cDNA文库的筛选
名词解释cdna文库
CDNA 文库
CDNA 文库是一种 cDNA(互补 DNA) 文库，它包含了生物体中所有基因的 mRNA 转录本的互补 DNA 序列。
在 CDNA 文库中，mRNA 被逆转录成 cDNA，然后被克隆到载体中，最终形成一个包含所有基因信息的文库。
CDNA 文库的构建过程通常包括以下步骤:
1. 从生物组织中提取 mRNA，并去除 rRNA 和 tRNA 等非编码RNA。
2. 将 mRNA 逆转录成 cDNA，使用逆转录酶将 mRNA 转录成cDNA，并在此过程中添加适配体，以产生特定长度的 cDNA 片段。
3. 将 cDNA 片段连接到载体上，通常使用质粒载体。
4. 将连接好的载体转化到大肠杆菌中，并筛选出阳性克隆。
5. 对阳性克隆进行测序和分析，以确定其序列信息。
CDNA 文库在基因组学研究中具有广泛的应用，例如:
1. 基因克隆：通过 CDNA 文库，可以克隆出感兴趣的基因，并对其进行进一步的研究。
2. 基因表达分析：通过比较不同组织或条件下的 CDNA 文库，可以分析基因的表达情况，了解基因在生物体内的功能和调控机制。
3. 基因组测序：通过 CDNA 文库，可以对生物体的基因组进行测序，以确定其基因组序列信息。
cdna基因文库构建的基本路线
cdna基因文库构建的基本路线以cdna基因文库构建的基本路线为标题的文章概述CDNA基因文库是基因组学研究中的一个重要工具，可以用于克隆和表达特定基因。
本文将介绍构建cdna基因文库的基本路线，包括RNA提取、逆转录、cDNA合成、文库构建和筛选等步骤。
第一步：RNA提取构建cdna基因文库的第一步是从所研究的生物样品中提取总RNA。
这可以通过使用商业化的RNA提取试剂盒或经典的酚-氯仿法等方法来实现。
在提取RNA的过程中，需要注意样品的保存和处理，以确保所提取的RNA完整无损。
第二步：逆转录逆转录是将RNA转化为相应的cDNA的过程。
逆转录反应通常使用逆转录酶（Reverse Transcriptase）进行，该酶能够将RNA模板上的信息转录成DNA。
在逆转录反应中，需要加入随机引物、dNTPs和逆转录酶，以及适当的缓冲液。
逆转录反应的温度和时间也需要根据具体的逆转录酶和反应体系进行优化。
第三步：cDNA合成在逆转录反应完成后，需要对产生的cDNA进行纯化。
一种常用的方法是通过酶切和连接反应，将cDNA连接到载体上，形成重组DNA，再通过转化等方法将其导入到大肠杆菌等宿主中。
在cDNA 合成的过程中，需要注意对cDNA的纯化和测序质量的控制，以确保所获得的cDNA具有高质量和完整性。
第四步：文库构建文库构建是指将cDNA插入到合适的载体中，形成cdna基因文库。
常用的载体包括质粒和噬菌体等。
在文库构建的过程中，需要对cDNA和载体进行受限酶切，然后使用DNA连接酶将其连接起来。
连接后的DNA需要进行转化，将其导入到适当的宿主细胞中，形成文库。
不同的文库构建方法有所差异，可以根据实验需求选择合适的方法。
第五步：筛选构建cdna基因文库后，需要对文库进行筛选，以寻找感兴趣的基因。
常用的筛选方法包括杂交筛选、PCR筛选和基于功能的筛选等。
根据所研究的基因或表达产物的特性，可以选择合适的筛选方法。
筛选后的阳性克隆可以进一步进行测序和鉴定，以确认所克隆的基因的准确性和完整性。
cdna基因文库构建的基本路线
cdna基因文库构建的基本路线CDNA基因文库构建是一种常用的分子生物学技术，用于研究基因表达和功能的调查。
本文将介绍CDNA基因文库构建的基本路线，包括材料准备、RNA提取、反转录、合成cDNA、构建文库和筛选等步骤。
一、材料准备进行CDNA基因文库构建之前，需要准备一些实验材料和试剂。
主要包括：1. 细胞或组织样品：可以是人类、动物或植物的细胞或组织样品。
2. 细胞破碎液：用于细胞破碎和RNA保护，常用的有三种类型：TRIzol、RNeasy Mini Kit和RNAiso Plus。
3. 反转录试剂盒：包括反转录酶、随机引物、dNTPs等。
4. 克隆载体：用于构建基因文库的载体，常用的有质粒载体和噬菌体载体。
5. 细菌培养基和抗生素：用于细菌的培养和筛选。
二、RNA提取RNA提取是构建CDNA基因文库的第一步，目的是从细胞或组织样品中提取总RNA。
常用的提取方法有酚/氯仿法、硅胶膜法和磁珠法等。
提取的RNA应具有较高的纯度和完整性，以保证后续的反转录和文库构建质量。
三、反转录反转录是将提取的RNA转录成cDNA的过程。
在这一步中，需要将RNA模板与反转录酶、随机引物、dNTPs等反转录试剂一起反应，合成cDNA。
反转录的条件包括温度、时间和反应体系等，需要根据试剂盒的说明进行操作。
四、合成cDNA合成cDNA是将反转录得到的第一链cDNA转录成双链cDNA的过程。
一般采用PCR扩增的方法，在反应中加入适量的引物和dNTPs，进行多轮扩增，最终得到足够量的双链cDNA。
