
混匀后，4C下7000rpm离心5分钟。
(5)RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
(6)溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40u1用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80C待用。
(7)测定RNA的质量1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定：A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。
样品RNA浓度(ug/m1)计算公式为：A260×稀释倍数×40 ug／ml。
具体计算如下：RNA溶于4u1 DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495 ul的TE中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40ug/ml=840ug/ml或0.84ug/ul取5ul用来测量以后，剩余样品RNA 为35u1，剩余RNA总量为：35u1×0.84 ug/ul=29.4 ug②纯度测定：RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
RT-PCR实验方法简介-PCR
RT-PCR实验方法简介RT-PCR定义：是指对组织或细胞的总RNA进行抽提，把RNA反转录为cDNA，然后设计目的基因引物进行PCR，琼脂糖电泳并数码拍照，分析电泳条带灰度值，判断目的基因mRNA转录水平的相对量的变化。
RT-PCR流程简介一、抽提RNA：1、防止RNA酶污染180℃的高温下干烤6hr以上；0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗；去污剂洗涤，双蒸水冲洗；溶液皆用0.1% DEPC水配置，试剂应为新开封或RNA专用；操作人员戴手套；器械专用。
2、材料的准备组织及细胞最好为新鲜的，或者在－70℃条件下保存半年以下；尽量避免材料的冻融。
3、确认RNA的质量检测RNA溶液的吸光度：OD260/OD280=1.8－2.0RNA的电泳图谱：28S和18S条带明亮、清晰、指条带边缘清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上。
二、反转录：单管一步法:反转录和PCR反应在一个管子中完成，得到的全部cDNA产物都一起经PCR 扩增，灵敏度更高，但是容易相互干扰。
两步法:反转录和P CR分开做，PCR取反转录反应产物的1/10进行，更为灵活而且严谨，但是灵敏度不如前者高。
三、PCR：1、参照基因PCR参照基因一般选择看家基因（长表达、高表达量的基因），常用18S、β－actin、bubulin、GAPDH，其中ACTIN最为普遍；参照基因与目的基因在同一个管子内进行PCR反应的情况下，称之为内参；参照基因与目的基因在不同管子内反应成为外参；由于内参可能与目的基因竞争模板及酶，或造成其它干扰，外参的应用较为普遍。
2、目的基因PCR典型的引物18到24个核苷长，引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
RT-PCR实例：1、实验材料：拟南芥野生型Ws及突变体m1、m2花序2、实验目的：分析m1、m2与野生型花序中G1基因的表达的差异3、实验步骤：设计ACTIN及G1基因的引物；分别抽取野生型Ws及突变体m 1、m2花序RNA，DNase I处理，以尽量去除基因组DNA；电泳检测，估计R NA总量；取1ug左右的RNA进行反转录；取反转录好的cDNA总量的1/10（10ul反转录体积则取1ul），稀释10倍（稀释至10ul），取1/10（1ul）为模板，用ACTIN引物、普通PCR体系、20－2 5个循环、以基因组DNA为对照（因为引物跨内含子，所以基因组DNA扩增出的条带大小与cDNA扩增出的条带大小不同，以去除残留的基因组DNA的影响）做PCR；取等量产物电泳，根据电泳条带的亮度调整模板量（如m1的亮度为Ws的2倍，则下次PCR时m1的模板为0.5ul），直到电泳亮度基本一致，可认为此时所取的不同体积的野生型Ws及突变体m1、m2模板里RNA的含量基本相同。
RTpcr实验步骤
RT-PCR实验步骤RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的实验技术，可以在体外合成DNA的互补链。
它广泛应用于分子生物学研究、病毒检测以及基因表达分析等领域。
下面将介绍RT-PCR实验的步骤。
材料准备在进行RT-PCR实验之前，需要准备以下实验材料：1.逆转录试剂盒：包括逆转录酶、引物、缓冲液等。
2.样品：需要包含RNA的样品，如细胞总RNA或组织RNA。
3.质控物：用于验证实验的阴性和阳性对照物。
4.相关试剂：如脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）、MgCl2、RNase抑制剂等。
逆转录反应前处理1.将RNA样品加入无RNase试剂管中，以免被RNase降解。
2.加入逆转录酶、逆转录缓冲液、dNTP、MgCl2和RNase抑制剂，轻轻混合。
反应条件1.设置逆转录反应的温度和时间：通常在50-60摄氏度下反应10-60分钟，以逆转录酶的要求为准。
2.根据逆转录酶的要求进行热变性处理，以停止反应。
PCR扩增准备PCR反应液1.在无RNase的条件下，制备PCR反应液。
组分包括引物、dNTP、PCR缓冲液和PCR酶。
2.在无样品的条件下，混合PCR反应液。
