肿瘤分子诊断技术课件
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肿瘤分子诊断技术
质谱分析
抗体芯片
对蛋白质进行质荷比分析和鉴定，用于蛋 白质的定性和定量分析。
将抗体固定在芯片上，用于检测肿瘤组织 中特定蛋白质的表达和活性。
代谢组学技术
代谢组学技术
通过分析肿瘤组织中代谢产物的变化，了解 肿瘤的代谢特征和能量代谢状态。
气相色谱-质谱联用
分离和鉴定挥发性代谢产物，用于检测和鉴 定代谢物。
RNA-seq
基于高通量测序的RNA分析技 术，可全面分析基因转录本的 表达和变异。
qRT-PCR
实时荧光定量逆转录PCR技术 ，用于验证和筛选差异表达基
因。
蛋白质组学技术
蛋白质组学技术
2D电泳
通过研究肿瘤组织中蛋白质的表达和修饰 ，揭示肿瘤的生物学特征和药物治疗反应 。
分离蛋白质的二维平面分离技术，用于蛋 白质表达谱分析和差异显示。
标准化与规范化的问题
总结词
标准化和规范化是肿瘤分子诊断技术的关键问题，需要建立统一的检测标准和操作规范 ，以确保检测结果的准确性和可靠性。
详细描述
由于不同实验室和医疗机构使用的检测方法、试剂和仪器可能存在差异，导致检测结果 不一致。因此，需要制定统一的检测标准和操作规范，对实验室和医疗机构的检测过程 进行规范化和标准化管理，以确保检测结果的准确性和可靠性。这有助于提高肿瘤分子
06 肿瘤分子诊断技术的案例 研究
案例一：肺癌的基因突变检测
总结词
通过检测肺癌组织中的基因突变，为肺癌的诊断、治疗和预 后评估提供依据。
详细描述
通过对肺癌组织进行基因测序，发现肺癌中常见的基因突变 ，如EGFR、KRAS等，这些突变与肺癌的发病机制、药物敏 感性及预后密切相关。基因突变检测有助于指导肺癌患者的 靶向治疗和个性化治疗方案的制定。
《分子肿瘤学全套》PPT课件
果、蔬菜和整谷粒等。
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19
第二节 致癌因素及其致癌机制
2.1 致癌因素 化学因素：烷化剂、多环芳烃、芳香胺类、
氨基偶氮染料、亚硝胺类物质、黄曲霉毒素、 植物毒素、金属致癌物等 物理因素：电离辐射、紫外线、纤维状异物、 热辐射、慢性刺激与炎症等 生物因素：致瘤性DNA病毒（人类乳头状瘤 病毒、Epstein-Barr病毒和乙型肝炎病毒） 和致瘤性RNA病毒（人类T细胞白血病病毒）
（2）某些癌基因或抑癌基因在肿瘤发生和 进展中也对肿瘤的转移起着各自一定的重 要作用。
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43
肿瘤转移相关基因
促进基因：EF1A基因（与细胞的增殖和运动 有关）；S100A4基因（与癌细胞的侵袭和转 移特性有关）；MTA1基因（与乳腺癌的发 生和转移的增强相关）。
抑制基因：NM23基因家族；Wdnm2基因； H2-K基因
人)；结肠癌(67.7万人)和乳腺癌(54.8万人) 大约80%的癌症导致的死亡发生在低收入和中
等收入国家 预计2030年全世界癌症死亡人数将达1200万
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4
第一节 肿瘤是什么？
1.1 肿瘤的概念
肿瘤：是一类疾病的总称，基本特征是细胞 增殖与凋亡失控，扩张性增生形成新生物。
（1）良性肿瘤：生长缓慢，保留了正常细胞 的某些特性，多数是无害的。
（2）恶性肿瘤：也称癌症，具有侵袭和转移 的能力。
分子肿瘤学：是用分子生物学的理论和技术
来研究肿瘤的一门科学，是医学和生物学的
交叉学科。
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5
癌症的种类
（1）实体肿瘤 癌：起源于上皮细胞 淋巴瘤：起源于淋巴细胞 肉瘤：起源于间叶组织
（2）液体肿瘤 白血病：起源于骨髓造血细胞
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19
第二节 致癌因素及其致癌机制
2.1 致癌因素 化学因素：烷化剂、多环芳烃、芳香胺类、
氨基偶氮染料、亚硝胺类物质、黄曲霉毒素、 植物毒素、金属致癌物等 物理因素：电离辐射、紫外线、纤维状异物、 热辐射、慢性刺激与炎症等 生物因素：致瘤性DNA病毒（人类乳头状瘤 病毒、Epstein-Barr病毒和乙型肝炎病毒） 和致瘤性RNA病毒（人类T细胞白血病病毒）
（2）某些癌基因或抑癌基因在肿瘤发生和 进展中也对肿瘤的转移起着各自一定的重 要作用。
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肿瘤转移相关基因
促进基因：EF1A基因（与细胞的增殖和运动 有关）；S100A4基因（与癌细胞的侵袭和转 移特性有关）；MTA1基因（与乳腺癌的发 生和转移的增强相关）。
抑制基因：NM23基因家族；Wdnm2基因； H2-K基因
人)；结肠癌(67.7万人)和乳腺癌(54.8万人) 大约80%的癌症导致的死亡发生在低收入和中
等收入国家 预计2030年全世界癌症死亡人数将达1200万
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4
第一节 肿瘤是什么？
1.1 肿瘤的概念