合成cDNA的条件包括PCR扩增的循环数、温度和时间等。
五、构建文库构建基因文库是将合成的cDNA插入到克隆载体中的过程。
常用的构建方法有限制性内切酶法、T/A克隆法和引物扩增法等。
在构建文库的过程中，需要将双链cDNA与克隆载体进行连接，形成重组DNA。
连接后的重组DNA可以通过转化到适当的宿主细胞中，得到大量的重组质粒。
六、筛选构建完基因文库后，需要进行筛选以获得感兴趣的基因。
噬菌体cDNA文库
噬菌体cDNA文库cDNA文库（complementary DNA library）以组织中的mRNA 为模板，反转录合成双链cDNA，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。
这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。
代表特定细胞或组织中mRNA的文库。
cDNA文库是在基因组水平上研究某一生物特定器官、特定组织、特定的发育时期基因表达的前提和基础。
传统的筛库方法是将克隆高密度影印到尼龙膜上进行菌落原位杂交筛选。
此方法工作量大，而且必须使用放射性同位素。
现如今，作为大容量文库（≥108克隆）中选择特异的结合肽或蛋白的强大工具，噬菌体展示技术的到来位cDNA克隆基因表达提供了发展的机会。
一．cDNA文库的优点1. 使遗传物质为RNA病毒可建立文库；2. 因克隆数比基因组文库少得多，易于筛选；3. 从分化特异的细胞的cDNA文库中可分离到特异表达的基因。
4. 建库时已排除了其他的RNA，使假阳性率降低。
5. cDNA文库可在细菌中表达，可用多种策略进行筛选。
二．cDNA文库和基因组文库的区别时效性代表某一时期特定细胞或组织中mRNA的转录水平，仅反映某一时期特定组织表达的功能基因，不是全部基因。
包含该生物所有基因序列组成不同无间隔序列和调控区等非编码区可显示基因组的全部结构信息，由于制备DNA片段的切点是随机的，所以每一个克隆内所含的DNA片段既可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的临近DNA序列。
如何选择在分离植物RNA、病毒基因、研究植物功能蛋白序列、分离植物特定发育阶段或特异表达的基因时应用cDNA文库研究mRNA不存在的序列及基因组做图时必须构建基因组文库三．用于噬菌体cDNA文库展示的载体1. 丝状噬菌体因为全长cDNA包含在3’末端的翻译终止子，原核表达时缺乏合适的核糖体结合位点（若该cDNA来源于真核细胞），确保cDNA在噬菌体表达的最实际的方法是将5’末端与载体基因融合。
cdna文库名词解释生物化学
cdna文库名词解释生物化学CDNA文库是一种用于研究基因表达的工具。
在生物化学中，DNA 是一个含有遗传信息的分子，它在细胞中起到存储和传递遗传信息的重要作用。
在细胞内，DNA通过转录过程被转录成RNA，然后RNA会被翻译成蛋白质。
CDNA文库是由合成的互补DNA（cDNA）序列构建而成。
cDNA是通过逆转录过程合成的DNA分子，使用反转录酶将mRNA作为模板，合成出与其互补的DNA复制物。
cDNA具有与原始mRNA相同的序列，可以反映出在细胞中真实的基因表达水平。
建立CDNA文库的过程首先需要提取细胞或组织的总RNA。
然后，通过逆转录反应将mRNA转录成cDNA。
逆转录反应需要用到逆转录酶和引物，引物可以是随机引物或特定基因的引物。
随机引物能够合成出覆盖整个转录物的cDNA，而特定基因的引物则能够合成出该基因的cDNA。
反应完成后，RNA模板会被降解，并使用DNA聚合酶对合成的cDNA进行二次扩增。
最后，将合成的cDNA插入到载体DNA中，形成一个完整的CDNA文库。
CDNA文库的建立可以帮助研究者探索和研究细胞或组织中的基因表达水平。
通过建立CDNA文库，研究者可以在一定程度上了解到在特定条件下细胞中哪些基因被表达，或者在不同组织中基因表达的差异性。
此外，CDNA文库还可以用于筛选与某些特定生物过程或疾病相关的基因，从而帮助研究者理解这些生物过程或疾病的发生机制。
在CDNA文库的应用中，常用的技术是杂交筛选。
杂交筛选是一种用于寻找与特定基因相关的cDNA或DNA序列的方法。
在杂交筛选中，使用已知的探针（通常是标记有示踪物的特定基因的DNA序列）与CDNA文库进行杂交反应。
通过特定条件的洗涤步骤，能够将与探针相互匹配的DNA序列筛选出来。
这些DNA序列可以进一步研究，以了解它们的功能和与之相关的生物过程。
CDNA文库在生物化学研究中发挥了重要的作用。
它可以帮助科学家研究基因表达的调控机制、细胞分化和发育过程中的基因表达差异以及疾病发生机制。
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选
(3) 引导合成法
Okayama-Berg方法
（4）引物-衔接头合成法
