硝化细菌的分离纯化
材料与方法
样品
检测用试剂
1、Griess 试剂
溶液I称取磺胺酸0.5g，溶于150mL醋酸溶液(30％)中，保存于棕色瓶中。
溶液II称取α-萘胺0.5g，加入50mL蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％醋酸溶液150mL，保存于棕色瓶中。
格里斯试剂检验亚硝化菌方法：用滴管吸取2滴细菌培养液置于白瓷板上，
依次滴加格里斯试剂Ⅰ、Ⅱ各2滴，出现红色反应说明培养液中含有亚硝酸，有
亚硝酸细菌存在。
2、二苯胺-硫酸试剂（检测菌液中是否存在硝酸盐证明硝化细菌是否存在）
称取二苯胺1g，溶于20mL蒸馏水中，然后徐徐加入浓硫酸lOOmL，保存于棕色瓶中。
由于亚硝基、硝基均能与二苯胺试剂起蓝色显色反应，所以在测定硝基前，必须去除培养液中的亚硝基。采用尿素+浓硫酸去除亚硝基是简单有效的方法，硝化菌检验具体操作步骤：取细菌培养液lml移入干净试管中，向试管中放半药勺的尿素混匀，然后再向试管中滴加10滴浓硫酸，此时可以看到试管中有大量气泡生成，反应很强烈，不断振动试管，使反应充分进行直至没有气泡产生。然后取试管中液体两滴，置于白瓷板上，用格里斯试剂检验是否变红，如果颜色没有变化，再滴加二苯胺试剂，如果变蓝，说明有硝基产生，有硝化菌存在。培养基
1、LB（检验硝化细菌的纯度不生长表纯）
酵母粉 5g 蛋白胨 10g
NaCl 10g 蒸馏水 1000ml
灭菌前pH=7.3
2、KM（检验硝化细菌的纯度不生长表纯）
酵母浸提物 0.5g 蛋白胨 0.5g
牛肉膏 0.5g 蒸馏水 1000ml
灭菌前pH=7.3
3、PDA（检验硝化细菌的纯度不生长表纯）
马铃薯(除皮) 200g 蔗糖(或葡萄糖) 20g
水 1000mL
灭菌前pH自然
硝化细菌培养基
富集培养
取样品0.5g于有50ml灭菌培养基的250ml三角瓶在恒温30℃，摇床转速为150r／min，条
件下富集培养。每周一次，用Griess试剂(或二苯胺-硫酸试剂)定性检测HN02(或HN03)的生
成情况，判断富集情况的好坏。培养1周后用灭菌的5%的硫酸铵溶液补料一次。培养2周后，转接新鲜的培养基，接种量20％(因为硝化细菌生长特别缓慢，为了尽量富集多的培养物，
故选择较高的接种量)。如此反复多次移植传代，但第二次传代后,接种最要减少,以0.5-1ml为宜。经过7次传代后,转接后期补料频率可以加大。经此过程后定量测定每个富集样品中
HN02(或HN03)的量，选择富集最好的样品进行下一步的分离操作。
硝化细菌的分离培养
选取颜色显深的富集培养菌液，采用划线法进行平板分离培养，在30℃恒温条件下黑暗培养
平板要密封防止平板干裂，观察菌落生长情况，待长出针尖大小的菌落后，挑取单菌落至分
离平板，重复划线分离3次，分离培养过程中设空白对照。如果平板内仍然有其他菌落生成
可以将其疑似硝化细菌菌落挑在液体培养基中再次培养并检测重复划线分离直到得到形态一
致的菌落为止。
纯度检测
将筛选的菌株用LB、KM或PDA培养基划线培养验证是否有杂菌若有杂菌则需要进一步划
线分离，直到分离到纯菌。
菌落形态观察
将的到的菌落进行观察并记录做表。
细胞形态观察
将筛选的细胞进行革兰氏染色在油镜下观察并记录。参照伯杰氏细菌鉴定手册
保藏
1、斜面保藏
将已纯化的硝化细菌菌液用接种环在硝化细菌固体培养基斜面上划线，于30℃培养，待长出
菌落后，置于4"C冰箱冷藏，3一4月转接1次。
2、室温直接保藏
将培养好的硝化细菌菌液直接置于室温避光保藏即可。每隔3～4月转接1次。
微生物菌种的分离和纯化方法
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，
关于乳酸菌的分离与发酵的实验
乳酸菌的分离与发酵实验 生命科学学院2009级四班2组 傅盛晟 摘要：本文对乳酸菌的分离与发酵实验进行阐述，从市售酸乳中分离保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，并进行分离与鉴定，最后进行酸乳的发酵实验！实验主要是分离与纯化，鉴定与发酵，最后用分离的菌进行酸乳发酵在与市售酸乳混合菌种进行比较。 关键词：酸奶，乳酸菌，分离鉴定，发酵 微生物在厌氧条件下，分解己糖产生乳酸的作用，称为乳酸发酵。能够引起乳酸发酵的微生物种类很多，其中主要能利用可发酵糖生产乳酸的细菌，即乳酸细菌。常见的乳酸细菌属于链球菌属（Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobaterium)和明串珠菌属(Leuconostoc)等。乳酸细菌多是耐氧菌，只在厌氧条件下才进行乳酸发酵，所以在筛选乳酸茵或需要进行乳酸发酵的情况下，应保证提供厌氧条件。 酸奶是以全脂牛奶等为原料，经乳酸细菌发醇而成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发醇制品，是具有一定保健作用的食品。酸奶发酵过程通常是由双菌或多菌的混合培养实现的。其中的杆菌先分解酪蛋白为氨基酸和小肽．由此促进了球菌的生长，而球菌产生的甲酸又刺激了杆菌产生大量乳酸和部分乙醛，此外球菌还产生了双乙酰这类风味物质，因此，达到了稳定状态的彻合发酵。酸乳发酵的基本原理是通过乳酸细菌发酵牛奶中的乳糖产生乳酸，乳酸使牛奶中的酪