肿瘤：是一类疾病的总称，基本特征是细胞 增殖与凋亡失控，扩张性增生形成新生物。
（1）良性肿瘤：生长缓慢，保留了正常细胞 的某些特性，多数是无害的。
（2）恶性肿瘤：也称癌症，具有侵袭和转移 的能力。
分子肿瘤学：是用分子生物学的理论和技术
来研究肿瘤的一门科学，是医学和生物学的
交叉学科。
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5
癌症的种类
（1）实体肿瘤 癌：起源于上皮细胞 淋巴瘤：起源于淋巴细胞 肉瘤：起源于间叶组织
（2）液体肿瘤 白血病：起源于骨髓造血细胞
《分子肿瘤学》PPT课件
胚胎诱导与分化抑制共同作用，完成胚胎的正常发育 程序
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7
（3）细胞分化相关基因及其表达
基因选择性表达的差异导致了形态功能各异的细 胞。
奢侈基因（luxury gene):编码细胞中特异性蛋白的 基因，对细胞分化起着极其重要的作用。奢侈基因编 码的奢侈蛋白可作为细胞分化的标志物。
持家基因（house-keeping gene):编码维持细胞活 动所必须的结构和功能蛋白质的基因以及一些不编码 蛋白质却参与蛋白质合成的tRNA、rRNA基因。持家 基因编码的蛋白质为各类细胞所共有，维持细胞最基 本的生命活动所需蛋白质，不具有特异性。
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12
（5）转录后的调控
基因转录为mRNA后，mRNA的翻译过程 涉及一系列事件，如高分子量mRNA前体分子 的剪接和加工、mRNA编辑，mRNA由细胞核 转运至胞浆、翻译的起始和肽链的合成、 mRNA的降解和翻译后蛋白质多肽链的折叠和 加工等。
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13
（6）细胞微环境对分化的影响
激素
远距离细胞间相互作用对细胞分化的影响主 要是通过激素来调节的，如糖皮质激素、胰高 血糖素、甲状腺素等可间接或直接作用于染色 体，选择性激活或抑制某些基因转录。
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15
（7）位置效应
在胚胎发育和器官形成过程中，细胞的发育 分化还取决于细胞所处的位置，称为位置效应， 如畸胎瘤。
（8）端粒酶（telomerase)
（1）细胞分化的普遍性
不但在个体发生过程中，即使在成年后也
存在细胞分化现象
（2）细胞分化过程的稳定性
细胞分化是相对稳定和持久的过程，分化
基本上是不可逆的，个体发育亦具有不可
逆性
（3）细胞分化状态的条件可逆性
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7
（3）细胞分化相关基因及其表达
基因选择性表达的差异导致了形态功能各异的细 胞。
奢侈基因（luxury gene):编码细胞中特异性蛋白的 基因，对细胞分化起着极其重要的作用。奢侈基因编 码的奢侈蛋白可作为细胞分化的标志物。
持家基因（house-keeping gene):编码维持细胞活 动所必须的结构和功能蛋白质的基因以及一些不编码 蛋白质却参与蛋白质合成的tRNA、rRNA基因。持家 基因编码的蛋白质为各类细胞所共有，维持细胞最基 本的生命活动所需蛋白质，不具有特异性。
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（5）转录后的调控
基因转录为mRNA后，mRNA的翻译过程 涉及一系列事件，如高分子量mRNA前体分子 的剪接和加工、mRNA编辑，mRNA由细胞核 转运至胞浆、翻译的起始和肽链的合成、 mRNA的降解和翻译后蛋白质多肽链的折叠和 加工等。
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（6）细胞微环境对分化的影响
激素
远距离细胞间相互作用对细胞分化的影响主 要是通过激素来调节的，如糖皮质激素、胰高 血糖素、甲状腺素等可间接或直接作用于染色 体，选择性激活或抑制某些基因转录。
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（7）位置效应
在胚胎发育和器官形成过程中，细胞的发育 分化还取决于细胞所处的位置，称为位置效应， 如畸胎瘤。
（8）端粒酶（telomerase)
（1）细胞分化的普遍性
不但在个体发生过程中，即使在成年后也
存在细胞分化现象
（2）细胞分化过程的稳定性
细胞分化是相对稳定和持久的过程，分化
基本上是不可逆的，个体发育亦具有不可
逆性
（3）细胞分化状态的条件可逆性
肿瘤的分子生物学检验技术 ppt课件
ppt课件
10
3、rRNA基因
1、mtRNA 编码 两种rRNA,即 12SrRNA16SrR NA 2、位P于heH链 Leu tRNA tRNAVal 之间以tRNA 相 隔 3、变异常发生在 二级结构茎环上 。
ppt课件
11
4、非编码区
D-loop（约1120bp）
位于tRNAPro
和tRNAPhe基因之间， 约1120bp,是mtDNA中 变异最多的区域，参与 并调控mtDNA的复制和 转录。