反应条件1.设置PCR反应的循环条件：包括变性、退火和延伸温度，循环次数根据需求而定。
2.在PCR反应过程中收集产物供进一步分析和检测。
结果分析通过PCR扩增获得的产物可以进行各种分析和检测。
1.凝胶电泳：将PCR产物与DNA分子量标准一同在琼脂糖凝胶上进行电泳，通过电泳图观察目标DNA的条带。
2.定量PCR：通过测定PCR反应体系中初始DNA的数量，可以计算出初始样品中的目标DNA的初始数量。
3.实时荧光定量PCR：结合荧光染料和合适的探针，可以实时监测PCR反应体系中目标DNA的扩增过程。
结论RT-PCR实验是一种重要的分子生物学技术，能够在体外合成DNA的互补链。
通过逆转录反应和PCR扩增，可以获得目标DNA的大量复制产物，并通过结果分析方法进行进一步研究。
RT PCR的具体步骤
RT PCR的具体步骤rt-pcr的具体步骤rt-pcr实验步骤一．实验器具：1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl2.吸头：1ml、200μl、20μl3.匀浆管：5ml4.ep管：1.5ml、500μl、200μl5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，摆75%乙醇)6.量筒：100ml7.容量瓶：1000ml8.试管架：5ml、1.5ml、20μl9.铝制饭盒：1-2个10.大瓷缸：1个11.锡泊纸：一卷12.卷纸：2卷13.三角烧瓶：外盖，稍大二．实验器具处置1.塑料制品：(包括枪头、ep管、匀浆管等)先将depc水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中(注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入depc水)，过夜后取出(注意：depc水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的depc物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，ep管和匀浆管装入饭盒后甩干，然后在37度孵箱烘干)。
高压后烤干备用。
如果depc处理过的物品时间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。
2.玻璃制品：泡酸过夜，冲洗整洁，先泡1‰d epc过夜，再塞锡纸烤干水泵。
3.匀浆器：(包含剪刀、镊子)先晒干后，超音波消毒即可(不须要泡depc)。
三．试剂酿制1．depc水：吸出1mldepc放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰depc水，并充分振荡混匀备用。
2．75%乙醇：用无水乙醇+depc水分体式，然后摆-20℃留存(depc水需先高压，高压时特别注意：1.装depc水的瓶子在盖子和瓶之间Though上线头；2.高压时间在40-45分钟，所以水要适度多加一点；3.高压完结后，不要私自换气，必须使压力自然上升，不然水会燃烧)。
3．异丙醇：放进棕色瓶中。
4．乙醚：放进棕色瓶中。
5．琼脂糖四．缓冲液配制1．电泳缓冲液(5×tbe储藏液)：tris54g、硼酸27.5g、0.5medta20mlph8.0、加蒸滚水至1000ml。
RT-PCR操作步骤
RT-PCR 操作步骤（20 ul反应体系）一、试剂准备1 RNA提取试剂：Trizol1.1 氯仿1.2 异丙醇1.3 无水乙醇1.4 0.1%DEPC水2 第一链cDNA合成试剂盒3 PCR：荧光定量试剂盒3.1 目的基因引物3.2 内参基因引物二、仪器、耗材离心管、离心机、水浴锅、PCR管、电泳仪、凝胶图像分析系统、移液枪、离心管盒。
三、操作步骤1 总RNA的提取1.1 均质化组织剪碎加入1ml Trizol，冰上匀浆1.2 相分离转入一新EP管中（1.5ml），室温孵育5min；加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈15s），室温孵育2~3min；4℃ 10000 g离心15min（下层红色，中间相，上层无色水相）；注：RNA存在于水相中，水相体积约为均质液60%。
1.3 RNA沉淀转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温孵育10min；4℃ 12000 g 离心15min；1.4 RNA洗涤弃上清，加1ml 75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合，4℃10000 g 离心5min（只做一次）；注：①无Ｒnase水配置：一般少配点儿，带胶塞的瓶子（250 ｍl），0.25ml DEPC ＋250ml双蒸水（先加DEPC），过夜，高压灭菌（30 min），高压是切记瓶口放一截细线，防止液体喷出。
冷却后4 ℃保存即可；②75%乙醇：即用即配，假如用4ml 75%乙醇，就吸取3ml无水乙醇，1ml无Ｒnase水；③样品可储存于75%乙醇中，-20℃保存至少一年。
1.5 RNA溶解倒掉上清，室温放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥；加20ul DEPC水至EP管中，吹打几次；在55℃~60℃孵育10 min(或手握10min)，使RNA充分溶解。
1.6 RNA浓度测定调零：750 ul DEPC水；测量：745 ul DEPC水+5 ul RNA（稀释150倍，可根据实际情况调整）总RNA浓度=OD260×40×稀释倍数（150倍）ug/ml=OD260×6 ug/ul注：OD260/OD280应在1.8~2.0之间。
