植物组织中过氧化物酶活性的测定

实验四植物组织中过氧化物酶活性的测定

一、实验目的：

1、学习测定植物组织中过氧化物酶活性的方法。

二、实验原理：

过氧化物酶（POD）广泛存在于植物体中，该酶催化H2O2氧化，以清除H2O2对细胞生物功能分子的破坏作用。在有H2O2存在的条件下，过氧化物酶使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测定470nm处茶褐色物质的生成量以检测POD活性。

三、实验仪器及材料：

1、仪器：研钵、剪刀、天平、量筒、试管、分光光度计、移液管、比色皿、离心机、秒表

2、材料与试剂：苹果、经逆境处理的绿豆幼苗、反应混合液、20mmol/LKH2PO4

四、实验步骤：

1、POD的提取

分别称取绿豆幼苗、苹果果肉各2g,分别加入预冷的10ml 20mmol/LKH2PO4，于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心10min，收集上清液，待用。

2、POD活性的测定

取分光光度计比色杯2只，在其中一只加入3ml反应混合液和1ml KH2PO4作为对照；另一只加入3ml反应混合液，1ml苹果上清液，立即开启秒表计时，测定470nm处OD值，每隔30s读数一次。

取1ml绿豆幼苗上清液重复上述操作。

五、实验结果：

1、在酶液中加入3ml反应混合液后，苹果酶液立即呈茶褐色，而绿豆幼苗酶液的茶褐色深至黑褐色。

2、苹果酶液以及绿豆幼苗酶液在470nm处OD值如下：

苹果酶液OD值与时间的关系曲线图

以每分钟光密度（OD470nm）变化0.01为一个过氧化物酶活力单位，即：

苹果POD活性=[ΔOD470/(0.01×wt)] ×D

=[（0.28－0.249）/（0.01×3×2）] ×D=0.52D

（此值忽略稀释倍数）

其中w为样品鲜重，t为反应时间，D为稀释倍数

绿豆幼苗酶液OD值与时间的关系曲线图

绿豆幼苗POD活性=[ΔOD470/(0.01×wt)] ×D

=[（0.940－1.56）/（0.01×3·2）] ×D =6.3 D

（此值忽略与苹果酶液相同的稀释倍数）

由于绿豆幼苗酶液浓度较大，测OD值前稀释了两倍，所以绿豆幼苗酶液POD 活性为12.67D

六、结果分析：

1、由苹果酶液OD值与时间的关系曲线图中，OD值与时间的关系基本呈线性关系，故任取变化较均匀的一段数据均可计算出POD活性。

2、由于仪器较少，等待测OD值的时间较长，且没有放在低温下保持，导致酶活性的测定结果出现一定的偏差。

3、通过计算可知，经过逆境处理的绿豆幼苗POD值远远大于苹果的POD值，说明绿豆幼苗的过氧化氢酶活性比苹果的要大，原因是逆境处理的绿豆幼苗含较多H2O2，生成较多过氧化氢酶以清除H2O2对细胞生物功能分子的破坏作用。

4、理论上OD值与时间的关系曲线应为抛物线，但实际测出来的曲线大体为线性关系，可能原因有：①把酶液加入到3ml反应混合液时，反应太快，待到30s读取OD值时，反应已经过了指数增长期，处于缓慢增长状态。②绿豆幼苗酶液浓度值偏高。③离心出来的酶液在室温下放置时间过长。

七、结果分析实验思考题：

1、计算各植物材料的POD酶活性的大小。

苹果POD活性为0.52D ，绿豆幼苗的POD活性为12.67D

2、测定本酶活力需要控制哪些条件？

（1）保持待测材料的酶活，如放在低温下保存；

（2）测定时注意控制反应时间，酶液与3ml反应混合液混合后，尽量快速开始测定OD值，以及控制读数的时间间隔；

（3）使酶处于最适Ph下。