（4）结果分析：根据酶解片段选择不同浓度的琼脂 糖或聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，染色后观察扩增 基因的变异情况。
ppt课件
35
二、线粒体病的分子生物学检验技术
（二）变性高效液相色谱法
在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体 在柱中保留时间的差异，发现DNA突变。异源 双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在 部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在
三、线粒体病的分子生物学检验应用
（一）MELAS综合征
11月23日，读初三的晓炎从学校回家后，顾春娜就感觉女儿脸色 不好，以为晓炎在学校吃的没有营养，就赶紧给女儿做了顿好饭。 可晓炎吃过饭后不久，就开始呕吐。
当晚凌晨2点钟，晓炎出现了全身抽搐的症状，看到女儿四肢
颤抖，嘴眼歪斜，顾春娜赶紧拨打120，急救车将女儿送到医院救
（3）DHPLC检测上样前要验证PCR产物质量，以保 证结果准确性。
（4）结果分析：在部分变性条件下出现异源双链峰， 表明异质性突变位点，反之则为同源单峰。建议购买 阳性质控品。
ppt课件
39
二、线粒体病的分子生物学检验技术
（三）DNA芯片技术略 （四）DNA测序技术略
《肿瘤的分子诊断》PPT课件
《肿瘤的分子诊断》ppt课件
汇报人：可编辑 2024-01-11
目 录
• 肿瘤分子诊断概述 • 肿瘤分子诊断的应用 • 肿瘤分子诊断的挑战与前景 • 肿瘤分子诊断的实际案例
01
肿瘤分子诊断概述
肿瘤分子诊断的定义
01
肿瘤分子诊断是指通过检测肿瘤 细胞或组织中的分子异常，对肿 瘤进行早期发现、诊断、治疗和 预后评估的方法。
的不断发展，卵巢癌的分子诊断将有望实现更精准、更个性化的治疗策略。
THANKS
感谢观看
免疫治疗
通过调节患者的免疫系统 来攻击肿瘤细胞的治疗方 法，具有较好的疗效和较 低的副作用。
03
肿瘤分子诊断的挑战与前景
肿瘤分子诊断的挑战
技术限制
目前肿瘤分子诊断技术仍存在 一定的局限性，如检测灵敏度
、特异性等方面的问题。
肿瘤异质性
肿瘤内部的异质性导致不同部 位肿瘤细胞的分子特征存在差 异，给分子诊断带来困难。
基因突变和甲基化
检测
基因突变和甲基化是肿瘤发生发 展的重要机制，通过检测这些变 化，有助于发现早期肿瘤。
肿瘤的分类与分型
肿瘤的分类与分型
根据分子标志物的差异，可以将 肿瘤分为不同的亚型，有助于制
定个性化的治疗方案。
基因表达谱分析
通过分析肿瘤组织的基因表达谱， 可以将肿瘤分为不同的亚型，有助 于了解肿瘤的生物学特征和预后。
免疫组化分析
免疫组化分析是一种常用的肿瘤分 类方法，通过检测肿瘤细胞的免疫 反应，有助于确定肿瘤的性质和分 化程度。
肿瘤的预后评估
01
肿瘤的预后评估
通过检测分子标志物，可以预测 肿瘤的发展趋势和患者的预后情 况。
生存分析
02
汇报人：可编辑 2024-01-11
目 录
• 肿瘤分子诊断概述 • 肿瘤分子诊断的应用 • 肿瘤分子诊断的挑战与前景 • 肿瘤分子诊断的实际案例
01
肿瘤分子诊断概述
肿瘤分子诊断的定义
01
肿瘤分子诊断是指通过检测肿瘤 细胞或组织中的分子异常，对肿 瘤进行早期发现、诊断、治疗和 预后评估的方法。
的不断发展，卵巢癌的分子诊断将有望实现更精准、更个性化的治疗策略。
THANKS
感谢观看
免疫治疗
通过调节患者的免疫系统 来攻击肿瘤细胞的治疗方 法，具有较好的疗效和较 低的副作用。
03
肿瘤分子诊断的挑战与前景
肿瘤分子诊断的挑战
技术限制
目前肿瘤分子诊断技术仍存在 一定的局限性，如检测灵敏度
、特异性等方面的问题。
肿瘤异质性
肿瘤内部的异质性导致不同部 位肿瘤细胞的分子特征存在差 异，给分子诊断带来困难。
基因突变和甲基化
检测
基因突变和甲基化是肿瘤发生发 展的重要机制，通过检测这些变 化，有助于发现早期肿瘤。
肿瘤的分类与分型
肿瘤的分类与分型
根据分子标志物的差异，可以将 肿瘤分为不同的亚型，有助于制
定个性化的治疗方案。
基因表达谱分析
通过分析肿瘤组织的基因表达谱， 可以将肿瘤分为不同的亚型，有助 于了解肿瘤的生物学特征和预后。
免疫组化分析
免疫组化分析是一种常用的肿瘤分 类方法，通过检测肿瘤细胞的免疫 反应，有助于确定肿瘤的性质和分 化程度。
肿瘤的预后评估
01
肿瘤的预后评估
通过检测分子标志物，可以预测 肿瘤的发展趋势和患者的预后情 况。
生存分析
02
肿瘤分子诊断ppt课件
16
ppt课件完整
药物名称
检测靶标
检测内容
吉非替尼/ 厄洛替尼
EGFR
西妥昔单抗
K-ras，Braf
基因突变 基因突变
伊马替尼
C-Kit
基因突变
指导肿瘤靶向治疗的靶标
检测结果 预测内容
野生型 突变型 野生型 突变型 野生型 突变型
耐药 敏感 敏感 耐药 耐药 敏感
17
ppt课件完整
基因多态性检测与药物代谢毒性 (UGT1A1,CYP,DPD)
18
ppt课件完整 4/1/2021
最常见的基因多态性 SNP
单核苷酸多态性（SNP）是最常见的基因变异
绝大多数人群
至少1%的人群
G to C
共有序列
变异的序列
SNP 位点
19
ppt课件完整 4/1/2021
为什么 SNPs 重要?
