硝化细菌的分离纯化
实验硝化细菌实验报告
一、实验目的1. 了解硝化细菌的基本特性及其在水质净化中的作用。
2. 掌握硝化细菌的培养方法及观察指标。
3. 探讨硝化细菌在不同环境条件下的生长情况。
二、实验材料与仪器1. 实验材料：硝化细菌菌种、纯净水、氨水、亚硝酸钠、硝酸钾、氯化钠、葡萄糖、琼脂、pH试纸等。
2. 实验仪器：恒温培养箱、培养皿、移液枪、烧杯、试管、显微镜、pH计等。
三、实验方法1. 硝化细菌的分离与纯化（1）取一定量的土壤样品，加入无菌水，搅拌均匀。
（2）取适量土壤悬液，接种于琼脂平板上，加入氨水作为氮源。
（3）将平板放入恒温培养箱中培养，观察菌落生长情况。
（4）挑取单菌落，接种于新的琼脂平板上，重复步骤（3），直至获得纯化硝化细菌。
2. 硝化细菌的生长曲线测定（1）将纯化后的硝化细菌接种于装有适量纯净水的小试管中。
（2）分别加入不同浓度的氨水作为氮源，设置对照组（不加氨水）。
（3）将试管放入恒温培养箱中培养，定期取样，测定硝化细菌的OD值。
（4）以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制硝化细菌的生长曲线。
3. 硝化细菌在不同环境条件下的生长情况观察（1）将纯化后的硝化细菌接种于装有适量纯净水的小试管中。
（2）分别加入不同浓度的亚硝酸钠、硝酸钾、氯化钠等物质，模拟不同环境条件。
（3）将试管放入恒温培养箱中培养，定期取样，观察硝化细菌的生长情况。
四、实验结果与分析1. 硝化细菌的分离与纯化实验过程中，成功分离出纯化硝化细菌，菌落呈白色，表面光滑。
2. 硝化细菌的生长曲线测定实验结果显示，硝化细菌在氨水浓度为0.5mg/L时生长速度最快，OD值达到最大值。
生长曲线呈典型的S型，表明硝化细菌在适宜的条件下具有较好的生长性能。
3. 硝化细菌在不同环境条件下的生长情况观察实验结果表明，硝化细菌在亚硝酸钠浓度为0.1mg/L、硝酸钾浓度为0.5mg/L、氯化钠浓度为0.5mg/L时生长情况较好，生长速度较快。
在较高浓度的亚硝酸钠、硝酸钾、氯化钠等物质下，硝化细菌生长受到抑制。
培养硝化细菌的方法
培养硝化细菌的方法硝化细菌是一类重要的微生物，它们在自然界中起着至关重要的作用。
硝化细菌通过氧化反应将氨氮转化为硝酸盐，这是氮循环中的一个重要环节。
在农业生产和环境保护中，培养硝化细菌具有重要意义。
下面我们将介绍一些培养硝化细菌的方法，希望能对大家有所帮助。
首先，选择合适的培养基是培养硝化细菌的关键。
一般来说，硝化细菌的培养基主要包括碳源、氮源、磷源、微量元素和pH缓冲剂。
常用的硝化细菌培养基包括KNO3为氮源的硝化细菌培养基、NH4Cl为氮源的硝化细菌培养基等。
在选择培养基时，要根据具体的硝化细菌种类和培养条件进行合理选择。
其次，控制好培养条件也是培养硝化细菌的关键。
硝化细菌对温度、pH值、氧气含量等环境因素有一定的要求。
一般来说，硝化细菌的适宜生长温度在25-30摄氏度之间，适宜的pH值在7-8之间，适宜的氧气含量在5-10%之间。
因此，在培养硝化细菌时，要根据具体的硝化细菌种类和培养条件进行合理的温度、pH值和氧气含量的控制。
最后，采取适当的培养方法也是培养硝化细菌的关键。
常用的硝化细菌培养方法包括液体培养和固体培养两种。
液体培养适用于硝化细菌的快速生长和大量培养，而固体培养适用于硝化细菌的分离和纯化。
在进行培养时，要注意无菌操作，避免外源污染，保证培养的纯度和可重复性。
总之，培养硝化细菌是一个复杂而又重要的工作。
选择合适的培养基、控制好培养条件、采取适当的培养方法，这些都是培养硝化细菌的关键。
希望大家能够根据这些方法，成功地培养出高质量的硝化细菌，为科研和生产做出贡献。
硝化细菌的富集培养,分离纯化
硝化细菌的富集培养,分离纯化硝化细菌将氨氧化为硝酸的过程。
19世纪以前，人们把硝酸盐看作是化学作用的产物，即空气中的氧和氨经土壤催化形成。
1862年L.巴斯德首先指出硝酸盐的形成可能是微生物作用的结果。
1877年，德国化学家T.施勒辛和A.明茨用消毒土壤的办法，证实了氨被氧化为硝酸的确是生物学过程。
1891年，С.Н.维诺格拉茨基用无机盐培养基成功地获得了硝化细菌的纯培养，最终证实了硝化作用是由两群化能自养细菌进行的。
先是亚硝化单胞菌将铵氧化为亚硝酸；然后硝化杆菌再将亚硝酸氧化为硝酸。
这两群细菌统称硝化细菌。
其作用过程如下：硝化细菌从铵或亚硝酸的氧化过程中获得能量用以固定二氧化碳，但它们利用能量的效率很低，亚硝酸菌只利用自由能的5～14％；硝酸细菌也只利用自由能的5～10％。
因此,它们在同化二氧化碳时，需要氧化大量的无机氮化合物。
土壤中硝化细菌的数量首先受铵盐含量的影响，一般耕地里，每克土中只有几千至几万个。
添加铵盐即可使其数量增至几千万个。
土壤中性偏碱，通气良好，水分为田间持水量的50～70％，温度为10～30℃时，最适宜硝化细菌的生长繁殖，铵盐也能迅速被转化为硝酸盐。
自然界中,除自养硝化细菌外,还有些异养细菌、真菌和放线菌能将铵盐氧化成亚硝酸和硝酸，异养微生物对铵的氧化效率远不如自养细菌高，但其耐酸，并对不良环境的抵抗能力较强，所以在自然界的硝化作用过程中，也起着一定的作用。
--------------------------------------------------------------------------------氨在微生物作用下氧化为硝酸的过程。
通常发生在通气良好的土壤、厩肥、堆肥和活性污泥中。
作用机理硝化作用由自养型细菌分阶段完成：第一阶段为亚硝化，即氨氧化为亚硝酸的阶段。
参与这个阶段活动的亚硝酸细菌主要有5个属：亚硝化毛杆菌属(Nitrosomonas) ；亚硝化囊杆菌属(Nitrosocystis)；亚硝化球菌属(Nitrosococcus)；亚硝化螺菌属(Nitrosospira)和亚硝化肢杆菌属(Nitrosogloea)。
硝化菌的分离鉴定及多菌复配处理医药化工废水
硝化菌的分离鉴定及多菌复配处理医药化工废水摘要：氨氮是水环境污染重要元素之一，高浓度氨氮不但会导致水体富营养化，而且对水生动植物和微生物也有毒害作用。
而医药化工废水具有高色度、高盐度、成分复杂、高氨氮、难生化降解、生物毒性大等特点，比其他工业污水更难处理，目前去除医药化工废水中氨氮主要有物理法、化学法、生物法，生物法因其具有经济高效、安全无污染等优点，而逐渐成为了研究和应用热点。
但依靠单一微生物处理废水氨氮难以有效去除，筛出不动杆菌属在48h氨氮去除率仅为41.33%。
而生物脱氮中复合菌株之间能通过功效互补、共同作用高效地完成氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮的降解。
关键词：硝化菌的分离鉴定;多菌复配处理;医药化工废水引言随着《水污染防治行动计划》的出台，污水排放标准提高，对氮排放总量要求明确，严格控制在15毫克/升(标准1)和20毫克/升(标准2)以下。
按照传统的生物发光法，高氯酸盐工艺由氨、硝基胺和抗心律失常三种工艺组成。
氨是一种通过良好的氧或微生物氧化将一氧化氮分解成铵化废水的过程。
氮转化过程中，硝酸铵转化为硝化甘油，废水中硝化甘油(良好营养)转化为NO2-N和NO3-N。
硝酸盐制取过程中，废水中的NO2-N和NO3-N被取代为抗氧化盐悲观主义(同时也取代了决定惩罚的细菌)。
废水处理中无机氮的沉积主要是通过硝化和硝化进行的。
1医药化工废水的基本特征1.1COD和BOD5含量高化学废水中COD浓度远低于COD5浓度，但在医药和化学废水中COD浓度和COD5含量相对较高。