rt-pcr的原理实验步骤及应用
RT-PCR的原理、实验步骤及应用1. 原理RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的原理，用于检测和定量RNA的表达水平。
下面是RT-PCR的基本原理：•首先，通过逆转录作用，将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
逆转录酶会在反应中合成cDNA互补链，其中DNA聚合酶将dNTPs部分替换为对应的ddNTPs（荧光标记的核苷酸）用于标记合成的cDNA。
•然后，在PCR反应中使用特定的引物（primers）来扩增目标cDNA。
引物是两个短的DNA序列，它们能够与cDNA互补的序列部分结合，从而指导DNA聚合酶合成新的DNA链。
•最后，通过荧光检测仪读取PCR反应体系中的信号，从而定量检测目标RNA的表达水平。
2. 实验步骤RT-PCR实验通常包括以下步骤：2.1 样品准备•收集所需的细胞或组织样品，并保存在RNA保护液中以保护RNA的完整性。
•如果需要，使用RNA提取试剂盒从细胞或组织中提取RNA。
2.2 逆转录反应•准备RT-PCR反应体系，包括逆转录酶、随机引物、RNA样品和其他反应组分。
•混合反应液，然后进行逆转录反应。
此步骤通常在反应器中以特定温度下进行。
2.3 PCR反应•将逆转录反应产生的cDNA用作PCR反应的模板。
•准备PCR反应体系，包括DNA聚合酶、引物和其他反应组分。
•将PCR反应液混合均匀，然后进行PCR反应。
PCR反应通常包括一系列的循环，在每个循环中，温度会发生变化以使DNA链合成和扩增。
2.4 结果分析•将PCR反应体系中的产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离。
•根据PCR反应产物大小，使用合适的染料将琼脂糖凝胶染色。
•使用紫外线透射仪观察琼脂糖凝胶中的DNA带，以便分析目标基因的扩增效果。
3. 应用RT-PCR广泛应用于分子生物学和医学领域，具有以下应用方面：•基因表达分析：通过测量RNA的表达水平，可以了解目标基因在不同样品中的表达情况，从而研究基因调控、识别潜在的生物标记物等。
RT-PCR步骤
RT-PCR实验步骤1、引物设计2、 RNA提取1) 1.5ml 离心管中，取150ul的淋巴细胞，加入1ml Trizol试剂2) 静置5分钟或马上-70℃保存3) 12000 rpm 离心15分钟,分相为三层，取上清液至新1.5ml管4) 加入200ul氯仿，振荡混均30秒5) 室温静置3-5分钟分层6) 12000rpm离心15分钟，取上清液至新1.5ml管，中间层和红色下层4℃保存，便于提取DNA和蛋白质7) 上清液加入约0.5ml的异丙醇（预冷）,振荡混均30秒，室温下静置15分钟8) 12000rpm离心10分钟，弃上清，RNA沉淀管底。
9) 如沉淀不明显，则再离心数秒吸出上清10) 加入1ml 75%乙醇（预冷），温和震荡悬浮沉淀11) 8000 rpm离心5 min,弃上清12) 短暂快速离心（5秒），吸弃上清13) 室温放置2分钟晾干14) 沉淀加入15ul DEPC处理水，轻弹管壁溶解15) 少量样品55-60℃孵育10～15分钟16) 测量OD A260/A280值后，样品放置－70℃保存。
(保存时间不应超过一星期)3、反转录用琼脂糖电泳抽样检测RNA的纯度，如果杂质较多，则需要加DNA酶进行去杂。
然后在进行反转录步骤（购买反转录试剂盒）。
反转录步骤初步定为：1）0.2ml离心管加入1μl总RNA，1μl随机引物oligo(dt），10μlDEPC处理水。
2）混匀，瞬时离心5秒。
3）70℃水浴5min。
4）迅速冰浴2min。
5）瞬时离心，加入4 ul 5× Buffer, 2 ul 0.1M DTT, 2 ul 10Mm dNTPs。
6）混匀，温浴2min。
7）加入1 ul 反转录酶，42℃温育50min。
8）70℃孵育10min灭活。
9）-70℃冰箱。
4、 PCR条件优化为了寻求PCR最适DNA模版浓度和引物浓度，采用交叉法分别对模版和引物进行梯度稀释，交叉进行PCR反映，确定最佳浓度搭配。
RT-PCR实验步骤
RT-PCR实验步骤RT-PCR注意：酶现拿现用，用完放回―20度先配后加，节约枪头试剂用前弹一下，再甩一下，再用；每次加液也是如此一、DNase处理：1、10ul 体系Total RNA 1ug（或者2ug）A ul10*buffer （含Mgcl2 ）1ulDNase（1U/ul）1ulDEPC free water补足总体积10ul即为8-A ul总体积：10ul37℃，30分钟即DnaseⅠ2、加入25mM的EDTA（终止DNA酶活性）1ul，（可以不加，无太大影响）65℃，10min，即DnaseⅡ备注：这一步后，共有11 ul的产物，取10ul进行一下的步骤，留取1ul作为对照，将这个1ul的留样用1ul的水稀释。
二、逆转录（以下为20ul的体系，如果样品过多，或者不同体系可以等比加样）1、加入，并混匀1)总RNA（含有1-2ugRNA，或者是10ul的第一步中经过DNase处理的总RNA）10ul2)Primer oligo（dt）18 （0.5ug/uL）1ul3)dNTP（10mM）1ul总体积：12ul 65℃，5min，立即取出放置在冰上（保持开链状态）即程序cDNAⅠ2、加入，并混匀5 x first brand buffer 4ul0.1M DTT 2ulRNA酶抑制剂（20U/uL）1ul总体积：19ul 37℃，5min（若用随机引物，则25℃，5min）即程序cDNAⅡ3、不等其降到4度，立即加入200U的逆转录酶，Revert Aid TM M―Mulv1ul总体积：20ul37℃，60min即程序cDNAⅢ4、70℃，10min，终止反应，冰上冷却。