个体 1
个体 2
基因 A
基因 B
SNP标志基因 A
SNP 可能使基因 B 产生变 异的蛋白质分子
23
ppt课件完整
胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因（UGT1A1）
UGT1A1*27(C686A)或UGT1A1*28[(TA)7TAA]: 野生型：6个TA
使UGT1A1的转录活性下降了三分之二。 导致对伊立替康的毒性增加。
UGT1A1*6(G211A)：
此型的酶活性是野生型的49％ 。
肿瘤分子诊断服务介绍
标准化用药
标准化用药
ppt课件完整
个体化用药
个体化用药
标准疗法1 标准疗法2 标准疗法3
2
ppt课件完整
肿瘤药物与相关靶标
3
《分子诊断技术》课件
2010年代至今
随着生物信息学和人工智能技 术的发展，分子诊断技术不断 优化和升级，应用领域也不断
拓展。
02
分子诊断技术的基本原理
核酸的提取与纯化
核酸提取
核酸提取与纯化的重要性
是指从生物样本中分离和纯化核酸的 过程，是分子诊断技术中的基础步骤 。
是确保后续分子诊断实验结果准确性 和可靠性的关键。
案例三
总结词
SNP分型技术有助于个体化医疗的实现，为 患者提供更加精准的治疗方案。
详细描述
SNP分型技术可以对个体的基因变异进行精 细分析，预测个体对不同药物的反应和代谢 情况，为医生制定个体化的治疗方案提供科
学依据，提高治疗效果并减少副作用。
THANKS
感谢观看
特点
高灵敏度、高特异性、早期诊断、个性化治疗指导等。
分子诊断技术的应用领域
遗传性疾病诊断
通过对基因突变进行检测，对遗传性 疾病进行早期发现和干预。
肿瘤诊断与监测
通过对肿瘤相关基因和蛋白质的检测 ，对肿瘤进行早期发现、诊断、分期 、预后评估和复发监测。
感染性疾病诊断
通过对病原体基因和蛋白质的检测， 对感染性疾病进行快速诊断和用药指 导。
01
02
03
个性化医疗
结合基因组学、蛋白质组 学等技术，实现个体化、 精准化的诊断和治疗。
无创检测
研究无创或微创的分子诊 断技术，减少对患者的创 伤和痛苦。
实时监测
实现实时、动态的分子诊 断监测，及时发现病情变 化，为治疗提供及时反馈 。
05
案例分析
案例一：基因突变检测在肺癌诊断中的应用
总结词
基因突变检测在肺癌诊断中具有重要意义，有助于早期发现和个性化治疗。
随着生物信息学和人工智能技 术的发展，分子诊断技术不断 优化和升级，应用领域也不断
拓展。
02
分子诊断技术的基本原理
核酸的提取与纯化
核酸提取
核酸提取与纯化的重要性
是指从生物样本中分离和纯化核酸的 过程，是分子诊断技术中的基础步骤 。
是确保后续分子诊断实验结果准确性 和可靠性的关键。
案例三
总结词
SNP分型技术有助于个体化医疗的实现，为 患者提供更加精准的治疗方案。
详细描述
SNP分型技术可以对个体的基因变异进行精 细分析，预测个体对不同药物的反应和代谢 情况，为医生制定个体化的治疗方案提供科
学依据，提高治疗效果并减少副作用。
THANKS
感谢观看
特点
高灵敏度、高特异性、早期诊断、个性化治疗指导等。
分子诊断技术的应用领域
遗传性疾病诊断
通过对基因突变进行检测，对遗传性 疾病进行早期发现和干预。
肿瘤诊断与监测
通过对肿瘤相关基因和蛋白质的检测 ，对肿瘤进行早期发现、诊断、分期 、预后评估和复发监测。
感染性疾病诊断
通过对病原体基因和蛋白质的检测， 对感染性疾病进行快速诊断和用药指 导。
01
02
03
个性化医疗
结合基因组学、蛋白质组 学等技术，实现个体化、 精准化的诊断和治疗。
无创检测
研究无创或微创的分子诊 断技术，减少对患者的创 伤和痛苦。
实时监测
实现实时、动态的分子诊 断监测，及时发现病情变 化，为治疗提供及时反馈 。
05
案例分析
案例一：基因突变检测在肺癌诊断中的应用
总结词
基因突变检测在肺癌诊断中具有重要意义，有助于早期发现和个性化治疗。
肿瘤病理生物学课件：肿瘤的分子病理诊断技术
雙色銀染原位雜交(DSISH)
Her2 /CEN17
EGFR /CEN7
銀染原位雜交:
B
A
C
SISH Chromogens: A= 醋酸銀 B = 對苯二酚 C = 過氧化氫
HRP標記的羊抗兔二抗多聚體
兔抗2，4二硝基苯酚（DNP）單抗
DNP標記的 HER 2 探針 or 17號染 色體探針
靶向 DNA
腫瘤的分子病理診斷技術
第一節 細胞與分子診斷在 腫瘤研究中的應用和意義
一、腫瘤易感基因的檢測 研究發現部分腫瘤的發生具有分子
遺傳學基礎，腫瘤易感基因的檢測對 腫瘤高危人群的篩選具有實用價值。 主要的腫瘤易感基因包括：
腫瘤易感基因
Rb1(視網膜母細胞瘤基因） WT1(腎母細胞瘤基因） P53(Li-Fraumeni綜合征) APC(家族性腺瘤性息肉病) Rb1(視網膜母細胞瘤基因） WT1(腎母細胞瘤基因） P53(Li-Fraumeni綜合征) APC(家族性腺瘤性息肉病)
根據探針的核酸性質
DNA探針 鎖核酸探針 RNA探針 cDNA探針 cRNA探針 寡核苷酸探針
cDNA、cRNA和寡聚核苷酸探針的優缺點比較
探針種類
優點
缺點
cDNA cRNA
寡聚核 苷酸
1、製備簡單 2、放射比活性高 3、信號特異性強 4、雜交體較穩定
1、信號特異性強 2、不需變性 3、雜交後可用RNase除去未雜交探針
60X
腫瘤細胞組織異質性。綠色箭頭顯示 HER2 簇裝擴增；橙色箭頭顯示 HER2 非擴增。
ISH雙色銀染原位雜交
HER2 非擴增
● HER2 ● CEN17
HER2 擴增
HER2 雙色銀染
《分子诊断技术》课件
1
个性化治疗
通过分析患者基因组信息，为个体提供个性化的治疗方案。
2
药物研发
分子诊断技术可用于药物研发和评价，提高研发效率和成功率。
3
疾病监测
可以通过分子诊断技术对患者的疾病状态进行监测和评估。
分子诊断技术的未来发展
基因组测序技术
随着测序技术的发展，基因组测 序将变得更加便宜和快速。
人工智能
下一代测序技术
分子诊断技术的优势
1 高精度