制药、化学、工业废水未经处理排入水体，会消耗正常水域的大量氧气，导致水体缺氧。
一旦水中氧气含量不足，动植物和其中的微生物将难以生存，这对正常水域也有很大影响。
第二，医药化工废水中存在大量物质，相当复杂，水体的异性也比较大，高浓度有机物也可以在水中大量存在，容易造成水体中各种养分比例的逐渐失衡。
1.2无机盐浓度高经过化学反应，酸碱溶液大量用于医药化工生产大量无机盐溶液。
两株异养硝化—好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定和特性研究
两株异养硝化—好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定和特性研究一、本文概述本文旨在探讨两株异养硝化-好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定及其特性研究。
异养硝化-好氧反硝化细菌是一类特殊的微生物，能够在好氧条件下进行硝化和反硝化过程，对于氮循环和环境保护具有重要意义。
本文首先通过分离和筛选方法，从自然环境中获取两株具有异养硝化-好氧反硝化功能的细菌，并对其进行初步的生理生化特性分析。
接着，采用分子生物学手段对这两株细菌进行鉴定，明确其分类地位和系统发育关系。
在此基础上，进一步深入研究这两株细菌的生长特性、硝化反硝化性能、以及环境因子对其生长和代谢的影响。
本文的研究结果不仅有助于深入了解异养硝化-好氧反硝化细菌的生物学特性和生态学功能，同时也为该类微生物在环境修复、污水处理等领域的应用提供理论支撑和实践指导。
二、材料与方法为了分离和筛选异养硝化—好氧反硝化细菌，我们从多个不同的生态环境中采集了土壤和水样，包括污水处理厂、河流、湖泊以及农田土壤等。
为了培养和筛选目标细菌，我们使用了多种培养基，包括常规的好氧反硝化培养基和异养硝化培养基。
这些培养基根据细菌的生长特性和需求进行了优化。
实验过程中使用了多种分子生物学试剂，如PCR引物、DNA提取试剂盒等。
同时，还使用了多种仪器，如PCR仪、凝胶电泳仪、微生物培养箱等。
采用稀释涂布法将采集的样品接种到含有相应培养基的平板上，通过观察菌落的形态、大小和颜色等特征，初步筛选出具有异养硝化—好氧反硝化能力的细菌。
通过形态学观察、生理生化特性分析以及分子生物学方法（如16S rDNA序列分析）对筛选出的细菌进行鉴定。
对筛选和鉴定出的细菌进行详细的特性研究，包括生长曲线测定、异养硝化速率测定、好氧反硝化速率测定等。
还研究了环境因子（如温度、pH、碳源和氮源等）对细菌生长和硝化反硝化活性的影响。
实验数据采用统计学方法进行分析，以揭示细菌的生长规律和硝化反硝化特性。
还通过图表等形式直观地展示了实验结果。
高效硝化细菌的分离与鉴定
有生长; 肉汤培养基中 N- 7、S- 3、S- 9 有生长; 硝化细菌 分离培养基中都可以生长, 筛选得到生长快、菌落大的 12 株菌来进行下一步的实验。 21 3 在不同 NO-2 浓度下菌落生长情况
高的同源性, 但是它的电子供体是对苯二酚, 不能氧化
细胞色素 C, 因此 命名该酶为 qN or, 由 qN or 基因编
码[ 7] 。2001 年, G esche 等[ 8] 利 用 N or 对 来自纯培养
和环境样品的系统关系进行了研究。
采用脱氧胆酸钠处理, 再用葡萄糖离心分离, 将得
到的酶液进行 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
取 N- 1、N- 2、N- 5、S- 2 4 株菌通过 30 mL / 300 mL 摇瓶发酵 5 d 后( 每样 2 个平行) , 在 540 nm 下检测
自然。
硝化细菌 分离 培养 基 ( g ) : N aN O 2 1, M gSO4 #
7H 2 O 01 03, M nSO 4 # 4H 2 O 01 01, K 2 H PO 4 # 3H 2 O 01 75, N aH 2 PO 4 # 2H 2 O 01 25, 葡萄糖 1, 加去离子水
至 1000 m L, pH 值自然。 人工模拟 富集 培养 液 ( g ) : N aN O 2 1, M gSO4 #
条件, 同 时加入少 量的次氯 酸钠抑制 其它杂菌 的生 长[ 4] , 以达到富集硝化细菌的目的。
对富集培养装置中总体积为 2 L 的培养液, 每隔
几天用格利斯试剂检验
N
O
2
的变化情 况, 或用国标
高效异养硝化菌的分离鉴定及硝化特性
高效异养硝化菌的分离鉴定及硝化特性郭万茹㊀崔康平∗㊀郭㊀志㊀陈㊀鹏㊀贾永豪(合肥工业大学资源与环境工程学院,合肥230009)摘要:利用异养硝化培养基从南淝河底泥中分离筛选得到一株具有较高硝化性能的好氧异养硝化细菌XH3㊂根据菌落形态㊁生理生化分析㊁16S rDNA 序列的系统发育分析,对菌株XH3进行鉴定,结果表明,菌株XH3为枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis.)㊂研究菌株XH3生长特性以及硝化性能,并将该菌应用于黑臭水体进行脱氮处理㊂菌株在培养基中48h 最大氨氮去除率为93.14%,最适培养条件是碳源为柠檬酸钠㊁C /N 比=10,接种量5%㊁温度35ħ㊁pH =8㊂处理实际黑臭水体48h 氨氮最大去除率61.49%㊂实验通过筛选得到的菌株XH3具有较强异养硝化性能且对黑臭水体氨氮具有一定转化率,丰富了在利用异养硝化细菌处理实际污染水体脱氮方面的研究,为解决实际污染水体㊁黑臭水体修复提供理论依据㊂关键词:异养硝化细菌;筛选;鉴定;氨氮;黑臭水体SCREENING AND IDENTIFICATION OF AN EFFICIENT HETEROTROPHICNITRIFYING BACTERIA AND THE STUDY OF ITSNITRIFICATION CHARACTERIZATIONGuo Wanru㊀Cui Kangping ∗㊀Guo Zhi㊀Chen Peng㊀Jia Yonghao(College of Resources and Environmental Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)Abstract :A heterotrophic nitrifying bacteria XH3with higher nitrification performance was isolated and screened from thesediment of Nanfei River by using heterotrophic nitrification medium.According to the colony morphology,physiological andbiochemical analysis,and phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence,the strain XH3was identified.The results showedthat the strain XH3was Bacillus subtilis.The growth characteristics and nitrification performance of strain XH3were