蛋白(在全乳中的质量分数为2．9％，在乳蛋白中的质量分数为85％)变性凝固而使整个奶液呈凝乳状态。同时，通过发酵还可以形成酸奶特有的风味和香味(与形成乙醛、丁二酮等有关)。酸奶发酵中的主要生物化学变化是：乳酸菌将牛奶中的乳糖发酵成乳酸使其PH降至酪蛋白等电点(4.6)附近(4.0~4.6)从而使牛奶形成凝胶状；其次，乳酸菌还会促使部分酷蛋内降解、形成乳酸钙和产生一些脂肪、乙醛、双乙酰和丁二酮等风味物质。这就是酸奶具有良好的保健作用和适合广大乳糖不耐症患者饮用的主要原因。按凝固状态可将酸奶分为搅拌型酸奶和凝固型酸奶，两者工艺过程基本相似，本实验主要是凝固型酸奶的制作方法。 一，材料与方法 1.材料和用具 1）菌种，嗜热乳酸链球菌，保加利亚乳酸杆菌，这两类菌种可从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离。 2）培养基参照相关文献和老师的建议以及乳酸菌生长需要复杂营养物质和多种生长因子，我们选用如下培养基： 分离纯化培养基：脱脂乳平板培养基 鉴定培养基：脱脂乳试管 其他：脱脂乳粉或脱脂牛奶，蔗糖等 3）仪器及用具恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，培养皿，试管，三角瓶若干 2.培养条件 培养温度：40℃ 厌氧条件：由于乳酸菌的发酵与分离纯化都需要厌氧条件，而实验室没有专门的厌氧培养箱，所以我们采用在培养皿和发酵杯上套上保鲜膜制造无氧环境。 培养时间：在培养基上分离培养的时间为2天左右，酸乳发酵为12个小时左右 方法和步骤 1）乳酸菌的分离纯化 101-~105-，取其中的 (1)分离。取市售新鲜酸乳或泡菜的酸液稀释 104-、105-2个稀释度的稀释液各0.1~0.2mL，分别接入脱脂乳琼脂培养基上，用无菌玻璃刮铲依次涂布，或者直接用接种环沾取原液，平板划线分离，置40℃下培养48h，如出现圆形稍扁平的淡黄色菌落及其周围培养基变为黄色者，可初步定为乳酸菌。 (2)鉴别。选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8~24h。若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞呈杆状或链球状(两种形状的菌种均分别选入)，革兰氏染色阳性，则可将其接种到试管斜面上连续传代4~6次，最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。 2）乳酸菌饮料—酸乳的发酵
乳酸菌菌种的分离筛选方法
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
微生物菌种的分离和纯化方法
在从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。 不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特分子生物学的研究及应用中，防止其他微生物的混入。定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”， 、用固体培养基分离和纯化1 有繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、便成称为菌落。一定形态结构的子细胞生长群体，当固体培养基表面众多菌落连成一片时，可以成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，以及许多真菌和单细胞藻鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、为对该微生物进行分类、所谓平板，类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。固体培养基用琼脂或其它凝这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。