分子诊断技术可以提供高精度的检测结果， 准确性非常高。
2 快速
相比传统检测方法，分子诊断技术具有更快 的检测速度，可以节约时间。
3 敏感性
分子诊断技术可以检测到非常低浓度的目标 分子，具有很高的检测敏感性。
4 可靠性
分子诊断技术的结果可靠，不易受到外部因 素的影响。
分子诊断技术在医学中的应用
《分子诊断技术》PPT课 件
分子诊断技术是一种以分析和检测基因和蛋白质水平为基础的先进医学技术， 可以帮助我们更准确地诊断疾病。
什么是分子诊断技术
分子诊断技术是一种基于分析和检测生物体分子结构和功能的先进技术，包 括DNA、RNA和蛋白质等分子的检测和分析。
分子诊断技术的原理
核酸检测
通过PCR、DNA测序等技术对基因组进行分析和检测。
将人工智能应用于分子诊断技术， 可以提高数据分析和结果解读的 效率。
下一代测序技术的发展将进一步 推动分子诊断技术的应用和发展。ห้องสมุดไป่ตู้
总结和展望
分子诊断技术在医学领域的应用前景广阔，将为疾病预防、治疗和监测提供 更准确、快速和个性化的方法。
蛋白质检测
通过质谱和免疫技术等对蛋白质进行定量和鉴定。
基础医学肿瘤的分子诊断PPT课件
assay,ELISA ） • 蛋白印迹（Western blot） • 流式细胞仪测试法
第5页/共69页
（二）基因扩增的检测
基因拷贝数的增加和转录产物的mRNA 的增加
分子诊断检测方法:
原位杂交 （in situ hybridization,ISH） 荧光原位杂交
（fluorescence in situ hybridization, FISH） 原 位 PCR （ in situ polymerase chain reaction） Southern杂交（第D6页N/共A69杂页 交）
第31页/共69页
该法检出率很高，也是检测片段最长的方法。应用荧光检测系统可增 强敏感度。该法中的化学试剂有毒，故又发展了碳化二亚胺检测法 （Carbodiimide，CDI），CDI为无毒物质。
第32页/共69页
（六）等位基因特异性寡核苷酸分析法 (allele-specific oligonucleotide ASO) 设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变
用连续二次的巢式PCR来扩增包括存在酶位点编码子的DNA片段，在两次 扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不 能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物 的富集。
第28页/共69页
（四）变性梯度凝胶电泳法
（
denaturing
gradient
原位杂交（in situ hybridization,ISH） 将分子杂交与组织化学相结合的一项技术，属固相核酸分子杂交范围，
它用标记的DNA或RNA为探针在原位检测组织细胞内特异的DNA或RNA 序列。
第7页/共69页
优点：
1、具有分子杂交的特异性强、灵敏高特点， 同
第5页/共69页
（二）基因扩增的检测
基因拷贝数的增加和转录产物的mRNA 的增加
分子诊断检测方法:
原位杂交 （in situ hybridization,ISH） 荧光原位杂交
（fluorescence in situ hybridization, FISH） 原 位 PCR （ in situ polymerase chain reaction） Southern杂交（第D6页N/共A69杂页 交）
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该法检出率很高，也是检测片段最长的方法。应用荧光检测系统可增 强敏感度。该法中的化学试剂有毒，故又发展了碳化二亚胺检测法 （Carbodiimide，CDI），CDI为无毒物质。
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（六）等位基因特异性寡核苷酸分析法 (allele-specific oligonucleotide ASO) 设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变
用连续二次的巢式PCR来扩增包括存在酶位点编码子的DNA片段，在两次 扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不 能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物 的富集。
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（四）变性梯度凝胶电泳法
（
denaturing
gradient
原位杂交（in situ hybridization,ISH） 将分子杂交与组织化学相结合的一项技术，属固相核酸分子杂交范围，
它用标记的DNA或RNA为探针在原位检测组织细胞内特异的DNA或RNA 序列。
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优点：
1、具有分子杂交的特异性强、灵敏高特点， 同
肿瘤标志物的分子诊断课件
3. Western 杂交印迹法
(Western blotting)
用电泳的方法先分离非标记蛋白质并转移到固相载体 上，然后用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量/半定 量的方法。
主要步骤： 1)蛋白质样品的制备; 2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳; 3)蛋白质的电转移到NC膜; 4)靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 5)标记的第二抗体（酶标二抗）反应; 6)显色反应：酶促反应（显色或者是发光）