studied,and the strain was applied to black odorous water for denitrification treatment.The maximum ammonia-nitrogen removal rate of the strain XH3was 93.14%in the culture medium for 48h,and the optimal conditions were sodium citrate as carbon source,C /N ratio =10,inoculation amount 5%,temperature 35ħ,pH =8.The maximum removal rate of ammonia nitrogen was61.49%after 48h treatment.Keywords :heterotrophic nitrifying bacteria;screening;identification;ammonia nitrogen;polluted water㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀收稿日期:2019-10-30第一作者:郭万茹(1996-),女,硕士研究生,主要研究方向为环境微生物㊂gwr1002039127@∗通信作者:崔康平(1969-),男,博士,教授,主要研究方向为水处理技术和水污染环境修复技术㊂cuikangping@0㊀引㊀言近年来,河流水体污染问题日益突出,2018年全国地表水监测的1935个水质断面(点位)中,劣Ⅴ类比例为6.7%(环境保护部,2018)㊂氮元素污染物是造成水体中污染的重要原因之一[1],过量的氮元素导致水体透明度降低,水体环境恶化,严重影响水体中动植物的生存,水体中氮元素的去除引起了广泛的关注㊂虽然世界各国在废水氨氮污染的治理上投入大量精力,但河流中氨氮污染情况仍然明显存在[2]㊂南淝河作为巢湖入河污染量最大的河道,总氮污染占到流域总入湖量的三分之一以上,因此南淝河的污染治理对改善巢湖水质起到了极为关键的作用㊂生物脱氮技术(BNR)由于效率高㊁成本低㊁不会造成二次污染在污水处理中受到广泛应用[3]㊂在传统生物脱氮系统中,通常从氨氮(NH +4)开始,通过自养硝化细菌在有氧条件下转化为硝酸盐(NO -3)㊁亚硝酸盐(NO-2),最后通过异养反硝化细菌在厌氧条件下转化为氮气(N2)达到从系统中去除的目的[4]㊂但传统自养硝化细菌生长缓慢㊁脱氮效果不明显,难以形成优势菌种;相反,异养硝化细菌具有生长速度快㊁对高浓度氨氮适应性强和脱氮效率高等优点,并且异养硝化细菌能够同步进行有机物降解㊁硝化作用㊁反硝化作用,成为近年来河流脱氮的热点[1]㊂自20世纪70年代起,Verstraete等人成功分离第一株异养硝化菌Arthrobacter sp[5]㊂以及Roberston等人首次发现兼具异养硝化好氧反硝化能力的菌Paracoccus之后[6],许多异养硝化好氧反硝化菌株被分离出来并作为生物脱氮技术的潜在微生物进行深入的研究[7],如不动杆菌属(Acinetobacter sp.)[6],假单胞菌属(Pseudomonas stutzeri)[8],副球菌属(Paracoccus sp.)[1],芽孢杆菌属(Bacillus sp.)[9]等㊂本文通过从南淝河底泥中分离筛选出一株具有高脱氮效率的异养硝化细菌,具有较强异养硝化能力,命名为XH3㊂通过生理生化特性测定和16S rDNA鉴定,判定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis.)㊂同时对脱氮过程中菌株的生长趋势和脱氮情况进行了分析并探究了XH3在不同条件下的脱氮效率,深入了解XH3的脱氮特性,并将其分离菌株应用于受污染的南淝河水体,对其脱氮效果进行评价,为脱氮菌株的实际应用及理论研究奠定基础,为南淝河水体治理提供新思路㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料1.1.1㊀实验样品南淝河中氮元素有机质含量较为丰富,满足异养硝化菌生长条件及环境,故异养硝化菌筛选所用样品为南淝河河底10cm以内底泥沉积物㊂1.1.2㊀培养基异养硝化细菌富集培养基:Na3C6H5O7㊃2H2O 2.17g,(NH4)2㊃SO40.5g,K2HPO40.8g,MgSO4㊃7H2O0.4g,NaCl0.4g,FeSO4㊃7H2O0.04g,CaCl2㊃H2O0.03g,定容至1L,pH7.0~7.2;加入20g琼脂即成固体培养基㊂异养硝化细菌分离培养基:Na3C6H5O7㊃2H2O 2.17g,(NH4)2㊃SO40.5g,K2HPO40.6g,MgSO4㊃7H2O0.2g,NaCl0.4g,FeSO4㊃7H2O0.04g,定容至1L,pH7.0~7.2;加入20g琼脂即成固体培养基㊂所有培养基使用前均在121ħ湿热灭菌30min㊂1.2㊀方法1.2.1㊀高效异养硝化菌富集与筛选取南淝河底泥沉积物接种于无菌水中,摇床培养3h,取出静置㊂将菌悬液接种至150mL灭菌后的异养硝化菌富集培养液中,相同条件下培养48h㊂取富集菌液进行梯度稀释后,采用稀释涂布平板法接种至异养硝化菌分离固体培养基中培养48h后,观察菌落形态,挑选典型菌落在平板上进行划线分离,为纯化所筛菌株,进行多次划线分离㊂将分离纯化后得到的单一菌株接种至锥形瓶中异养硝化细菌培养基进行摇床培养,测定培养基中氨氮浓度,筛选出氨氮去除率最高的菌株进行下一步实验㊂1.2.2㊀菌株鉴定观察培养基上单菌落形态,通过革兰氏染色在显微镜下观察菌株形态以及革兰氏染色情况,采用酚-氯仿-异戊醇法提取硝化菌XH3基因组DNA,以基因组DNA为模板扩增16S rDNA,扩增引物为细菌通用引物27f及1492R,测序所得16S rDNA序列,应用BLAST,与NCBI数据库中已知菌种序列进行同源性分析,系统发育树构建采用MEGA4软件完成㊂1.2.3㊀脱氮性能探究1)菌株脱氮曲线及生物量测定㊂将初筛菌株以5%接种量接种至锥形瓶中液体分离培养基,于35ħ㊁180r/min恒温摇床培养48h,每隔4h取样,检测培养液中光密度(OD600)㊁NH+4-N㊁NO-3-N以及NO-2-N的含量,测定菌株脱氮曲线以及生物量㊂2)菌株脱氮性能影响因素㊂为探究碳源㊁C/N比㊁接种量㊁温度㊁初始pH以及初始氨氮浓度对优势菌株脱氮性能的影响,确定优势菌株最佳培养生长条件,在上述实验接种和培养基的基础上,设计系列单因素实验:1)碳源种类:柠檬酸钠㊁丁二酸钠㊁琥珀酸钠㊁葡萄糖㊁蔗糖;2)C/N比: 2㊁6㊁10㊁15㊁20;3)接种量:1㊁3㊁5㊁7㊁10%;4)培养温度:10㊁20㊁30㊁35㊁40ħ;5)初始pH:5㊁6㊁7㊁8㊁9;6)初始氨氮浓度:25,500,1000,1500mg/L,在180r/min 条件下恒温振荡培养48h,定期取样测定培养液氨氮含量㊂3)菌株对黑臭水体处理效果㊂于春季采集南淝河水样,样品采集后4ħ保存备用,取样点水样COD均值为39.76mg/L,氨氮浓度为10.07mg/L,将筛选得到具有较强异养硝化能力的菌株接种至液体培养基,培养至对数期,取适量菌液离心后用生理盐水清洗两遍,然后直接投加至装受污染水体的锥形瓶中,在35ħ㊁180r /min 条件下恒温振荡培养48h,每隔8h 