建立的采用Kock最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100 稀释倒平板法1.1 ），然后分别取不、1:100001:1000首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培同稀释液少许，与已熔化并冷却至如果养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。这个菌落可能就是由一个在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，稀释得当，细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。涂布平板法1.2 且采用稀释因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，因此在微生物倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，再用无菌玻璃涂棒将将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，制成无菌平板，冷却凝固后，）。菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（图1供参 考． 涂布平板法1 图平板划线法1.3 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，），微
硝化细菌的分离纯化
材料与方法 样品 检测用试剂 1、Griess 试剂 溶液I称取磺胺酸0.5g，溶于150mL醋酸溶液(30％)中，保存于棕色瓶中。 溶液II称取α-萘胺0.5g，加入50mL蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％醋酸溶液150mL，保存于棕色瓶中。 格里斯试剂检验亚硝化菌方法：用滴管吸取2滴细菌培养液置于白瓷板上， 依次滴加格里斯试剂Ⅰ、Ⅱ各2滴，出现红色反应说明培养液中含有亚硝酸，有 亚硝酸细菌存在。 2、二苯胺-硫酸试剂（检测菌液中是否存在硝酸盐证明硝化细菌是否存在） 称取二苯胺1g，溶于20mL蒸馏水中，然后徐徐加入浓硫酸lOOmL，保存于棕色瓶中。 由于亚硝基、硝基均能与二苯胺试剂起蓝色显色反应，所以在测定硝基前，必须去除培养液中的亚硝基。采用尿素+浓硫酸去除亚硝基是简单有效的方法，硝化菌检验具体操作步骤：取细菌培养液lml移入干净试管中，向试管中放半药勺的尿素混匀，然后再向试管中滴加10滴浓硫酸，此时可以看到试管中有大量气泡生成，反应很强烈，不断振动试管，使反应充分进行直至没有气泡产生。然后取试管中液体两滴，置于白瓷板上，用格里斯试剂检验是否变红，如果颜色没有变化，再滴加二苯胺试剂，如果变蓝，说明有硝基产生，有硝化菌存在。培养基 1、LB（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 酵母粉 5g 蛋白胨 10g NaCl 10g 蒸馏水 1000ml 灭菌前pH=7.3 2、KM（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 酵母浸提物 0.5g 蛋白胨 0.5g 牛肉膏 0.5g 蒸馏水 1000ml 灭菌前pH=7.3 3、PDA（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 马铃薯(除皮) 200g 蔗糖(或葡萄糖) 20g 水 1000mL 灭菌前pH自然 硝化细菌培养基
最新土壤中放线菌的分离与纯化
土壤中放线菌的分离与纯化 实验目的 1掌握放线菌的生长特性，微生物的培养方法。 2掌握微生物实验的基本生物技术，主要包括无菌操作技术，纯种分离技术，纯种培养技术，以及抗生素检测等。 3掌握合成培养基，选择培养基的制备方法。 4学习对微生物实验的中出现问题的分析，解决方法 实验材料 药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂、重铬酸钾 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 实验原理 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒
平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 放线菌可以产生抗生素，抑制其他菌种的生长，故可用金黄色葡萄球菌（G+）和大肠杆菌（G-）作指示菌鉴别放线菌。 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O 作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成 1.高氏一号合成培养基的制备 K2HPO4 ?3H2O 0.125g，可溶性淀粉5g，硝酸钾0.25, MgSO4? 7H2O0.125g， FeSO4?7H2O 0.025g，氯化钠0.125g，琼脂5g，水250ml。 配制时，先依次加入上述药品（除琼脂外）顺序溶解，加入无菌水至250ml，调节pH＝7.4，再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后，121℃灭菌20分钟。 将6套平皿、12只试管灭菌。
硝化细菌的分离与鉴定范文
硝化细菌的分离与鉴定 要筛选生长速度快、硝化作用强的硝化细菌用于水产养殖水处理。硝化细菌包括亚硝化 菌和硝化菌两个生理菌群，分别可将水中的氨态氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐。实验结果 表明经5周培养，亚硝化菌可使培养液中的氨氮含量下降到60％，硝化菌可使培养液中的亚硝酸盐含量下降到60％。实验可通过测定培养液中亚硝酸盐的含量变化来测定细菌的氨转化作用或硝化作用。 关键词：硝化菌，亚硝化菌，硝化作用，筛选。 氨氮和亚硝酸盐都是在水产养殖过程中产生的有毒物质，且亚硝酸盐还是强烈的治癌物质，因此如何降解这两种物质，是科学工作者近年来的工作重点。 硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其 主要特性是自养性，生长速率低，好氧性，依附性和产酸性等。可通过NH4+→NO2- → NO3-这一过程将NH4+转化为NO3-。能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养 殖业及环境保护具有重要意义。硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接 影响硝化效果和生物脱氨的效率。 研究表明，水体中硝化细菌的浓度对生物脱氨具有十分重要的意义，由于大多数硝化细 菌生长缓慢，硝化及脱氨效果欠佳，处理水产养殖污水的效果不是很好。因此筛选出生 长速率高硝化作用强度大的硝化细菌有很大的用途。 本文对硝化细菌的研究主要在富集培养和固定化细胞方面，能够有效提高硝化细菌的产 率和硝化细菌的利用率。通过富集培养的硝化细菌浓度是未经富集培养的12.5～20.0倍 ，利用细胞固定化技术可使氨氮去除率提高16.5个百分点。国外在硝化细菌的培养方面 的研究已有一些专利技术，其中一些已形成工业化生产，但产品价格较昂贵，并且必须 不断向反应器中补充流失的硝化细菌。硝化作用包括两个步骤：氨转化为亚硝酸盐和亚 硝酸盐转化为硝酸盐，这两个步骤分别由亚硝化菌和硝化菌完成，至今还未发现有能将 氨直接转化为硝酸盐的细菌。 氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。对于硝化细菌来说生长环境中的温度 对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。大多数硝化细菌的合适生长温度为10～38
乳酸菌的分离纯化说课讲解
乳酸菌的分离纯化
乳酸菌的分离与纯化 1.实验目的 2.实验材料 2.1试验设备 天平、牛角匙、电炉、 pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、试管、棉塞、培养基、吸管、牛皮纸、线绳、标签、 500mL 锥形瓶两个、 250mL锥形瓶两个、试管20只、 500mL烧杯两个、 250mL 烧杯两个、 100mL烧杯两个、酒精灯、石棉网、接种针（环）。 2.2实验仪器 50L的高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超镜台、光学显微镜、 75%酒精棉、冰箱。 2.3实验药品 新鲜酸奶、脱脂奶粉或全脂奶粉、蔗糖、 1.6%溴甲酚绿乙醇溶液、酵母膏、琼脂、结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95%乙醇、诗坛酸复红染液。 3.试验方法及操作过程 3.1BCG牛乳培养基配方及灭菌 （A）液：脱脂奶粉10克，水50ml，加入1.6%溴甲酚绿乙醇溶液1ml，80℃灭菌20min。 （B）液：酵母膏1克，水50克，琼脂2克，pH6.8，121℃灭菌2.min。 按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照，加琼脂溶化，