4、双链 cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入 大肠杆菌中繁殖的分子克隆
1.同聚100dA/dT, 20dG/dC) • 同聚尾结合的质粒： cDNA杂合分子转化 E.coli的效率随宿主不 同而不同。
该法聪明地利用了反转录过程中用接头锚定的方法， 与传统法相比，全长cDNA的比例得到大幅提高
2. G
1. 抑制性扣除杂交 suppression subtractive hybridization, SSH
含目的基因的cDNA：供体 tester 不含目的基因的cDNA：驱动 driver
• RsaI消化tester和driver • 将tester一分为二，分别加上接头1和接头2R • 第一轮杂交中，用过量的driver cDNA分别与带两种 接头的tester cDNA杂交 • 第二轮杂交中，将第一轮杂交的两个体系混合，再 加入过量的driver cDNA • 补平第二轮杂交产物的末端，进行两轮PCR扩增 • 巢式引物进行第二轮PCR扩增，富集差异表达基因 • T/A克length cDN因： • cDNA第二链合成工程中聚合酶的外切酶活性； • mRNA降解； • 反转录酶合成特性，从转录复合体上anism at 5' end of RNA • 指导合成高分子量蛋白质的能力 无细胞翻译体系（源于网织红细胞） 哺乳动物总mRNA可编码 10～100kDa蛋白
cDNA文库
真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。采用电 泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要 困难。
麦胚系统用组织捣碎机将麦子捣碎，分离出麦胚，然后将粗制的麦胚加10倍体积的缓冲液与砂子共研磨。g 离心所得的上清夜称为S23；将S23分装，保存于-20°C冰箱中。
利用麦胚系统进行蛋白质翻译合成研究时，需加的物质与织红细胞系统相似。由于该体系无mRNA，所以必须 加入mRNA。
1．高丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%，该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特 定mRNA。 2．低丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下。
随机引物引导的cDNA合成法（randomly primed cDNA synthesis）：
根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。 在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3'-末端的oligo （dT）引物一处开始。
目的基因的分离
外源基因： 插入到载体内的那个特定的片段基因。 目的基因： 那些已被或者准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段。
载体制备
1．pBlueScriptII的提取
1．取1ul商品的pBlueScriptII，转化入大肠杆菌宿主菌中，取5ul转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上， 37℃培养过夜。
典型的哺乳动物细胞含有10,000-30,000种不同的mRNA分子，某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至n（1-1/n） N：所需克隆数；P：要求的概率；n：一种mRNA在总mRNA中的相对比例 （1）按大小对mRNA进行分级分离 通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子，该方法的分离效果最好，但从凝胶中回收的得率较低。 蔗糖梯度离心：加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等，再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量 的mRNA。 （2）cDNA的分级分离
构建cDNA文库寻找与
• 2010年，为进一步研究红曲茵桔霉素合成 相关基因，王金昌等选用Sau3AI酶进行部 分消化红曲茵基因组DNA，再回收2-4 Kb 片段进行克隆，以pUC119为栽体，得到20 000多隆子。构建cDA寻找与桔霉 素合成相关的基因•
如前所述,不同的发酵条件，发酵阶段对 桔霉素的合成有很大的影响，这说明桔霉 素含量的变化可能是红曲菌中产桔霉素相 关基因差异表达的结果。因此,可以从分子 生物学水平出发， 通过差异基因的筛选， 找出与红曲菌产桔霉素相关的基因。