取样,测定培养液中光密度以及氨氮浓度㊂将菌种以相同方式投加至装有黑臭水体的锥形瓶中,向被污染河水中投加定量柠檬酸钠,定时检测培养液中光密度及氨氮浓度㊂1.3㊀分析方法OD600通过在600nm 处吸光度表示;NH +4-N 通过纳氏试剂光度法测定;NO -3-N 采用酚二磺酸光度法测定;NO -2-N 通过N -(1-萘基)-乙二胺光度法测定㊂氨氮转化率通过公式(1)计算得出:T =(N 0-N x )/N x ˑ100%(1)式中:T 为氨氮转化率;N 0表示培养液中初始氨氮浓度,mg /L;N x 表示培养液中任一时间的氨氮浓度,mg /L㊂2㊀结果与讨论2.1㊀异养硝化菌的筛选以南淝河底泥为菌种来源,通过稀释涂布平板法和划线分离法初步得到能够在硝化细菌固体分离培养基上生长的7株菌株㊂将初筛的7株菌株以5%接种量分别接种至100mL 硝化细菌液体培养基中,在35ħ㊁180r /min 条件下培养,检测其NH +4-N 的浓度㊂通过图1可以看出,初筛得到的7株菌株均有一定的氨氮降解能力,以0号未接种菌种的空白培养液做对比发现,3号㊁7号菌株氨氮降解能力较强,均达到80%以上,菌株生长能力较为旺盛,3号菌株对氨氮的去除效率最高,高达93.51%㊂因此挑选3号菌株斜面保存,作为本实验后续研究对象,并命名为XH3㊂图1㊀初筛硝化细菌脱氮率对比2.2㊀菌株鉴定通过分离筛选得到7株异养硝化菌株,选取硝化性能最好的菌株XH3进行后续实验㊂图2为菌株XH3菌落形态,菌株形态小而突起或大而平坦,呈圆形,边缘整齐,颜色灰白不透明,表面湿润光滑且粘稠,革兰氏染色呈阳性㊂对菌株进行16S rDNA 测序,所得序列通过BLAST 对比,发现与枯草芽孢杆菌具有99%相似度,构建系统发育树如图㊂图2㊀菌落形态图图3㊀菌株XH3的16S rDNA 基因系统发育树2.3㊀菌株脱氮性能研究2.3.1㊀菌株脱氮曲线及生物量测定将初筛菌株XH3以5%接种量接种于硝化细菌液体培养基中,定期取样,检测其培养液中光密度(OD600)以及NH +4-N㊁NO -3-N 以及NO -2-N 的含量,测定菌株脱氮曲线以及生物量,分析菌株XH3生长趋势以及氨氮转化情况㊂如图4所示,XH3生长呈现4个不同的阶段:适应期㊁对数增长期㊁稳定期㊁衰亡期㊂菌株在接种后4h 为生长延滞期,在4h 后生长迅速进入对数增长期,到24h 生物量达到最大值,随即进入稳定期和衰亡期,由此看出菌体XH3生长能力旺盛,能够在短暂时间内进入对数增长期㊂除此之外,可以看出XH3的氨氮降解速率在8h 前呈现缓慢的状态,之后,氨氮迅速下降,在28h 时氨氮浓度达到最低,氨氮去除率为93.14%,28h 后氨氮浓度略有升高,可能由于培养基中营养物质大量减少,细菌死亡,造成氨氮去除率降低且氨氮稍略有升高的现象[10]㊂从图中可以看出,氨氮去除主要发生在对数期且稍有滞后,该结果与目前研究得出的异养硝化菌脱氮作用主要发生在对数期的结果基本一致[1,2,8-10]㊂另外,菌株XH3培养过程中,在氨氮短时间内大量去除的同时,硝酸盐氮和亚硝酸盐氮并没有大量积累,而是维持在低浓度的水平,这与Yang 等人研究的Acinetobacter sp.JR1类似[11],表明本研究筛选所得菌株XH3具有异养硝化能力㊂图4㊀菌株XH3生长曲线及氨氮转化动力学曲线2.3.2㊀碳源对菌株脱氮性能影响碳源作为微生物能量的重要来源,碳源种类直接影响微生物生长及代谢活动,且不同菌株对不同有机碳源的利用情况有较大差异[1],从而影响微生物脱氮效率㊂图5为菌株XH3对不同有机碳源的利用情况㊂从图5可以看出,XH3以柠檬酸钠㊁丁二酸钠㊁琥珀酸钠㊁葡萄糖㊁蔗糖为唯一碳源时,对氨氮均具有一定的去除效果,但小分子碳源更有利于XH3吸收利用㊂XH3在以柠檬酸钠㊁丁二酸钠㊁琥珀酸钠为碳源时,脱氮率显著高于其他碳源,分别为87.44%㊁77.36%㊁75.11%㊂其中,XH3在以柠檬酸钠为唯一碳源,氨氮去除率最高,在32h 达到85.40%,期间最大去除速率为7.08mg /(L ㊃h)㊂而蔗糖作为大分子碳源不能很好被XH3吸收利用,氨氮去除率仅为39.60%㊂通过XH3对碳源的利用情况可以看出,碳源类型对菌株异养硝化活性至关重要[12],小分子碳源更易于被XH3同化利用,更有利用菌株异养硝化作用[13],这与胡杰等的Pseudomonas sp.WUST7[14]的研究结果保持一致㊂在处理实际水样时,也可以通过补给小分子碳源的方式,提高菌株的异养硝化性能,促进脱氮效率[15]㊂通过分析碳源对菌株XH3脱氮性能的影响,发现柠檬酸钠更有利于菌株XH3的生长代谢,故选取柠檬酸钠作为XH3异养硝化的最佳碳源㊂图5㊀碳源对菌株XH3脱氮性能影响2.3.3㊀C /N 对菌株脱氮性能影响图6㊀C /N 对菌株XH3脱氮性能影响由于XH3为异养硝化菌,在脱氮同时也要消耗有机物,碳源不足时,没有足够能源供菌体生长,进而影响菌体脱氮效率[16],所以一定范围内提高C /N 会提高硝化菌的氨氮去除率㊂通过调整培养基中柠檬酸钠含量改变C /N,分析不同C /N 对菌株XH3对氨氮去除效率,结果如图6㊂C /N =2时,去除率仅为49.85%,当C /N 持续上升,菌株对氨氮降解能力明显增强,当C /N =10时,去除率达到最大为82.22%㊂继续提高C /N,可以发现氨氮去除率几乎不变或略有降低,这与王弘宇等研究Pseudomonas sp.C3发现在最佳C /N 时,持续提高C /N,脱氮率基本没有变化的结论一致[17]㊂通常在实际废水的处理中,高C /N 会造成出水COD 过高,影响水质,所以在实际处理中要考虑选取最合适㊁最经济的C /N [18],通过图6可以看出,C/N=10已达到最大氨氮去除率,进一步提高C/N,脱氮效果提升不显著,所以C/N10已可满足XH3硝化过程对C/N要求,故选择C/N为10最为合适且经济㊂2.3.4㊀接种量对菌株脱氮性能影响接种量的大小会影响培养液中生物量浓度,进而影响菌株生长繁殖[19]㊂高浓度生物量会使菌体在短时间内提高脱氮率,而接种量过低则会导致菌体适应期延长,影响脱氮率㊁延长脱氮时间[20]㊂由图7可以看出,菌株以不同接种量接种培养后,对培养液中氨氮均有一定程度的去除,但是当接种量为1%时,接种量过小,培养液中生物量过少,菌株适应期延长,氨氮去除率低仅为46.00%;逐步提高菌种接种量,菌株对氨氮的去除率提高,在接种量为5%时,氨氮去除率在48h达到最高,为81.26%;而当接种量继续增加时,生物量增加,氨氮在短时间内大量去除,接种量为7%和10%时,16h氨氮去除率分别为48.23%和54.19%,相较接种量为5%时16h氨氮去除率有明显提升,但由于生物量过大,培养基中营养物质大量消耗,制约菌体继续生长,且会使菌体发生自溶,导致菌体活性降低,从而导致16h后氨氮去除速率降低㊂图7㊀接种量对菌株XH3脱氮性能影响2.3.5㊀温度对菌株脱氮性能影响温度高低直接影响微生物生长活动及代谢,温度过高或过低都会影响菌株的酶活性,导致微生物生长代谢缓慢或停滞生长,进一步影响菌株的脱氮效果[21]㊂另外每个微生物最适温度各不相同,图8反映了XH3脱氮性能和温度之间的关系㊂由图8可以看出,菌株XH3适应温度范围广,在10ħ到40ħ范围内均能生长,并对氨氮有一定的去除效果㊂当温度为10ħ时,菌株生长相对缓慢,酶活性受到影响,对氨氮去除能力最差,去除率仅为26.58%,当温度逐渐提高,菌株脱氮能力提高,在35ħ时达到最高氨氮去除率为75.71%㊂而当温度继续上升至40ħ时,由于温度过高,此时菌株的内源呼吸率增大,衰减系数增大,导致XH3脱氮能力有所下降[22]㊂图8㊀温度对菌株XH3脱氮性能影响2.3.6㊀初始pH对菌株脱氮性能影响图9㊀初始pH对菌株XH3脱氮性能影响初始pH值影响菌株酶活性㊁菌体细胞的结构以及菌株对营养物质吸收,进而影响菌株对氨氮的降解率[22]㊂为了探究初始pH对XH3硝化性能的影响,设置初始pH为5㊁6㊁7㊁8㊁9,XH3脱氮动力学曲线如图9所示㊂由图9可以看出,XH3在pH值5~9时,均可以良好生长且对氨氮具有一定降解率㊂但当pH 