1. 酶联免疫吸附剂测定
（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）
基本原理是： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原 或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 在测定时， 1) 把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按 不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 2) 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质 分开， 3) 最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的 比例。 4) 加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量 与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊 物定性或定量分析。 由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使 测定方法达到很高的敏感度。
4. ELISA、免疫透射比浊及WESTERN 比较
ELISA : 操作简单、容量大，适合于筛选； 免疫比浊法：操作很简单，也适合与同时处理大量标本，由于免疫浊度产 生条件要求相对苛刻，因此对于仪器和试剂要求稍高。 Western Blot：检测到非常微量（可以达到皮克，pg），前两种方法无法 检测的，都可以用此法检测,同时此法可以确定分子量的大小。不足 之处在于操作复杂，同时处理的样本量有限。 ELISA和免疫透射比浊检测是目前临床上检测肿瘤标志物最常用和最普及的技术 特别是ELISA因操作简单，方便，成本低，设备仪器要求简单适合于各个层 次检验单位应用。 甲胎蛋白（AFP）、 癌胚抗原（CEA）、 血清铁蛋白（SF）、消化道癌抗原（CCA） 血清中神经元特异性烯醇化酶( E)、 胃泌素释放肽前体(pro-GRP)、 细胞角蛋白19(CYFRA21-1)、 p53抗体等。
肿瘤分子诊断技术课件
达的调控
• 利用FISH相关技术检测染色体不稳定性 • 多色荧光FISH (multifluor-FISH) • DNA结构不稳定
微卫星不稳定定 异质性丢失
肿瘤分子诊断技术
17
细胞间期 可表现特征性的ABL-BCR融合基因
肿瘤分子诊断技术
18
肿瘤分子诊断技术
19
• 微卫星不稳定MSI
正常组织STR相比较，出现STR重复次数的增加或减 少，得到不一样的pattern
• 受细胞周期素及相对应的细胞周期素依赖激酶 (cyclindependent kinase，CDK)严格调控
• 细胞胞周期的每阶段都有一组 CDKs与cyclins 交互作用 来调控
• CDK的磷酸化及cyclin-CDK抑制剂(CKIs)的活化都会影 响细胞周期
肿瘤分子诊断技术
4
• 癌症相关基因
Microsatellite DNA markers广泛使用在检测肿瘤 初期基因组不稳定现象
Mao et al.(1996)，使用microsatellite analysis检 测膀胱癌的尿沉淀物，有95%的检出率
• 杂合性性丢失( loss of heterozygosity、LOH)
来自父系或母系的同一区域的DNA，有多形性的变 化(如 SNP、STR、VNTR) ，但並不改变该区域基 因的功能，称异质性的变化
肿瘤分子诊断技术
5
• 致癌基因(oncogene)
• 1911年Rous发现的鸡的肿瘤传染因子是一种病毒，为 反转录病毒
• 癌化作用是因為病毒基因组内特殊致癌基因(v-onc)
• 哺乳类的基因组上，也存在有同源的序列 (e-onc)
• 调控胚胎的发展、细胞的增殖、分化和凋亡
• 利用FISH相关技术检测染色体不稳定性 • 多色荧光FISH (multifluor-FISH) • DNA结构不稳定
微卫星不稳定定 异质性丢失
肿瘤分子诊断技术
17
细胞间期 可表现特征性的ABL-BCR融合基因
肿瘤分子诊断技术
18
肿瘤分子诊断技术
19
• 微卫星不稳定MSI
正常组织STR相比较，出现STR重复次数的增加或减 少，得到不一样的pattern
• 受细胞周期素及相对应的细胞周期素依赖激酶 (cyclindependent kinase，CDK)严格调控
• 细胞胞周期的每阶段都有一组 CDKs与cyclins 交互作用 来调控
• CDK的磷酸化及cyclin-CDK抑制剂(CKIs)的活化都会影 响细胞周期
肿瘤分子诊断技术
4
• 癌症相关基因
Microsatellite DNA markers广泛使用在检测肿瘤 初期基因组不稳定现象
Mao et al.(1996)，使用microsatellite analysis检 测膀胱癌的尿沉淀物，有95%的检出率
• 杂合性性丢失( loss of heterozygosity、LOH)
来自父系或母系的同一区域的DNA，有多形性的变 化(如 SNP、STR、VNTR) ，但並不改变该区域基 因的功能，称异质性的变化
肿瘤分子诊断技术
5
• 致癌基因(oncogene)
• 1911年Rous发现的鸡的肿瘤传染因子是一种病毒，为 反转录病毒
• 癌化作用是因為病毒基因组内特殊致癌基因(v-onc)
• 哺乳类的基因组上，也存在有同源的序列 (e-onc)
• 调控胚胎的发展、细胞的增殖、分化和凋亡
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期
肿瘤分子诊断技术
12
肿瘤分子诊断技术
13
• p53基因
• 抑制肿瘤生长的作用，基因定位在17p ， p53是其分子量(53 kD)
