适配体筛选方法研究进展

适配体筛选方法研究进展

王巍 贾凌云*

(大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系,大连116023)

摘 要 利用指数富集配体进化技术(SELEX )可获得与目标靶具有特异性结合能力的适配体(寡核苷酸)。经过近20年的研究,适配体被证实可在科研及临床应用中部分取代抗体,是有很大发展前景的技术领域。适

配体技术发展的关键在于对目标靶具有高选择性吸附能力的适配体的筛选和获得。十几年来,以提高筛选效

率和效果为目标的适配体筛选技术不断改进,产生了如消减筛选、复合靶筛选、基因组筛选、毛细管筛选等新

方法,推动了这一技术的发展。本文对现有适配体筛选方法进行了系统的评述。

关键词 适配体,指数富集配体进化技术,筛选方法,评述

2008-09-08收稿;2008-10-26接受

本文系国家自然科学基金(N o .20435020)资助项目

*E-m ai:l l y j 81@dlut 1 引 言

适配体的概念在1990年由Tuer k 等[1]首次提出,是指利用指数富集的配体进化技术(syste m atic evo l u tion o f li g ands by exponentia l enr i c hm en,t SELEX )从特定的寡核苷酸库中筛选出对目标靶有特异性相互作用的寡核苷酸(DNA 或RNA )。与传统的抗体相比,适配体具有以下特点和优势:(1)对目标靶分子具有与抗体相当甚至更高的亲和性;(2)可以大量、快速的在体外合成,制备方法更为简单快捷;

(3)可以针对不同种类的目标靶进行筛选,包括生物毒性的分子以及只具有半抗原性的分子,拓宽了其应用范围;(4)稳定性优于抗体,利于储存。基于适配体的上述优良特性,其在疾病检测、药物研发、临床治疗、分析化学、蛋白质组学以及基因表达调控机理研究等多个领域都有着良好的应用前景。目前,限制适配体技术应用的瓶颈问题仍是适配体的有效筛选技术。希望通过本篇对现存适配体筛选方法的分析与评述,为进一步解决适配体筛选技术中存在的不足提供参考。

2 适配体筛选的总体策略

适配体筛选主要包括以下步骤:(1)确立筛选方法。根据研究目的确定研究对象,明确所获得适配体应具有的特性,以便以此为依据设计具体的筛选方法;(2)建立筛选文库。根据设计的筛选方法建立用于筛选的具有足够数量和适宜长度的RNA 或DNA 组合文库;(3)实施具体筛选策略。根据确立的筛选方法,利用固定化或自由态的目标靶从RNA 或DNA 组合文库中筛选出符合预期目标的适配体。

在步骤(1)中,首先需要根据适配体的用途确定筛选出的适配体应具有的特性。如用于医疗检测目的,为避免假阳性,要求适配体对疾病标志物具有高度的选择性。在筛选过程中就需要尽可能地排除相似物所带来的干扰。若用于生物物质的分离,为增加普适性,则希望作为亲和配基的适配体对一类结构相似的物质具有较好亲和性,在该过程中需要利用多个相似物的目标靶进行反复筛选。在步骤(2)中,为了使筛选过程中获得的寡核苷酸链能够扩增以便反复筛选,RNA 库或DNA 库中的分子均须在两端加上一定长度的引物。影响筛选效果的因素包括随机区域寡核苷酸的类型、长度以及引物区域核苷酸长度。寡核苷酸的长短不仅直接影响到库容,也影响到构象的多样性。实验证实,长度在20~80个寡核苷酸较适于适配体的筛选。此时,初始筛选库中含有超过1010

种分子,理论上包含寡核苷酸能够形成的全部构象。虽然随着寡核苷酸长度的增加,其构像的丰富程度增加,理论上有利于适配体的筛选,但实际上也不尽然。如一种凝血酶适配体只有15个寡核苷酸,虽然筛选伊始使用的寡核苷酸库的随机第37卷

2009年3月 分析化学(FENX I HUAXU E) 评述与进展Ch i nese Journal o fA na l y tica lChe m istry 第3期454~460