为弱酸性时,XH3降解率较低均小于50.00%㊂随着pH升高,XH3降解率提高,在pH=8时,菌株XH3对氨氮去除率达到最大为83.10%,这可能是因为硝化过程产酸,弱碱性环境更有利硝化反应的进行,继续提高pH,氨氮去除率随之下降,这是因为过高pH会影响菌株生长,从而造成氨氮去除率下降㊂本次实验结果表明,弱碱性环境更适应于菌株XH3的生长代谢,有利于硝化过程的进行,这与huang等研究结论一致[23],但当培养基碱性过大,会抑制菌体生长及酶活,影响菌株硝化性能,故选择pH=8作为菌株XH3培养的最适pH㊂2.3.7㊀NH+4-N负荷对菌株脱氮性能影响不同初始NH+4-N浓度对菌株XH3的脱氮性能影响如图10所示㊂菌株XH3具有较广的氨氮适应范围,在25~1500mg/L范围内均可正常生长,且均表现出较为良好的硝化性能㊂当初始氨氮浓度低于500mg/L时,菌株表现出较好的硝化性能,对氨氮的去除率均能达到80.00%以上,氨氮浓度继续升高时,菌株脱氮能力下降,氨氮去除率降低,在初始氨氮浓度1000mg/L和1500mg/L时,氨氮去除率为75.54%和60.86%,但氨氮去除速率仍保持增大趋势,此时氨氮去除率较低的原因可能是处理时间不足[24]㊂上述实验结果表明,虽然菌株XH3具有较广的氨氮适应范围,但是在高浓度氨氮条件下,菌株表现出的脱氮性能有所下降,但较高的氨氮降解速率使XH3具有潜在处理高浓度氨氮废水的工程应用价值[25]㊂图10㊀初始NH+4-N对菌株XH3脱氮性能影响2.3.8㊀XH3对黑臭水体处理效果通过上述实验发现,菌株XH3在不同探究条件下对液体培养基中的氨氮均有较好去除率,但是菌株XH3在实际污水中能否生存且具有良好去除效果及其对污水的耐受程度直接影响菌株XH3的工程应用前景㊂因此,我们用菌株对南淝河水体进行处理,结果如图㊂氨氮空白组为取自南淝河的水体样品,不做处理㊂氨氮实验组为接种菌体XH3的南淝河水体,氨氮对照组为接种菌体XH3且加入柠檬酸钠碳源的南淝河水体,OD600为氨氮实验组菌体生物量㊂取样点水样初始氨氮为10.07mg/L,实验组中,由于菌泥携带少量培养基,导致接种后初始氨氮浓度高于对照组的现象,但菌株在有机物相对缺乏的河水中仍能正常生长,菌株XH3接种至河水后至16h,为细菌生长适应期,菌株XH3在此阶段逐步适应贫瘠营养环境,随后,菌株数量随时间推移呈上升趋势,菌株开始大量繁殖,其生长情况与河水氨氮降解过程保持一致,证明河水中氨氮去除的主要原因是微生物同化作用[26]㊂32h后微生物进入衰亡期,菌株XH3逐渐减少,说明培养环境中有机物㊁氨氮不能满足微生物生长繁殖的需要,与此同时,氨氮降解过程减缓,去除速率降低,48h氨氮去除率为32.85%,虽然菌株XH3对实际河水有部分去除率,但仍远低于在培养基中对氨氮的去除㊂因此设置对照组,通过添加小分子碳源柠檬酸钠,促进微生物脱氮过程,在加入柠檬酸钠后, 48h脱氮率由32.85%提高至61.94%㊂进一步证明实际河水中可能缺乏能够被XH3利用的有机物,菌株XH3脱氮过程对小分子碳源依赖性较强㊂实验证明在实际废水处理时,通过投加小分子碳源的方式可以大幅提高菌株硝化性能,提升氨氮去除率[27]㊂图11㊀菌株对实际水体处理效果图3㊀结㊀论1)通过富集培养和平板划线法,从南淝河底泥中筛选出一株具有异养硝化性能的菌株XH3,通过对XH3进行生理生化鉴定和生物学鉴定,判断XH3为枯草芽孢杆菌㊂2)通过探究XH3脱氮特性,发现XH3硝化作用主要发生在对数增长期,24h内,氨氮浓度可由146.20mg/L下降到10.02mg/L,去除率达到93.14%,且在硝化过程中,几乎没有硝酸盐氮及亚硝酸盐氮的积累,具有良好异养硝化性能㊂在探究XH3培养条件时发现:XH3最佳碳源为柠檬酸钠,最适C/N比为10,菌株XH3对温度㊁pH具有较广的适应范围,最适温度为35ħ,最适pH为8㊂3)将菌株XH3通过直接投加方式处理实际黑臭水体,由于实际水体营养物质相对缺乏,脱氮率较低,但投加柠檬酸钠后,48h脱氮率由32.85%提升至61.49%,表明菌株对小分子碳源具有较强依赖性,补充充足小分子碳源时,菌株硝化性能增强,脱氮效率提升㊂本文研究筛选的菌株XH3在培养基中对氨氮去除率最高达93.14%,表现出较好的异养硝化性能,与国内外报道的异养硝化能力优异的菌株不相上下㊂菌株XH3对黑臭水体氨氮的转化,丰富与拓展了在利用异养硝化细菌处理实际污染水体脱氮方面的研究,为解决实际污染水体㊁黑臭水体修复提供理论依据㊂今后工作应该对脱氮条件进行进一步优化㊁完善以异养硝化菌为主体的各种脱氮方式,指导异养硝化细菌在工程上更深层次的应用㊂参考文献[1]㊀潘丹,黄巧云,陈雯莉.两株异养硝化细菌的分离鉴定及其脱氮性质[J].微生物学报,2011,51(10):1382-1389. 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高效硝化细菌的分离与鉴定
高效硝化细菌的分离与鉴定硝化作用和硝化细菌简介硝化是自然界中氮循环过程中的一个重要环节。
在这个过程中，氨被氧气氧化成亚硝酸盐和硝酸盐，称为氧化硝化作用。
硝化作用是氮循环中不可或缺的过程，它可以有效地将氨转化成需要的亚硝酸盐和硝酸盐，供植物进行氮素营养的吸收利用。
硝化细菌是参与这个过程的重要微生物，它们能够利用氨氮，进行硝化作用，将氨氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐。
硝化细菌的分类和分布硝化细菌是一类具有氮素自营能力的原核生物，根据研究内容的需要和研究对象的不同，硝化细菌可分为铵化细菌和硝化细菌。
铵化细菌主要能够利用几种有机氮化合物，而硝化细菌则利用氨来进行硝化作用。
硝化细菌广泛存在于土壤、水体和废水处理系统等多种环境中，是自然界中一类十分重要的微生物。
硝化细菌的分离方法硝化细菌的分离方法一般可以分为三个步骤：富集、筛选和纯化。
富集硝化细菌在自然环境中常常处于低密度状态，因此富集方式的选择对分离效果具有重要意义。
最常用的硝化细菌富集培养基是K_2HPO_4-[(NH_4)_2SO_4], NaHCO_3, CaCO_3, MgSO_4.7H_2O和人工海盐等基础培养基。
富集过程中应注意环境氧气需充足，避免长时间培养，以保持细胞处于较低阶段生长状态。
筛选富集后的培养物需要进行筛选，以去除与硝化作用无关的细菌，为硝化细菌留下更大的空间和机会。
筛选方法主要有传统的分离纯化法和现代的DNA分子克隆技术，其中后者具有高效率、选择性强等优点。
纯化纯化过程主要是将被筛选出的细菌紫外线照射处理，在无菌环境下进行更加严格的筛选，并使用转染、PCR和DNA序列鉴定等技术手段，通过对分离出的细菌进行分子鉴定，根据细菌形态特征和分子生态学信息等分析结果，最终确保分离出的细菌纯净度和鉴定准确性。
硝化细菌鉴定方法鉴定硝化细菌的方法主要包括基于形态学和生理学特征的传统鉴定和分子生物学鉴定两类方法。
其中传统鉴定方法可以分为形态学、生理学和生化学三个部分，通过这些基本特征和行为特征，初步鉴定出硝化细菌种名，并进一步进行深入的研究。