• 2003年和2005年，赖卫华等应用抑制性消 减杂交（suppression subtractive hybridization, SS段进行比对，获得了８组同 源的 cDNA片段， 它们可能与红曲菌产桔 霉素密切相关。
该研究小组还以培养 13d的Monascus aurantiacu为材料建立基因表达系列分析文 库，从89个阳性克隆中获得 901个表达标 签， 代表了686个独立的基因，其中有６个 独立的标签代表高表达的基因片段（每个 细胞该标签的拷贝数≥10）这些基因很有可 能参与了桔霉素的合成。
• 2009年，吴伟，王燕萍通, 比对分类后进一步发 现P 5为其中丰度最高的基因,也就证明P 5 与桔霉素的合成相关性最大。
cDNA文库的构建策略及其应用
cDNA文库的构建策略及其应用cDNA文库是一种重要的生物资源，可用于研究基因的表达、结构和功能，以及发现新药靶等。
因此，构建高质量的cDNA文库是生物科学研究中的一项关键任务。
下面将介绍构建cDNA文库的策略及其应用。
构建高质量的cDNA文库是首要任务。
在进行构建之前，需要对实验材料进行严格的筛选和处理，以确保获得的cDNA质量高、重复性高且覆盖面广。
同时，需要根据研究目的选择适当的筛选方法，如杂交筛选、PCR筛选等，以获得所需基因的阳性克隆。
插入片段的大小是影响cDNA文库质量的重要因素之一。
为了获得完整的编码序列，需要优化插入片段的大小。
一般来说，插入片段的大小在5-0 kb之间为最佳，这有助于确保获得完整的功能基因序列。
高效的载体和筛选系统对于构建高质量的cDNA文库同样至关重要。
在选择载体时，需要考虑其容量、复制特性、稳定性等方面，以确保获得的文库具有较高的拷贝数和稳定性。
在筛选系统方面，需要选择灵敏度高、特异性强的筛选方法，以获得阳性克隆并降低假阳性率。
在构建cDNA文库的过程中，需要对其质量进行严格控制。
一般来说，需要进行以下质量控制：检测cDNA的质量和大小、评估文库的随机性、检测重组子的稳定性等。
通过这些质量控制步骤，可以确保获得的cDNA文库质量可靠。
通过比较不同条件下细胞或组织中的cDNA文库，可以研究特定基因在不同条件下的表达情况。
利用基因表达谱技术，可以对表达差异进行定量分析，揭示基因的表达调控机制。
通过对cDNA文库进行高通量筛选，可以发现新的药物作用靶点。
这些靶点可能是新的基因或新的基因变异体，也可能是已知基因的新功能域。
通过研究这些靶点的结构和功能，可以设计和开发新的药物。
通过将正常的cDNA导入病变细胞，可以治疗某些遗传性疾病或癌症。
例如，导入能够表达正常血红蛋白的cDNA可以治疗地中海贫血；导入能够表达抗癌药物的cDNA可以治疗癌症。
这些基因治疗方法需要构建特定的cDNA文库，以便找到适合的治疗方案。
基因组文库、cDNA文库的构建和筛选
示差筛)
• 扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cD)得以实现的。
• 差别杂交对于因特殊处理而被诱发产生的mRNA 之cDNA克隆的分离，或是在细胞中具高表达效 率的mRNA之cDNA克隆的分离，无疑是一种有 效的方法，但对于低丰度的mRNA之cDNA克隆 的分离则有相当的困难。为了进一步提高差别杂 交的筛选效率，一种切实可行
点，因此可用 P2 噬菌体的溶源性大肠杆菌进行 Spi 筛选重组体。在填充片段两端带有对称的多 克隆位点。
载体
• 质粒载体—用于基因组较小的生黏粒—45kb 细菌人工染色体（BAC）—350kb 酵母人工染色序列• 具有代表性的基因应该在最大限度上 覆盖所有的原初序列。
• 合适的酶切片段可由琼脂糖凝胶电泳
质粒载体
蓝白筛选
YAC载体
置换型载体
• 允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段 的载体，称为置换型载体（replacement vectors）。一般情况下，置换型载体克隆 外源片段的大小范围是 9-2cDNA内部， 在添加接头前先用EcoRⅠ甲基化酶甲基化。
• 最后用T4DNA连接酶连接。
cDNA末端的处理
• 末端转移酶—可以向cDNA末端加上与克隆 载体末端互补的尾部
末端转移酶 末端转移酶
与载体的连接
• 载体先用碱性磷酸酶去磷酸化以防止载体 自连接。
• T4DNA连接酶连接载体与c龙膜 上；膜上的DNA在碱性 条件下变性，解聚形成 单链；再通过烤膜或紫 外线照射，单链将与膜 紧密结合；再将膜置于 含有放射性标记的核酸 探针的溶液中保温，使 探针与其互补序列进行 杂交；杂交后充分洗去 未杂交的探针，然后可 由放射性自显影鉴定。
（1原）位原位杂杂交交筛筛选选
cDNA文库制备ppt课件
3）器官特异性 有的结构基因的表达就有器官特异性 ，故由同代谢阶段（或发育阶段）的结 适用于RNA病毒的基因组结构研究。 2）出现假阳性的概率较低。 3）有效地分析间断基因的结构。 4）发育过程中时间调节基因及组织特异广的分级分离法， 可以方便快速地去除小于500bp的分子。
五、cDNA克隆载体