• 在人类的大肠癌中有70%因失去 p53功能 • 50%的肺癌、40%的乳癌也因p53去活化而诱发
• 人类癌症约有一半起因于p53突变缺陷或失去作用
• 发生突变的蛋白质可能原因
肿瘤的分子诊断技术
温州医学院检验医学院生命科学学院
肿瘤分子诊断技术
1
癌症的分子诊断
• 几乎癌组织都是克隆性增殖 • 患者的所有癌细胞都起源于单一的癌细胞
• 大多数癌症不能用单基因遗传方式解释 • 某些类型的癌症，亲属发生同类肿瘤的风险会增
加，但不表现孟德尔遗传 • 许多癌症与环境的物理化学因子或生物因子有关
• 这二种功能保持基因组的稳定性，p53称为基因组保护者 (guardian of genome)
肿瘤分子诊断技术
15
肿瘤分子诊断技术
16
• 癌症有关的现象
• 染色体不稳定性
癌化的细胞中常见到三倍体和单倍体 染色体的缺失，还有染色体大片段的重排(插入、重复、缺失、
倒转、易位) 染色体之间或染色体本身的交互作用，可能也参与了细胞基因表
肿瘤分子诊断技术
6
• 原(致)癌基因
• 调控生长分化、信号传递、转录因子、细胞周期
• 生长因子
• 病毒来源的sis基因与细胞来源的原癌基因-血小板衍生性生长因子 次单位
• 细胞表面生长因子受体
• 表皮生长因子受体基因( epidermal growth factor receptor， EGFR)
肿瘤分子诊断技术
5
• 致癌基因(oncogene)
• 1911年Rous发现的鸡的肿瘤传染因子是一种病毒，为 反转录病毒
• 癌化作用是因為病毒基因组内特殊致癌基因(v-onc)
• 哺乳类的基因组上，也存在有同源的序列 (e-onc)
• 调控胚胎的发展、细胞的增殖、分化和凋亡
• 调控失常，会使细胞发展为恶性表型，正常细胞中具有这样潜 能的基因称为原(致)癌基因( proto-oncogene)
• 蛋白质-酪胺酸激酶( protein tyrosine kinase) ABL是细胞内信 号传递蛋白与信号传递至核内有关
• 核内转录因子
• MYC是DNA结合蛋白，而JUN是转录因子
• 细胞周期有关的蛋白
• 调控细胞周期相关的激酶和激酶抑制物
肿瘤分子诊断技术
8
肿瘤分子诊断技术
9
• 病毒性癌基因
• 只有少数人类反转录病毒引起人类癌症
• HIV 可以促进细胞增殖和增加体细胞突变的机会，或插入基因 组促使邻近基因活化引起免疫缺陷而间接促进肿瘤的产生
• 病毒癌基因插入宿主癌化的原因
• 有些的癌基因产物作用如同细胞癌基因产物 • 有时插入的病毒癌基因是断裂的，這些断裂的序列可能是基因
内的调控序列 • 有些病毒癌基因的产物与子诊断技术
11
RB基因的功能
• 蛋白产物pRb是细胞周期的刹车器 • pRb 蛋白发生周期性的磷酸化反应 • pRb蛋白在GI期是细胞周期抑制信号的集合点，这个以pRb蛋白
为中心的抑制传导途径，称为RB传导途径 • 静止的细胞， pRb没有磷酸化 • Gl期之末，在有丝分裂时间是磷酸化的 • 非磷酸化的pRb在进入S期之前可与几种蛋白质结合调控细胞周
白活化
肿瘤分子诊断技术
10
• 肿瘤抑制基因( tumor suppressor gene) • 在遗传学上，癌基因对细胞的作用是显性作用 ( dominant effect) • 可抑制oncogene作用的基因，称tumor suppressor gene • 抑癌基因的蛋白產物能抑制细胞不正常生长及 抑制细胞癌化 • 遗传学上一般属于阴性 ( recessive) • RB基因 • 视网膜母细胞瘤( retinoblastoma，RB)，一种 侵犯幼儿视网膜膜的肿瘤 • 散发性非遗传的类型最常见，会造成单侧眼睛 病变 • 约1/3的RB病人产生多发性肿瘤，且常造成双眼 的病变，及在同胞兄弟姊妹中可发生同样病变， 家族倾向遗传性
• 受细胞周期素及相对应的细胞周期素依赖激酶 (cyclindependent kinase，CDK)严格调控
• 细胞胞周期的每阶段都有一组 CDKs与cyclins 交互作用 来调控
• CDK的磷酸化及cyclin-CDK抑制剂(CKIs)的活化都会影 响细胞周期
肿瘤分子诊断技术
4
• 癌症相关基因
达的调控
• 利用FISH相关技术检测染色体不稳定性 • 多色荧光FISH (multifluor-FISH) • DNA结构不稳定
微卫星不稳定定 异质性丢失
肿瘤分子诊断技术
17
细胞间期 可表现特征性的ABL-BCR融合基因
肿瘤分子诊断技术
18
肿瘤分子诊断技术
肿瘤分子诊断技术
2
造成癌症的因素列举
遗传因素 一些特殊的基因突变会造成特定的癌症
性别
乳腺癌以女性为主
环境因素 石棉、辐射线、抽烟、油烟
压力
持续的工作压力
食品添加剂 亚硝酸的添加
病毒感染 HPV与子宫颈癌
药物
雌激素替代疗法与乳腺癌
生活方式 运动不足和不当饮食
肿瘤分子诊断技术
3
• 细胞周期的调控因素
• 两个alleles都发生缺失
• 一个allele上发生错义点突变，会抑制另一个正常野生型基因的 功能
肿瘤分子诊断技术
14
• 正常细胞中，p53的量都很低 • DNA损伤时，p53就大量增加，造成
• 生长的停止或细胞凋亡( apoptosis) • p53就激活p21蛋白质关闭细胞周期
• p21蛋白质是一个CDK 的抑制因子 • 可结合CDK2、CDK4、CDK6，并抑制它们的活性 • 细胞进入S期以前，得以修护受损伤的DNA • 若细胞已将进入S期，已不能修护受损伤的DNA，则p53起动细 胞凋亡
• 集落刺激因子1受体(CSF1R)基因相当， CSF1R是一种促进骨髓中多 种细胞分裂的生长因子
肿瘤分子诊断技术
7
细胞内信号传递系统( Intracellular signal transduction systems)
• RAS家族是信号传递通路G-protein的成份，藉由跨膜蛋白与Gprotein的结合将信号传至核内
肿瘤分子诊断技术
12
肿瘤分子诊断技术
13
• p53基因