一株硝化细菌的分离鉴定及应用
一株硝化细菌的分离鉴定及应用
一、硝化细菌的分离鉴定
1、对硝化细菌的采集：采集硝化细菌的样本是分离鉴定的前提，能够
直接代表被研究的硝化细菌，硝化细菌样本可以直接从自然界中采集，也可以从培养基中采集。
2、硝化细菌样品的处理：采集到的硝化细菌样本要经过处理，以便符
合实验要求。
通常，需要先将样品稀释到10-5或10-6，然后将其置于
相应的细菌培养基中培养，以获得足够的菌落数量。
3、硝化细菌的鉴定：细菌分离出来了，就要进行鉴定，可以通过考察
菌落形态、培养基的选择性反应、生理特性、DNA比对的鉴定等方法
进行鉴定。
二、硝化细菌的应用
1、自由氧化去除鱼肝石油：经过微生物方法处理，可以有效的减少石
油中的自由氧化产物，硝化细菌可以作用在石油上，去除自由氧化物质，从而达到减少污染的效果。
2、促进污泥脱水脱色：硝化细菌具有腐蚀性，能够有效的分解混凝土
中的残留物，促进污泥的脱水，减少有机物的含量，从而达到脱色的
目的。
3、污泥处理去除固形废物：污泥中的固形废物是一个严重的污染源，
硝化细菌能够把污泥中的有机物转化成无机物，减少污泥中固形废物
的含量，从而达到处理去除固形废物的效果。
4、生物制氨：硝化细菌能够把氨基酸和氯气转化成氨，从而实现生物化学制氨。
此外，硝化细菌还可以用于低碳烃氧化、硫酸盐还原、氰化物氧化、烯醇及咪唑衍生物的氧化等。
垃圾中硝化细菌的分离及筛选课题研究报告
垃圾中硝化细菌的分离及筛选课题研究报告硝化细菌系指利用氨或亚硝酸盐作为主要生存能源，以及能利用二氧化碳作为主要碳源的一类细菌。
硝化细菌是古老的细菌之一，其广泛分布于土壤、淡水、海水及污水处理系统中，却在自然界鲜少大量出现，原因在于硝化细菌的分布会受到许多环境因素的影响，如氮源、温度、氧气浓度、渗透压、酸碱度和盐度等等。
本课题研究所用硝化细菌是从垃圾中提取的。
硝化细菌分为亚硝化菌与硝化菌，亚硝酸细菌主要有 5个属：亚硝化毛杆菌属(Nitrosomonas) ；亚硝化囊杆菌属(Nitrosocystis)；亚硝化球菌属(Nitrosococcus)；亚硝化螺菌属(Nitrosospira)和亚硝化肢杆菌属(Nitrosogloea)。
其中，尤以亚硝化毛杆菌属的作用居主导地位，常见的有欧洲亚硝化毛杆菌 (Nitrosomonas europaea)等[19]。
硝酸细菌主要有3个属：硝酸细菌属(Nitrobacter)；硝酸刺菌属 (Nitrospina)和硝酸球菌属(Nitrococcus)。
其中以硝酸细菌属为主，常见的有维氏硝酸细菌(Nitrobacter winogradskyi)和活跃硝酸细菌 (N. agilis)等[19]。
亚硝化菌的主要功能是将氨氮转化为亚硝酸盐；硝化菌的主要功能是将亚硝酸盐转化为硝酸盐。
由于亚硝化菌和硝化菌具有这些功能，使得硝化细菌在环境保护和水产养殖等领域具有重要作用，并已逐渐成为水产养殖界的热门话题，它在水产养殖中的重要性开始引起广泛的注意。
可以说，迄今为止，在大规模、集约化的水产养殖模式中，如果没有硝化细菌参与其中的净水作用，想获得成功的养殖，是相当困难的。
尤其是现代集约化养殖长期累积了大量养殖生物排泄物，所有有机物的排泄物，甚至其尸体，在异养性细菌的作用下，其中的蛋白质及核酸会慢慢分解，产生大量氨等含氮有害物质。
氨在亚硝化菌或光合细菌作用下转化成亚硝酸，亚硝酸与一些金属离子结合以后可以形成亚硝酸盐，而亚硝酸盐又可以和胺类物质结合，形成具有强烈致癌作用的亚硝胺。
硝化细菌的分离与鉴定
硝化细菌的分离与鉴定要筛选生长速度快、硝化作用强的硝化细菌用于水产养殖水处理。
硝化细菌包括亚硝化菌和硝化菌两个生理菌群，分别可将水中的氨态氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐。
实验结果表明经5周培养，亚硝化菌可使培养液中的氨氮含量下降到60％，硝化菌可使培养液中的亚硝酸盐含量下降到60％。
实验可通过测定培养液中亚硝酸盐的含量变化来测定细菌的氨转化作用或硝化作用。
关键词：硝化菌，亚硝化菌，硝化作用，筛选。
氨氮和亚硝酸盐都是在水产养殖过程中产生的有毒物质，且亚硝酸盐还是强烈的治癌物质，因此如何降解这两种物质，是科学工作者近年来的工作重点。
硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其主要特性是自养性，生长速率低，好氧性，依附性和产酸性等。
可通过NH4+→NO2- → NO3-这一过程将NH4+转化为NO3-。
能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养殖业及环境保护具有重要意义。
硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接影响硝化效果和生物脱氨的效率。
研究表明，水体中硝化细菌的浓度对生物脱氨具有十分重要的意义，由于大多数硝化细菌生长缓慢，硝化及脱氨效果欠佳，处理水产养殖污水的效果不是很好。
因此筛选出生长速率高硝化作用强度大的硝化细菌有很大的用途。
本文对硝化细菌的研究主要在富集培养和固定化细胞方面，能够有效提高硝化细菌的产率和硝化细菌的利用率。
通过富集培养的硝化细菌浓度是未经富集培养的12.5～20.0倍，利用细胞固定化技术可使氨氮去除率提高16.5个百分点。
国外在硝化细菌的培养方面的研究已有一些专利技术，其中一些已形成工业化生产，但产品价格较昂贵，并且必须不断向反应器中补充流失的硝化细菌。
硝化作用包括两个步骤：氨转化为亚硝酸盐和亚硝酸盐转化为硝酸盐，这两个步骤分别由亚硝化菌和硝化菌完成，至今还未发现有能将氨直接转化为硝酸盐的细菌。
氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。
对于硝化细菌来说生长环境中的温度对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。
异养硝化细菌的分离及其硝化特性实验研究
异养硝化细菌的分离及其硝化特性实验研究
异养硝化细菌的分离及其硝化特性实验研究
摘要：采用将传统微生物学方法与现代分子生物学手段相结合的新型异养硝化细菌的分离筛选方法,从具有80.1%的SND效果的MBR 系统中分离筛选出2株异养硝化细菌,通过生理生化实验、16S rDNA 的序列分析,认定为属新报道的异养型硝化细菌.通过批式试验考察了分离纯化得到的异养硝化细菌的硝化性能.结果表明,Bacillus sp.LY及Brevibacillus sp.LY具有异养微生物的'性质,在充分利用有机碳进行有氧呼吸的同时还具有较强的硝化及脱氮能力:24d好氧培养后,COD的去除率分别为71.7%及52.6%;氨氮的转化率分别为78.2%及51.2%;总氮的转化率分别为69.2%及35.6%.作者：林燕孔海南何义亮严立李春杰 LIN Yan KONG Hai-nan HE Yi-liang YAN Li LI Chun-jie 作者单位：上海交通大学环境科学与工程学院,上海,200240 期刊：环境科学ISTICPKU Journal：ENVIRONMENTAL SCIENCE 年，卷(期)：2006, 27(2) 分类号：X703.1 关键词：分离 Bacillus sp.LY Brevibacillus sp.LY 异养硝化硝化特性。
硝化细菌分离与鉴定