链长为60,但后续研究证实,仅含这15个核苷酸的适配体就能很好的与凝血酶结合,即较短的寡核苷酸库也可以实现适配体的有效筛选[2]。引物部分用于循环过程中的PCR 扩增环节。在一般情况下,两端引物区域总长在40个寡核苷酸左右。但适配体在使用时需除去引物,这往往会影响适配体的空间结构进而影响其选择性;若不加入引物,就无法进行扩增,如何解决这两者之间的矛盾是在适配体筛选过程中研究者所关注的主要问题之一。在步骤(3)中,主要通过多次循环(一般6~20次)获得适配体。每次循环包括寡核苷酸分子同目标靶的结合、结合分子的分离以及分离所得分子的扩增三步。在第一步中,目标靶可以以在固相基质上的固定态或溶液中的自由态与寡核苷酸分子结合,两种方式各有利弊。前者利于后续的分离过程,但会引入一定的非特异性吸附并在一定程度上影响目标靶的构象;后者保持了目标靶的构象却使其与寡核苷酸分离的难度增加。第二步分离效率的高低直接影响筛选的效率,高效的分离方法可以大大降低适配体筛选循环次数。第三步扩增通过PCR 技术实现,分离得到的单链DNA 经PC R 放大,其产物用于下一次循环筛选;而单链RNA 则需首先由RT -PCR 形成相应的c DNA,然后扩增,再通过体外转录获得RNA 进入下一次循环。

在所有的筛选过程结束后,还需要对所获得的适配体进行测序,并进一步优化所得序列以提高其选

择性,优化方法包括某些非关键核苷酸的剔除、修饰核苷酸的引入、利用酵母三杂交系统进行优化[3]等。

从以上的叙述中可以看出,适配体筛选步骤繁琐,工作重复性高,费时费力。因此如何快速获得满足要求的适配体成为研究热点。近年来,一系列对适配体筛选技术的改进方法不断涌现,主要涉及4个方面:(1)提高适配体选择性,进一步增强其在临床检测等领域的优势;(2)增加适配体的普适性,拓宽适配体的应用领域;(3)丰富用于筛选的组合库,从根本上增加获得合乎要求适配体的几率;(4)建立高效、快速的筛选方法,以缩短适配体的筛选周期。下面将对这4方面的具体研究内容进行详细评述。3 适配体的筛选方法

3.1 提高适配体选择性的筛选方法

3.1.1 负筛选 负筛选(negati v e SELEX )是指通过一定手段排除固定化目标靶所使用的基质对筛选的干扰,使获得的适配体仅针对目标分子。具体方法为:将寡核苷酸库流经固定化所使用的基质,将流穿液即仅包含不与基质相作用的寡核苷酸分子的部分与目标靶混合,进行常规的筛选。此方法由E lli n gton 等[4]于1992年最先提出,他们在筛选的第三次循环后使用此方法,扣除对固定化基质有吸附的寡核苷酸分子。同不使用负筛选的过程相比,第四次获得的寡核苷酸亲和性提高了近10倍。这一结果充分证明了负筛选在实际应用中的意义,尤其对于固定化目标靶的筛选过程。

3.1.2 反向筛选 反向筛选(counter SELEX )是以获得专一性更强的适配体为目的而提出的,主要通过排除一部分能够同时与目标靶类似物相作用的寡核苷酸而提高所获得适配体的选择性。其具体操作方法与负筛选类似,将不与目标靶类似物相作用的寡核苷酸与目标靶共同孵育,进行筛选。此方法由

Jen ison 等[5]在筛选茶碱的适配体过程中首先建立,他们以与茶碱结构仅相差一个甲基的咖啡因为反向

靶,通过这种方法获得了可结合茶碱却对咖啡因没有作用的适配体。Ito 等[6]利用反向筛选获得了四碘甲腺原氨酸的适配体,筛选过程中以三碘甲腺原氨酸作为反向靶,并将最终获得的适配体进行荧光标记以用于靶分子的检测。这一筛选方法对于小分子目标靶的筛选极其有利,更易于获得高选择性的适配体。

3.1.3 消减筛选 消减筛选(subtractive SELEX )的目的与反向筛选一致,都是为了提高所获得适配体的选择性,但消减筛选主要针对后面将提到的以复合靶为对象的筛选,扣除对复合靶中非目标部分有吸附的寡核苷酸链。此方法由W ang 等[7]

首先提出,他们利用此方法以未分化的PC12细胞作为消减细

胞,筛选获得了分化PC12细胞的适配体。Shangguan 等[8]通过消减筛选,以CCRF-CE M 细胞(一种人类

急性淋巴细胞白血病细胞系)作为靶细胞,Ra m os 细胞作为消减细胞,进行多次循环,所获得的适配体可以区分人正常骨髓细胞与病变细胞;此适配体能够识别癌症病人临床标本中的与此靶标相关的病变细胞,可用于临床检测。此方法被广泛应用于癌细胞适配体的筛选,所获适配体可用于肿瘤检测与治疗。

3.1.4 光交联筛选 光交联筛选(photo SELEX)是利用光敏感核苷酸在一定波长的光照下,可与其它分子共价交联而产生的一种筛选方法。由于这种方法利用比亲和作用更牢固的共价键进行筛选,因此455第3期王巍等:适配体筛选方法研究进展