生物质谱 有机化合物结构鉴定与有机波普学课件

生物质谱

早期有机质谱主要用于测定普通的有机小分子，对多肽、蛋白质及其他生物大分子难测定。

因：1．分子量太大

2．气化高温分解。

80年代后，发明了快原子轰击电离（FAB），电喷雾电离（ESI）和基质辅助激光解吸电离（MALDI）。生物大分子可转变成气相离子。产生了生物质谱。

Biomass Spectrometry

有机质谱及其联用技术在生物医药学中的应用

快原子轰击电离（FAB）

1981原理：在进样探头放样品，溶于底物（甘油或硫化甘油），惰性气体（Ar）电离后，加速，使之具有较高的动能，在原子枪(atom gun)内进行电荷

交换反应：

Ar+（高动能的）+ Ar（热运动的）→Ar（高动能的）+ Ar+（热运动的）

高动能的Ar原子束再轰击样品分子使其离子化，样品离子进入质谱。

适用于难汽化,极性强的大分子。

注意：FAB质谱图中会出现基质分子产生的相应的峰及基质分子与样

品分子的结合峰。

电喷雾电离（ESI）

1984用于质谱

原理：样品溶液从毛细管出，电场、气流使成雾状带电液滴，蒸发，

液滴变小，离子从液滴出来，通过锥孔，透镜进质谱仪。

20世纪90年代中期，ESI出现纳喷雾离子源（nanoelectrospray ionization source）,纳升流速，分析灵敏度提高，且少至0.5uL的样品溶液可得到30min稳

定喷雾，有充分机会进行质谱参数优化和许多串联质谱分析。

基质辅助激光解吸电离（MALDI）

MALDI可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。

1988原理：混合物（样品加基质）真空下受激光照，基质分子能有效的吸收激光的能量，成基质离子，碰撞样品，使样品分子解吸附进入气相并得

到电离，进质谱仪。

MALDI适用于生物大分子，如肽类，核酸类化合物。可得到分子离子

峰，无明显碎片峰。

1995Hillenkamp 用MALDI-TOF 测定短杆菌肽S合成酶，分子量为

512000u

R. Nelson 用MALDI-TOF测定单克隆人体免疫球蛋白抗体，分子量为

982000u

以后R.D.Smith 用ESI/FT-ICR-MS测定DNA片段，分子量为1.1 10 8 u

应用范围：

生物大分子的分子量测定

肽序列分析（根据其质谱中的碎片离子来推导）

鉴别生物大分子的构象

蛋白质中二硫键、糖基化(glycosylation site)、磷酸化(phosphorylation) 连接点

用ESI观察非共价键相互作用的研究

I．生物大分子的分子量测定

用MALDI-TOF 测定，多数只得单电荷离子，质谱图中的谱峰与样品各组分的质量数由一一对应关系。所以MALDI-TOF-MS最适合分析多肽及蛋白质混合物。

在ESI-MS时，易形成多电荷离子[M+nH]n+或[M-nH]n-。要确定电荷态。

a．低分辨状态下测电荷态

对于任意两峰M1 =(M+n)/n M2 =(M+[n+1])/n+1 相邻两峰相差一个电荷数计算多电荷离子所带电荷数，进而换算出该离子带单电荷时的质量，一般根据多个多电荷峰计算多个质量后取平均值。

b．高分辨状态下测电荷态

可分辨出单个离子峰的同位素峰，任意两峰之间质荷比的差值，计算其倒数（电荷值）。由电荷数可计算该多电荷离子的单电荷分子离子质量。

II．肽质量指纹谱（peptide mass fingerprinting, PMF）鉴定技术

蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解，得到的肽片段质量图谱。由实验测得的蛋白质酶解肽段质量数在蛋白质数据库中检索，寻找相似肽指纹谱的蛋白质。

最有效的仪器: MALDI-TOF-MS 每个谱峰代表一种肽段

III. 多肽、蛋白质、DNA片段的序列分析

蛋白质的一级结构：以肽链结构为基础的肽链线型序列

串联质谱仪可直接测定肽段的序列，多肽被电离后，各种键会断裂，形成强度不同的离子。肽键断裂形成b n 、y n系列离子。推断氨基酸连接顺序。

Roepstorff 和Fohlman 建议如下式：

a 、

b 、

c 型离子保留肽链的N 末端，电荷留在离子C 端 x 、y 、z 型离子保留肽链C 端，电荷留在离子N 端

b 型和y 型离子在质谱图中较多见，丰度较高。还会b-H 2O 和y-NH 3等离子形式

与PMF 谱图相比，串联质谱技术获取的肽序列谱图相对复杂，需计算软件帮助计算识别b 、y 等个系列离子。

区别肽质谱离子来自C 端或N 端，衍生方法：N-乙酰化， 甲酯化

分析肽序列方法： FAB/CID

BOC —Gly —Ala —D —Val —Leu —Ile —Obzl

BOC = t-butyloxy carbonyl Bzl = benzyl

H 2N

C

C

N C

N C

N C

COOH

C R 1

O R 2O R 3O R 4H

H C H x 3y 3

z 3x 2y 2

z 2x 1

y 1

z 1a 1

b 1

c 1a 2

b 2

c 2

a 3

b 3

c 3

H 2N

C C

O

R 1

H

H 3N

C C

N C

COOH R 3

R 4

O H H

H

b 1y"2

H H H

BOC NH CH 2C O

NH CH CH 3C O NH CH CH (3)2C O NH CH CH 2CH

(CH 3)2

NH CH C O CH(CH 3)C 2H 5C O OBzl

y 4y 3y 2y 1b 1

b 2b 3