硝化细菌分离与鉴定硝化细菌-一类专性化能自养（无机营养）细菌，包括亚硝化菌和硝化细菌两个菌群，一般种类不能生长在有机培养基中。
在有氧的条件下，亚硝化细菌群将氨氮转化亚硝酸氮，硝化细菌群将亚硝酸氮转化硝酸氮，两者常生长在一起。
硝化细菌分离比较困难，由于它生长缓慢，平均代时10-20h以上，且不同菌株间差异较大。
1.硝化细菌分离：1.1分离材料：氨场周围的土壤池塘或污水出水口污泥1.2培养基：1.2.1富集培养基：亚硝化细菌培养基：1）硫酸铵5g/l 磷酸二氢钾0.7g/l 硫酸镁0.5g/l 氯化钙0.5g/l 用5％碳酸钠调PH8.0 （硝化细菌用亚硝酸钾2 g/l代替硫酸铵5g/l）2）硫酸铵2g/l 氯化钠0.3g/l 硫酸亚铁0.03g/l磷酸氢二钾1.0g/l 硫酸镁0.03g/l 碳酸氢钠1.6g/l PH7.5-8.01.2.2分离培养基：亚硝化细菌培养基：甲液：硫酸铵11.0g 硫酸镁1.4g硫酸亚铁0.3g蒸馏水100ml乙液：磷酸二氢钾1.36g 蒸馏水100ml甲：乙=9:1 PH8.0-8.2硝化细菌培养基：硫酸铵2.0g磷酸氢二钾1.0g/l硫酸镁0.5g/l氯化钠2.0g/l硫酸亚铁0.4g/l碳酸钙5.0g/lPH7.5-8.0用亚硝酸钾2.5 g代替硫酸铵11.0g。
为增加硝化细菌的分离效果，在培养液中添加1％粉状碳酸钙和0.04ml/100ml微量元素溶液。
1.2.3BPY(肉膏蛋白胨酵母膏培养基)牛肉膏5g/l 酵母膏5g/l 蛋白胨10g/l 氯化钠5g/l 葡萄糖5g/l PH7.0（检查硝化细菌纯度用）1.3富集培养：取泥样1.0g或1.0ml活性污泥接入30ml/250ml三角瓶或10ml/18x180mm试管中，28-30℃130r/min震荡培养，每隔几天用格利斯试剂在白瓷板上检验亚硝酸根的生成，培养7-8d后培养液遇格利斯试剂呈红色，表明有亚硝酸盐存在。
活性污泥中硝化细菌的分离及其硝化强度的初步研究_孙玉华
N O-2
and
N
O
3
to
T ime
of
N -2
St rain
图
6 N
-3
菌
株溶
液中
N
O
2
及
N
O
3
的浓
度变化
Fig. 6 T he Concent ration Changes of
N O-2
and
N
O
3
to
T ime
of
N -3
St rain
别下降至 345 mg / L 和 83 mg / L , 即硝化率 分别为 65. 5% 和 93. 7% ( 图 5、图 6) 。 硝化率的高低及硝化细菌数量是判断除 氮效果好坏的重要依据, 硝化速率高再加上 硝化细菌数量高除氮效果就好。N -1 为亚硝 化单胞菌, 可以把氨态氮转化成亚硝酸态氮。 N-2、N-3 两株为硝化细菌, 能把亚硝酸态氮 转化成硝酸态氮。在这三株菌中 N-3 的硝化 率最高, 在水质处理上应用前景最大。在实际 生产上, 为彻底去除氨及亚硝态氮, 可以把这 三株菌通过合理配比混合, 还可再结合固定 化技术[ 9] , 使氮的去除率更加理想。
参 考文 献
[ 1] 臧 维玲等. 亚硝 酸盐和 氨对罗 氏沼 虾幼体 的毒 性. 上海水产大学学报, 1996, 5( 1) : 15-21
[ 2] K laver , A . L . , M ar rhew s. R. A . Effects of o x ytet racycline on nitr ifica tio n in a mo del a quatic sy stem. Aquaculture , 1994, 123( 3 4) : 237-247
化能自养细菌分离纯化
化能自养微生物的分离与纯化一、实验目的1. 学习土壤中采样、富集培养、分离纯化硝化细菌。
2. 学习硅胶平板制备，了解培养硝化细菌的培养基制备和培养方法。
二、实验原理硝化细菌是化能自养菌类群中主要类群之一。
包括亚硝化细菌和硝化细菌(或称亚硝酸氧化细菌)两个亚群。
培养硝化菌的温度，因菌源而异，从中温环境下分离的菌株，最适生长温度为26～28℃，从高温环境下分离的菌株，40℃下生长良好。
三、实验材料1. 菌源土样合成氨车间周围和堆放合成氨场地周围土样。
2. 培养基硝化细菌增殖培养基，硝化细菌分离培养基（见附录Ⅲ），牛肉膏蛋白胨培养基，马丁培养基，马铃薯葡萄糖培养基。
3. 试剂格里斯氏试剂（亚硝酸盐试剂），二苯胺－硫酸试剂（硝酸盐试剂），见附录Ⅲ。
4. 其他物品无菌水，无菌培养皿，无菌移液管，无菌微口滴管，无菌玻璃涂棒，透析袋，比色板，培养箱等。
四、实验内容1. 采样采集土样，选合成氨车间和堆放合成氨场地周围土样。
2. 富集培养称取土样1 g，接入到盛有20 mL硝化细菌增殖培养液的250 mL锥形瓶中，28℃振荡培养10～14d，每隔几天在白磁板上分别加2～3滴格里斯氏试剂及二苯胺-硫酸试剂，然后用无菌滴管取出1滴增殖培养液的培养物加于上面两试剂中，搅和均匀。
检查增殖培养液中NO2-的减少（溶液由红色、粉红色变为无色）和NO3-的形成（NO3-氧化二苯胺的特有反应，溶液由无色变为深蓝色）。
3. 分离纯化取富集培养液，通CO2气体30 min，然后静置30 min，再通过硅胶平板分离法进行分离纯化。
①制取硅胶平板取等体积的盐酸(HCl比重1.09)和硅酸钠(比重1.10)溶液，徐徐加入，缓慢混合，均匀搅拌，分装于100～200mL透析袋中，蒸馏水中透析48 h，其间换蒸馏水6～8次，待透析袋内的硅酸钠溶液无色透明后，高压蒸汽灭菌或过滤除菌。
吸取预先配制并已灭菌的硝化细菌分离培养基1mL、硅酸钠溶液10mL于无菌培养皿内，静置片刻，待凝固后即可使用。
硝化菌培养工艺流程
硝化菌培养工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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硝化细菌和反硝化细菌的分离纯化方案(新)
硝化细菌相关培养基：1、富集培养基：硝化细菌富集培养基： KNO2 0.5g; KH2PO4 0.07g;MgSO4 7H2O 0.055g; CaCl2 2H2O 0.05g;蒸馏水100ml; 用5%Na2CO3调pH至8.0.亚硝化细菌富集培养基： (NH4)2SO4 0.5g; KH2PO4 0.07g;MgSO4 7H2O 0.055g; CaCl2 2H2O 0.05g;蒸馏水100ml; 用5%Na2CO3调pH至8.0.2、分离固体培养基：硝化细菌平板分离固体培养基： KNO2 0.05 g； K2HPO4 3H2O 0.13 g；MgSO4 7H2O 0.03 g； NaCl 0.12 g；FeSO4 7H2O 0.02 g； CaCO3 (MgCO3) 0.1 g；NaHCO3 0.2 g； H2O 100 mL；琼脂：1.5—2.0g pH 7.5 ~ 8.0．亚硝化细菌平板分离固体培养基：(NH4) 2SO4 0.05 g； K2HPO4 3H2O 0.13 g；MgSO4 7H2O 0.03 g； NaCl 0.12 g；FeSO4 7H2O 0.02 g； CaCO3 (MgCO3) 0.1 g；NaHCO3 0.2 g； H2O 100 mL；琼脂：1.5—2.0g pH 7.5 ~ 8.0．3杂菌检验培养基：（1）检查异养型细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（100ml）：酵母粉：0.5g 胰蛋白胨：1.0g氯化钠：1.0g 琼脂：1g(2)检查酵母菌：豆芽汁葡萄糖培养基： 10%豆芽浸汁100ml 葡萄糖5g 琼脂1.5—2.0g自然PH(3)检查霉菌:马铃薯葡萄糖培养基: 20%马铃薯浸汁100ml 葡萄糖2g 琼脂1.5—2.0g自然PH1、富集培养基：反硝化细菌富集培养基: KNO3 2 g, 柠檬酸钠5 g, K2HPO4 1 g, MgSO4·7H2O0.2g, 微量元素蒸馏水1 000mL, 121 ℃ , 灭菌20min.2、反硝化细菌分离培养基： KNO3 2 g, 柠檬酸钠5 g, K2HPO4 1 g, 微量元素MgSO4·7H2O 0.2g, 蒸馏水1 000mL, 琼脂121 ℃ , 灭菌20 min.反硝化细菌为异养型菌，故可以在LB培养基上培养。