cDNA克隆载体有两种，噬菌体类载 体和 插入片断的装载容量大，适合与全长 cDNA的克隆。 此类载体可表达。
接上人工接头
粘性末端 末端转移酶CCC
CCC
同聚物加连接效率非常有限， 会导致部分信息的丢失，再加上需要多次用不 同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化 ，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中 的低丰度信息，很大程度上会影响结果的正确 性。另外由于mRNA容易部分降解，很难确定 得到的cDNA是全长的cDNA，还是链合成
cDNA第二链的合成：将上一步形成的mRNA -cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。 常用方法：
①自身引导合成法；
②置换合成法；
自身引导法合成cDNA第二链
置换合成法合成cDNA第二链
四、双链cDNA的分级分离
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
双链cDNA在与载体 连接之前最好经过cDNA分级分离，回收大于5 00bp的cDNA用于连接。
一、mRNA的分离纯化
总RNA中绝大多数是rRNA和tRNA， mRNA只占总RNA的1%-5%。 原理：利用mRNA的polyA尾巴，将 mRNA从总RNA中分离纯化。 目前常用的mRNA的纯化方法有： （1）寡聚（dT）－纤维素柱层析法 （2）寡聚（dT）－纤维素液相离心法 （3）寡聚（dT）－磁性球珠法
寡聚（dT）－纤 维素柱层析
二、cDNA的第一链合成 由mRNA到cDNA的过程称为反转录，由反转录 酶催化。 反转录酶 常用的反转录酶有2种： 1）AMV（禽成髓细胞癌病毒） 2）M-MLV（Moloey鼠白血病病毒） 都是依赖于RNA的DNA聚合酶，有 5’→3’DNA聚合酶活性。前者最适温度为 42℃，后者为37℃。
cDNA文库制备
cDN A li b rary con st ru ct io n Virt u a l N ort h ern b o lt s
C DN A li b rary In λ Trip IEx 2
PC R- S elect cDN A su b t高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总mRNA的22% 中等丰度mRNA：200-300个拷贝，占总mRNA的 49% 低丰度mRNA：1-15个拷贝，占总mR广的分级分离法， 可以方便快速地去除小于500bp的分子。
五、cDNA克隆载体
cDNA克隆载体有两种，噬菌体类载 体和是插入片断的装载容量大，适合与全 长cDNA的克隆。 此类载体可表达。
反转录引物
1、Oligo dT引物
一般包括15－30 个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀
有酶切位点的寡核苷酸片段。
3’ 5’ 引物
2、随机引物
cDNA
mRNA
反转录酶
5’
采用6－10个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定m
RNA并作为反转物。
3）器官特异性 有的结构基因的表达就有器官特异性 ，故由同代谢阶段（或发育阶段）的结 适用于RNA病毒的基因组结构研究。 2）出现假阳性的概率较低。 3）有效地分析间断基因的结构。 4）发育过程中时间调节基因及组织特异中期供构建分子标记连锁图谱的所用探 针，更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因 功能研究。因此，cDNA在研究具体某类特定细胞中基 因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊 的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期 调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有 更为广泛的层出不穷， 相信cDNA定能更加迅速、高效满足研究的需要。
Amplif y cDNA by L D P C R
CDNA文库
oligo(dT)引导的DNA合成法: 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链. 缺 陷: 因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦. 随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) : 根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始.