注意：1)RT的步骤中的温浴可以用PCR仪来完成2)RT每步温浴前要稍微离心3)推荐的做法是DNase处理完后的RNA留用1ul，用来最后PCR的时候做对照，以排除可能的DNA污染。
三、PCR取逆转录的产物做PCR，参照普通的PCR。
RT-PCR步骤(1)
RT-PCR步骤：1、收细胞，消化离心后弃上清，再瞬时离心吸干上清。
Ep管也必须是无酶的。
2、以下步骤一定要用无酶枪头！！！每管都加入500ul的Trizol，吹打混匀，每管都要换枪头。
3、加100ul的三氯甲烷，剧烈晃动，离心，12000rpm，15min。
4、将离心后的液体吸200ul上清到新的EP管中，做好标记，千万不要吸到中间白色物质（有机相），如不小心吸到，需重新离心，在吸好的200ul的上清中加入200ul异丙醇，轻轻颠倒混匀5-6次，离心，12000rpm，10min。
5、此时RNA沉淀在管底，肉眼可见微弱的沉淀，用枪头弃掉管中的异丙醇，此过程很关键，一定要将管中的异丙醇吸干，但是注意不要吸到RNA沉淀！！！6、加不超过20ul的无酶水到RNA中，溶解RNA，轻轻弹打后离心。
7、RT1过程（合成第一链），拿出6个（6样本）RT-PCR的0.5ml的小管，每管加入1ul的Oligo-dt随机引物，6ul的无酶水，5ul的RNA，总计12ul。
瞬时离心混匀后上PCR仪，点RT1，过程约为5min。
8、准备RT2（第二链）试剂，准备一个0.5ml的EP管，下面为预混液，也可以分别单独加。
5×buffer：4ul×6样本=24uldNTP：2ul×6样本=12ulRNase抑制剂（RI）：1ul×6样本=6ul逆转录酶(RT)：1ul×6样本=6ul瞬时离心，混匀。
9、此时PCR仪中的6管样本已经合成第一链，将样本拿出放到冰盒上，每管加入7.8ul RT2预混液，上PCR仪，点RT2，过程约为一个小时。
10、此时RNA已经逆转录为cDNA，已经稳定，以下步骤可以用有酶枪头。
11、拿出0.5ml小管12个，6个做内参基因，6个做目的基因，分别加入普通去离子水7ul，引物2ul，cDNA1ul，Mix（2×Taq）10ul，混匀离心，上机，内参基因一般跑20个循环，目的基因25个循环。
rtpcr操作流程
rtpcr操作流程RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测RNA的技术，常用于检测病毒、细菌等微生物的存在。
下面将介绍RT-PCR的操作流程。
首先，准备实验所需的试剂和设备，包括RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、热循环仪等。
确保所有试剂和设备都处于干净、无菌状态。
第二步是提取RNA样本。
将待检测的样本（如血液、组织等）加入RNA提取试剂盒中，按照试剂盒说明书的指导进行RNA提取。
提取后的RNA样本应该是纯净的，没有受到污染。
第三步是逆转录反应。
将提取得到的RNA样本加入逆转录试剂盒中，进行逆转录反应，将RNA转录成cDNA。
逆转录反应的条件和时间根据试剂盒的说明进行设置。
第四步是PCR扩增。
将逆转录反应得到的cDNA加入PCR试剂盒中，进行PCR扩增反应。
PCR扩增的条件包括温度、时间和引物浓度等，需要根据试剂盒的说明进行设置。
第五步是检测PCR产物。
将PCR扩增反应得到的产物进行凝胶电泳或实时荧光定量PCR检测，确定目标基因是否存在。
通过比对标准曲线或者与阳性对照样本进行比较，可以确定目标基因的表达水平。
最后，分析结果并进行数据处理。
根据PCR检测结果，可以判断样本中是否存在目标基因，以及其表达水平。
对数据进行统计分析，得出结论并撰写实验报告。
总的来说，RT-PCR操作流程包括RNA提取、逆转录、PCR扩增、检测PCR产物和数据处理等步骤。
正确操作每一步，严格控制实验条件，可以确保实验结果的准确性和可靠性。
RT-PCR技术在医学、生物学等领域有着广泛的应用，对于疾病的诊断和研究具有重要意义。
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RT-PCR实验步骤RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。
（promega）。
2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
3.RACE我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。
有关内参：RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。
问：我曾经作过同一管的PCR，内有actin 和目的基因引物。
虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。
请教mxbdna2003 ，你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？答：it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using "accurate piptte" is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶就像你用某一种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又29根梁更准确吧。
更不要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。
PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒，就是用18s，不过我们看懂使用的那条序列，不知有没有人用过，告知其序列和genbank号。
正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完，当初和成了一堆。
有那位高手用过18s的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？原位杂交最好用RNA做探针，效果好一些，反正你有钱卖roche 的盒子，而且量也能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。
正义反义也容易理清。
我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。
因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。
记得我开始我的ＲＴ－PCR时，按常规方法，提取总ＲＮＡ后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了Ｎ次均没有结果。
后来考虑到本人的克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片断（尽管她用这些ＲＴ－ＰＣＲ产物做模版再进行ＰＣＲ时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ产物作模板（有点改进，逆转录反应换用了９mers随机引物），用我的引进物进行一般PCR，终于得到我的产物，测序结果完全正确。
尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以说明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经验很重要，但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制请问：1 引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc 和at含量算出吗？可以用引物报告单上的Tm值吗？2 PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适？MgCl2应加多少？各个成分的量有无确定标准？3 PCR结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？与cDNA的量少有关吗？Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性？一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的.20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。
而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。
由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。
因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。
在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。
在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。
这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。
而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA 酶。
一、防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。
它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。
RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
mRNA的分离与纯化真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。
绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。
这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA 的理论基础就在于此。
mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。
此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。
寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA一、试剂准备1．3M醋酸钠（pH 5.2）2．0.1M NaOH3．1×上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。
配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%。
4．洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS5．无水乙醇、70%乙醇6．DEPC二、操作步骤1．将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。