活性污泥中高效硝化细菌的分离与初步鉴定
理生 化性 质 和硝化 能力 等方 面 进行 了研 究与初 步 鉴 定， 以期 为 污水生 物脱 氮提 供 理论依 据 和实 际参 考 。
取青 岛市泥布湾生 活污水处理厂 活性污 泥 １ ｍＬ 加入 到盛有 １ ５ ０ ｍ Ｌ硝化 细菌无机盐基础 培养基三角
瓶中， ２ ８ ℃条件 下 摇 床 培 养 。每 隔 几 天 用 格 里 斯 试
有机 培养基 上 生 长 。已有 大 量 的研 究 表 明 ， 理想 的
类 的健康 。 因此 ， 处 理高浓 度含氮 废水 、 控制 水体 富 营 养化 已经成 为世 界性环 境 问题 。
目前 ， 含 氮废水 的主要 处理 方法 有生物 法 、 吹脱
法、 离子 交换 法 、 折点 加 氯 法 等口 Ｊ ， 其 中生 物 法 由于 具 有适用 范 围广 、 投 资少 、 操 作 简单 、 无 二次 污染 、 废
第 ２ ０卷 第 １ 期
《硝化细菌的分离、培养和观察》活动课教案
《硝化细菌的分离、培养和观察》活动课教案一、活动目的：硝化细菌是生物界中一类特殊的生产者，能进行硝化作用参与氮素的转化，在高中生物学教学中占有一定的地位。
通过实验，既可增加学生对硝化细菌的认识，又能培养学生的操作能力和科研能力，激发学生的学习兴趣。
二、活动安排：学生利用第二课堂分组活动，活动时间为3～4周。
三、活动器材：恒温箱、高压灭菌锅、天平、量杯、玻棒、大试管、三角瓶（250毫升）、显微镜、白瓷板、α—萘胺试剂、二苯胺试剂、醋酸、磺胺酸，革兰氏试剂、PH试纸、(NH4)2SO4、NaH2PO4、K2HPO4、Na2CO3、MnSO4·4H2O、MgSO4·7H2O、NaNO2、NaOH(0.1N)、HCl(0.1N)、浓H2SO4、蒸馏水。
四、活动过程：（一）配制硝化细菌培养液：（二）灭菌将配制好的培养液分装在大试管中，每管约15毫升，堵上包有纱布的棉塞，放在高压灭菌锅中，15磅30分钟灭菌备用。
（三）样品采集：采用公园下层湖水约100毫升即可（强调学生注意安全！）。
（四）接种：用吸管吸取样品，每支试管接1～2毫升样品。
（五）培养：置于28～30℃恒温箱中静置7～10天。
（六）结果测定：1、配制试剂：（1）α—萘胺试剂的配制：用天平称取α—萘胺5克于100毫升醋酸(5N)中，用玻棒搅拌溶解。
（2）二苯胺试剂的配制：用天平称取0.5克二苯胺溶于100毫升浓浓H2SO4中，再加入20毫升蒸馏水中搅拌稀释。
2、NO2-的检验：在瓷盘小孔内各加入1滴α-萘胺试剂，然后加少许试验液，变红色的为(+)，未变色(黄色)的为(-)。
3、NO3-的检验：（1）先除去培养物中的NO2-：方法是在培养物中加入醋酸5～8滴，使之酸化，再加入数粒磺胺酸，当停止放出气体时，再加入一粒磺胺酸，此过程中NO2-转化为N2而逸出。
用α-萘胺试剂检查，如不出现红色，证明培养物中不含NO2-。
（2）检验NO3-的产生：方法是吸取培养物少许于白瓷板凹窝中，滴入二苯胺试剂，如有蓝色出现，即证明有NO3-的积累。
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材料与方法
样品
检测用试剂
1、Griess 试剂
溶液I称取磺胺酸0.5g，溶于150mL醋酸溶液(30％)中，保存于棕色瓶中。
溶液II称取α-萘胺0.5g，加入50mL蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％醋酸溶液150mL，保存于棕色瓶中。
格里斯试剂检验亚硝化菌方法：用滴管吸取2滴细菌培养液置于白瓷板上，
依次滴加格里斯试剂Ⅰ、Ⅱ各2滴，出现红色反应说明培养液中含有亚硝酸，有
亚硝酸细菌存在。
2、二苯胺-硫酸试剂（检测菌液中是否存在硝酸盐证明硝化细菌是否存在）
称取二苯胺1g，溶于20mL蒸馏水中，然后徐徐加入浓硫酸lOOmL，保存于棕色瓶中。
由于亚硝基、硝基均能与二苯胺试剂起蓝色显色反应，所以在测定硝基前，必须去除培养液中的亚硝基。
采用尿素+浓硫酸去除亚硝基是简单有效的方法，硝化菌检验具体操作步骤：取细菌培养液lml移入干净试管中，向试管中放半药勺的尿素混匀，然后再向试管中滴加10滴浓硫酸，此时可以看到试管中有大量气泡生成，反应很强烈，不断振动试管，使反应充分进行直至没有气泡产生。
然后取试管中液体两滴，置于白瓷板上，用格里斯试剂检验是否变红，如果颜色没有变化，再滴加二苯胺试剂，如果变蓝，说明有硝基产生，有硝化菌存在。
培养基
1、LB（检验硝化细菌的纯度不生长表纯）
酵母粉 5g 蛋白胨 10g
NaCl 10g 蒸馏水 1000ml
灭菌前pH=7.3
2、KM（检验硝化细菌的纯度不生长表纯）
酵母浸提物 0.5g 蛋白胨 0.5g
牛肉膏 0.5g 蒸馏水 1000ml
灭菌前pH=7.3
3、PDA（检验硝化细菌的纯度不生长表纯）
马铃薯(除皮) 200g 蔗糖(或葡萄糖) 20g
水 1000mL
灭菌前pH自然
硝化细菌培养基
富集培养
取样品0.5g于有50ml灭菌培养基的250ml三角瓶在恒温30℃，摇床转速为150r／min，条
件下富集培养。
每周一次，用Griess试剂(或二苯胺-硫酸试剂)定性检测HN02(或HN03)的生
成情况，判断富集情况的好坏。
培养1周后用灭菌的5%的硫酸铵溶液补料一次。
培养2周后，转接新鲜的培养基，接种量20％(因为硝化细菌生长特别缓慢，为了尽量富集多的培养物，
故选择较高的接种量)。
如此反复多次移植传代，但第二次传代后,接种最要减少,以0.5-1ml为宜。
经过7次传代后,转接后期补料频率可以加大。
经此过程后定量测定每个富集样品中
HN02(或HN03)的量，选择富集最好的样品进行下一步的分离操作。
硝化细菌的分离培养
选取颜色显深的富集培养菌液，采用划线法进行平板分离培养，在30℃恒温条件下黑暗培养
平板要密封防止平板干裂，观察菌落生长情况，待长出针尖大小的菌落后，挑取单菌落至分
离平板，重复划线分离3次，分离培养过程中设空白对照。
如果平板内仍然有其他菌落生成
可以将其疑似硝化细菌菌落挑在液体培养基中再次培养并检测重复划线分离直到得到形态一
致的菌落为止。
纯度检测
将筛选的菌株用LB、KM或PDA培养基划线培养验证是否有杂菌若有杂菌则需要进一步划
线分离，直到分离到纯菌。
菌落形态观察
将的到的菌落进行观察并记录做表。
细胞形态观察
将筛选的细胞进行革兰氏染色在油镜下观察并记录。
参照伯杰氏细菌鉴定手册
保藏
1、斜面保藏
将已纯化的硝化细菌菌液用接种环在硝化细菌固体培养基斜面上划线，于30℃培养，待长出
菌落后，置于4"C冰箱冷藏，3一4月转接1次。
2、室温直接保藏
将培养好的硝化细菌菌液直接置于室温避光保藏即可。
每隔3～4月转接1次。