以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因特异表达NA。 真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难. 高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都尽有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多.
编辑本段双链cDNA分子的克隆
将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上,转化大肠杆菌寄主细胞增殖. 1,同聚物加尾法 利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3'-端都加上一个互补的同聚片段,通过退火使两个片段连接成重组质粒,再将重组质粒转化受体细胞. 同聚物加尾法克隆双链cDNA 2,接头-衔接头法 3,mRNA-cDNA克隆法 方 法: 在mRNA反转录合成cDNA第一链后,将dA残基加到mRNA:cDNA杂交体上,然后与带dT尾的克隆载体连接,转化受体细胞,在宿主细胞内,mRNA被降解并代之以DNA. 缺 点: 克隆的效率低(为双链cDNA克隆的1/10) 4,Okayama-Berg法合成并克隆双链cDNA
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CDNA文库筛选2007-12-23 01:15:00| 分类：分子生物学方法| 标签：|字号大中小订阅（一）λgt11 cDNA文库铺平板宿主细菌制备1．用一个E.coli宿主菌株单菌落分别接种2×5ml LB培养基（Y1088用于噬菌斑杂交，Y1090用于免疫筛选），于37℃振荡培养过夜。
2．将过夜培养物以3000×g离心5min。
3．分别用2ml λ-dil（10 mmol/L tris-Cl,pH7.5; 10 mmol/L MgSO4; 高压灭菌）重悬细胞沉淀。
4．细胞悬液可用于4℃贮存至一周。
预制噬菌体悬液铺平板以已知滴度（如，已知每ml噬菌体颗粒数）的cDNA文库或其他噬菌体悬液开始，用λ－dil稀释以达到所需每平板噬菌体数。
每个90mm直径平皿5×103个噬菌体/100μl开始筛选。
铺平板1．将所需数量的LB平板置42℃温箱预热。
2．LB顶层琼脂（每平板最少2.5ml）用微波炉熔化，然后置49℃水浴中。
3．为温箱内的每一个平板准备一个12ml带螺旋盖试管，于室温，放在合适的架子上。
4．用移液器每管加100μlλ－dil稀释的宿主细胞悬液。
5．每管加100μl稀释的噬菌体悬液与细菌于漩涡器上简短混合。
6．含细菌和噬菌体（感染混合物）的试管于37℃温育25min，然后室温放置。
7．用一支消毒的10ml玻璃移液管在本生灯火焰上稍稍预热，取2.5ml保存在49℃的熔化顶层琼脂加到一支含感染混合物的试管内。
8．立即在手掌之间滚动混合管内混合物，然后均匀地倒入一个预热的LB平板上。
9．倒好的平板于室温置水平面上直至顶层琼脂凝固（至少5min）。
10．重复步骤7至9，直至所有的细菌和噬菌体混合物都铺平板。
11．平板置42℃温箱（对λgt11）直至噬菌斑长出。
（二）杂交筛选——cDNA序列作为探针1．如上述将文库铺平板，噬菌斑杂交实验用E.coli宿主菌株Y1088。
2．噬菌斑于42℃生长过夜。
3．从温箱取出平板，置4℃冷却至少1h。
4．膜剥离：首先，用软铅笔在干的硝酸纤维素滤膜上给准备影印的平板编号。
其次，从平板的中央开始向边缘小心将滤膜铺在菌台上。
当滤膜完全变湿后（颜色变灰），再等30s。
同时，用针头在平板上标出滤膜的3个不对称位置。
小心将滤膜从平板上剥离，接触面向上放在一张干净的Whatman 3MM滤纸上。
在进行下一步骤之前，所有的平板重复步骤4。