• 抑制肿瘤生长的作用，基因定位在17p ， p53是其分子量(53 kD)
• 在人类的大肠癌中有70%因失去 p53功能 • 50%的肺癌、40%的乳癌也因p53去活化而诱发
• 人类癌症约有一半起因于p53突变缺陷或失去作用
• 发生突变的蛋白质可能原因
肿瘤的分子诊断技术
温州医学院检验医学院生命科学学院
肿瘤分子诊断技术
1
癌症的分子诊断
• 几乎癌组织都是克隆性增殖 • 患者的所有癌细胞都起源于单一的癌细胞
• 大多数癌症不能用单基因遗传方式解释 • 某些类型的癌症，亲属发生同类肿瘤的风险会增
加，但不表现孟德尔遗传 • 许多癌症与环境的物理化学因子或生物因子有关
• 这二种功能保持基因组的稳定性，p53称为基因组保护者 (guardian of genome)
肿瘤分子诊断技术
15
肿瘤分子诊断技术
16
• 癌症有关的现象
• 染色体不稳定性
癌化的细胞中常见到三倍体和单倍体 染色体的缺失，还有染色体大片段的重排(插入、重复、缺失、
倒转、易位) 染色体之间或染色体本身的交互作用，可能也参与了细胞基因表
肿瘤分子诊断技术
6
• 原(致)癌基因
• 调控生长分化、信号传递、转录因子、细胞周期
• 生长因子
• 病毒来源的sis基因与细胞来源的原癌基因-血小板衍生性生长因子 次单位
• 细胞表面生长因子受体
• 表皮生长因子受体基因( epidermal growth factor receptor， EGFR)
肿瘤分子诊断技术
5
• 致癌基因(oncogene)
• 1911年Rous发现的鸡的肿瘤传染因子是一种病毒，为 反转录病毒
• 癌化作用是因為病毒基因组内特殊致癌基因(v-onc)
• 哺乳类的基因组上，也存在有同源的序列 (e-onc)
• 调控胚胎的发展、细胞的增殖、分化和凋亡
• 调控失常，会使细胞发展为恶性表型，正常细胞中具有这样潜 能的基因称为原(致)癌基因( proto-oncogene)
• 蛋白质-酪胺酸激酶( protein tyrosine kinase) ABL是细胞内信 号传递蛋白与信号传递至核内有关
• 核内转录因子
• MYC是DNA结合蛋白，而JUN是转录因子
• 细胞周期有关的蛋白
• 调控细胞周期相关的激酶和激酶抑制物
肿瘤分子诊断技术
8
肿瘤分子诊断技术
9
• 病毒性癌基因
• 只有少数人类反转录病毒引起人类癌症
• HIV 可以促进细胞增殖和增加体细胞突变的机会，或插入基因 组促使邻近基因活化引起免疫缺陷而间接促进肿瘤的产生
• 病毒癌基因插入宿主癌化的原因
• 有些的癌基因产物作用如同细胞癌基因产物 • 有时插入的病毒癌基因是断裂的，這些断裂的序列可能是基因
内的调控序列 • 有些病毒癌基因的产物与子诊断技术
11
RB基因的功能
• 蛋白产物pRb是细胞周期的刹车器 • pRb 蛋白发生周期性的磷酸化反应 • pRb蛋白在GI期是细胞周期抑制信号的集合点，这个以pRb蛋白
为中心的抑制传导途径，称为RB传导途径 • 静止的细胞， pRb没有磷酸化 • Gl期之末，在有丝分裂时间是磷酸化的 • 非磷酸化的pRb在进入S期之前可与几种蛋白质结合调控细胞周
白活化
肿瘤分子诊断技术
10
• 肿瘤抑制基因( tumor suppressor gene) • 在遗传学上，癌基因对细胞的作用是显性作用 ( dominant effect) • 可抑制oncogene作用的基因，称tumor suppressor gene • 抑癌基因的蛋白產物能抑制细胞不正常生长及 抑制细胞癌化 • 遗传学上一般属于阴性 ( recessive) • RB基因 • 视网膜母细胞瘤( retinoblastoma，RB)，一种 侵犯幼儿视网膜膜的肿瘤 • 散发性非遗传的类型最常见，会造成单侧眼睛 病变 • 约1/3的RB病人产生多发性肿瘤，且常造成双眼 的病变，及在同胞兄弟姊妹中可发生同样病变， 家族倾向遗传性
• 受细胞周期素及相对应的细胞周期素依赖激酶 (cyclindependent kinase，CDK)严格调控
• 细胞胞周期的每阶段都有一组 CDKs与cyclins 交互作用 来调控
• CDK的磷酸化及cyclin-CDK抑制剂(CKIs)的活化都会影 响细胞周期
肿瘤分子诊断技术
4
• 癌症相关基因
达的调控
• 利用FISH相关技术检测染色体不稳定性 • 多色荧光FISH (multifluor-FISH) • DNA结构不稳定
微卫星不稳定定 异质性丢失
肿瘤分子诊断技术
17
细胞间期 可表现特征性的ABL-BCR融合基因
肿瘤分子诊断技术
18
肿瘤分子诊断技术
肿瘤分子诊断技术
2
造成癌症的因素列举
遗传因素 一些特殊的基因突变会造成特定的癌症
性别
乳腺癌以女性为主
环境因素 石棉、辐射线、抽烟、油烟
压力
持续的工作压力
食品添加剂 亚硝酸的添加
病毒感染 HPV与子宫颈癌
药物
雌激素替代疗法与乳腺癌
生活方式 运动不足和不当饮食
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3
• 细胞周期的调控因素
• 两个alleles都发生缺失
• 一个allele上发生错义点突变，会抑制另一个正常野生型基因的 功能
肿瘤分子诊断技术
14
• 正常细胞中，p53的量都很低 • DNA损伤时，p53就大量增加，造成
• 生长的停止或细胞凋亡( apoptosis) • p53就激活p21蛋白质关闭细胞周期
• p21蛋白质是一个CDK 的抑制因子 • 可结合CDK2、CDK4、CDK6，并抑制它们的活性 • 细胞进入S期以前，得以修护受损伤的DNA • 若细胞已将进入S期，已不能修护受损伤的DNA，则p53起动细 胞凋亡
• 集落刺激因子1受体(CSF1R)基因相当， CSF1R是一种促进骨髓中多 种细胞分裂的生长因子
肿瘤分子诊断技术
7
细胞内信号传递系统( Intracellular signal transduction systems)
• RAS家族是信号传递通路G-protein的成份，藉由跨膜蛋白与Gprotein的结合将信号传至核内