5．将滤膜接触面向上漂浮在变性液（0.5 mol/L NaOH; 1.5 mol/L NaCl）中5min。
6．中和5min。
7．用2×SSC洗涤5min。
8．将滤膜放在一张新的Whatman 3MM滤纸上，用铅箔将滤膜和滤纸一起包住。
9．在真空炉中80℃烘烤2h。
10．用6×SSC预先短暂地湿润滤膜，然后用预洗液（50 mmol/L Tris-Cl pH8.0; 1mol/L NaCl; 1mmol/L EDTA; 0.1% SDS）于68℃预洗涤至少1h。
用一个盘子放在水浴摇床上。
11．将25张滤膜转移到一个装有50ml杂交液（5×SSPE；1×Denhardt’s液；100μg/ml cT-DNA；0.1％SDS）的贮存罐内（直径至少90mm），68℃预杂交2h。
12．对于每ml杂交液，2倍的105至1×106cpm的双链探针经沸水浴变性10min后，迅速放冰上冷却。
13．变性探针立即加到预杂交混合液中。
14．在封口的贮存罐内于68℃杂交过夜，不断地晃动以防滤膜粘在一起。
15．杂交结束后，滤膜用2×SSC，0.01％SDS于室温洗涤3次约1h。
16．将潮湿（防止干燥）的硝酸纤维素滤膜放在一张硬纸或X光片上，用放射性墨水在针头标签上作标记。
17．滤膜用塑料包装袋（如Saran）包住，然后加上增感屏在X光片上于－70℃曝光过夜。
（三）免疫筛选制备Sepharose偶联细菌裂解液1．各用一个E.coli温度敏感溶源菌株（BTA 282（λgt11amp3）或BNN 97）单菌落接种于2×7.5ml培养基并于32℃生长过夜。
2．过夜培养物用LB培养基稀释100倍，于32℃生长至OD600值为0.5。
3．于45℃温育15min诱导噬菌体表达。
4．培养物于39℃进一步培养约2h。
5．测定噬菌体含量以便收集，氯仿测定操作步骤：3滴氯仿加到1ml培养物测试样品中，混合物于37℃温育。
另一份不加氯仿的培养物作为平行对照。
温育5min后，测试样品与对照比较。
如果添加氯仿的测试细胞悬液清澈透明，细菌完全被吸附，刚好开始裂解，此时已可收集培养物。
6．于4℃以4000×g离心10min收获细菌。
7．从开始的两份7.5ml培养物离心得到的细胞沉淀用冷的偶联缓冲液重悬并再次离心。
8．各用5ml冷的偶联缓冲液重悬细胞沉淀。
9．超声波处理细胞悬液，直到粘度增加至不再释放出核酸。
10．将细菌裂解物偶联到预先制备好的溴化氰活化Sepharose 4B于4℃过夜。
11．以3000×g离心5min回收偶联物。
12．用偶联缓冲液重悬沉淀并再次离心。
13．为了饱和溴化氰活化Sepharose的未结合反应基团，沉淀物用冷（4℃）的饱和缓冲液重悬并在旋转轮上于4℃温育1h。
14．通过三次连续的洗涤除去未吸附蛋白质，开始用洗涤缓冲液（pH4.0）；然后转换至pH8.0；最后一次洗涤pH为4.0，在这个处理前后和每次洗涤之间，在4℃，2500×g离心5min，收集材料。
15．Sepharose偶联细菌裂解液可以PBS悬液（＋0.01％硫柳贡）于4℃贮存几个星期。
用于筛选的抗体预吸附1．浓度为0.5至1 mg/ml未稀释的第一抗体和第二抗体（如过氧化物酶偶联羊抗兔抗体，Calbiochem公司）分别用1.7倍体积的Sepharose偶联细菌裂解液混合，并在旋转轮子上于4℃温育过夜。
每次筛选循环约需要300μl已处理的第一抗体（最终工作稀释度为1：100）和15μl已处理的第二抗体（最终工作稀释度为1：2000）。
2．悬液加到少量玻璃棉填充的加样器吸头内。
未封闭抗体用冷冻封闭液（至少5倍于柱体积）洗脱。
3．用冷的封闭液调节洗脱出的抗体浓度至原先浓度的1/20。
加入硫柳汞（终浓度0.01％）。
铺平板1．如上所述铺制平板，作如下修改：a. 另外一支含2.5ml顶层琼脂的12ml带螺旋盖试管置49℃水浴中以铺制诱导对照平板。
b. 在一份感染混合物中，用100μl噬菌体悬液含已知百分比的具有完整β-半乳糖苷酶基因的野生型噬菌体作为诱导对照。
c. 在加相应感染混合物前，为铺制诱导对照平板20μl X-gal立即加到2.5ml顶层琼脂中。
2．于42℃温育3～4h（用E.coli Y1090）直至噬菌斑可见。
3．将平板移到层流橱内，用IPTG浸泡过的硝酸纤维素滤膜覆盖在上面以诱导噬菌体lacZ基因表达。
对每个平皿，用软铅笔在干的硝酸纤维素滤膜上编号，然后在平皿内用IPTG溶液浸泡。
排去平皿边缘多余的液体，然后从平板的中央开始往边缘小心地将滤膜放在长有细菌的平板上。
滤膜总是用平头镊子操作。
4．于37℃温箱倒置培养过夜。
5．诱导对照平板上的某些噬菌斑过夜培养后，由于完整的β-半乳糖苷酶表达将变成蓝色，表明IPTG诱导成功。
6．从平板上剥离滤膜前，应该用针头在滤膜上标出3个不对称位置。
7．然后小心地从平板上剥离滤膜，接触面向上放在Whatman 3MM滤纸上，直至所有的滤膜揭下。
免疫学染色1．为了洗去顶层琼脂上的残余物和细胞碎片，将硝酸纤维素滤膜一次最多5张转移放在摇床上的盘子（10×10cm）内，用25ml TBS室温洗涤10 min 2次。
2．然后滤膜用25ml封闭缓冲液（每张90mm直径的滤膜至少15ml）于室温温育30min，以封闭滤膜上的非特异性结合位点。
不断晃动以防滤膜互相粘在一起。
3．每张滤膜置佩特里平皿中，各用3ml含预吸附第一抗体的封闭缓冲液温育。
多克隆第一抗体的经典工作稀释度为1：100。
抗体的这种工作稀释度可以重复使用到5次并于4℃保存。
室温下用第一抗体温育至少2h。
为了确保滤膜仍然完全浸泡在抗体溶液中，温育过程中，将平皿放在摇动平台上。
4．室温下用25ml TBT洗膜3次，每次10min，并不断摇动以除去未结合第一抗体。
5．本步骤操作同步骤3。
3ml封闭缓冲液内预吸附第二抗体的工作稀释度通常为1：2000（如过氧化物酶偶联羊抗兔抗体，Calbiochem公司）。
第二抗体工作溶液使用不得超过一次。
第二次使用后，第二抗体工作溶液的吸附能力似乎耗尽，经常导致阳性信号的突然丢失。
6．用25ml TBS于室温下摇动洗膜3次，每次10min以除去未结合的第二抗体。
7．在一个塑料盘内，45ml冷（4℃）的酶反应缓冲液与5ml冷（－20℃）的氯萘酚和50μl H2O2混合。
将滤膜一次最多5张放在显影液内并缓慢搅动。
几分钟内阳性噬菌斑显示出紫红色。
8．如果用Polaroid摄影术（665型胶卷，光圈4.5，快门速度1/15，橙色滤光片）记录结果，将硝酸纤维素膜放在曝光箱内。
9．为了有助于挑取阳性菌体斑，在拍照的透明胶片上用针头做相应的标记。
噬菌斑纯化1．用一支消毒的钝头巴斯德吸管刺入对应于阳性菌体斑位置的顶层琼脂，通常很容易从平板上取下薄的环状顶层琼脂并用0.5ml λ-dil重悬于一支Eppendorf管内。
2．挑取的噬菌斑所含的噬菌体颗粒通过剧烈的旋涡振荡至少1h，从顶层琼脂释出，在再次铺平板前，新制备的噬菌体悬液置室温下至少1h。
>3．在10－3至10－5范围内稀释的噬菌体悬液重悬筛选阳性信号。
4．重复步骤1至3，直到从一个原始噬菌体感染在顶层琼脂上挑取一个阳性噬菌斑为止。
噬菌体增殖1．为了获取高滴度的均一噬菌体悬液，每个噬菌斑噬菌体悬液取150μl至250μl，加入E.coli Y1088铺平板以便扩增。
2．于42℃过夜培养后，每噬菌体克隆的一个平板裂解物用7ml λ-dil覆盖，于室温持续摇动5h提取噬菌体颗粒。
3．用一支消毒的10ml移液管吸取含噬菌体的上清液，小心避免细胞碎片。
加入几滴氯仿，上清液可作为噬菌体贮存液于4℃无限期保存。
4．每毫升悬液噬菌体原种滴度应在109～1010噬菌体颗粒范围内。
如果噬菌体原种未包含足够的噬菌体，重复步骤1～3，直至达到足够的噬菌体滴度为止。
5．必须通过对高度稀释的噬菌体原种（最多几百个噬菌体）再次铺平板测试噬菌体原种的均一性，并用探针重新筛选。
至少99％的测试的噬菌体是阳性才能认定测试的噬菌体原种是“均一的”。
（四）噬菌体颗粒纯化，DNA分离和亚克隆1．准备10个LB平板，用E.coli Y1088铺平板，每个平板至少105个噬菌体。