加热过程要不断搅拌，可适当补水。琼脂完全溶解后倒入250mL的锥形瓶中，用纱布包扎好（注意不要污染纱布） 再用牛皮纸包扎，贴上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。在高压锅中，在1kg/cm2压力下维持30min。 3.2倒BCG培养基平板的方法 将灭好菌的A液和B液趁热充分混合，点燃酒精灯对周围的空气进行灭菌，并在酒精灯的附近用左手握着平板用拇指和小拇指打开一个小缝，趁热将培养液倒如平板内，倒入的量能使培养基刚要覆盖平板底部，倒好后把平板平放到实验台，轻轻晃动是培养基形成一个平面，等培养基冷却凝固后倒放并贴上标签。（注意：整个实验要在酒精灯附近做，以保证培养基不染菌） 3.3脱脂乳试管的配制与灭菌 直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克，水95克（蔗糖与水的比例在1：10的范围内）的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115℃灭菌15min。 3.4乳酸菌的分离纯化 取市场销售的新鲜的酸奶，分别用接种针接入BCG牛培养基琼脂平板上，40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。 选取乳酸菌典型菌落转致脱脂乳试管中，40℃培养8~24h若牛乳出现凝固，无气泡，显酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代3次，最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。 3.5乳酸发酵及检查
放线菌筛选的一般方法
放线菌筛选的一般方法 摘要：放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。放线菌是革兰氏阳性细菌。因菌落呈放线状而的得名。常以孢子或菌丝状态存在，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。 关键词：放线菌筛选微生物 1 放线菌的情况 放线菌（Actinobacillus）是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。大多数有发达的分枝菌丝。菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约～1微米。可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。是一群革兰氏阳性、高(G+C)mol%含量(>55%)的细菌。放线菌因菌落呈放线状而的得名。 放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等）、维生素（B12）和有机酸等。弗兰克菌属（Frankia）为非豆科木本植物根瘤中有固氮能力的内共生菌。此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。少数放线菌也会对人类构成危害，引起人和动植物病害。因此，放线菌与人类关系密切，在医药工业上有重要意义。 放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。放线菌只是
食品中腐败菌的分离纯化及生物学性状观察
微生物学大实验 食品中腐败菌的分离纯化及生物学性状观察 （标题小四黑体，正文小四宋体，段前、段后0，行距20磅） 专业 班级 姓名 同组人 日期
0 前言 食品腐败变质是指食品受到各种内外因素（例如温度，气体等）的影响，造成其原有物理性质或化学性质发生变化，降低或失去其营养价值和商品价值的过程。食品腐败变质的过程实质上是食品中碳水化合物、蛋白质、脂肪在污染微生物的作用下分界变化、产生有害物质的过程。 本次实验以略微腐烂的苹果、栗子、香蕉，饮料为材料，运用三区划线、倾注、点植、涂布等方法从中分离出腐败菌，观察和分析其菌种及菌落形态。 1 试验材料和仪器设备 1．1试验材料 食材：土豆、苹果、栗子、香蕉、饮料。 试剂：营养琼脂粉、麦芽粉、琼脂粉、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、溴麝香草酚兰溶液、草酸结晶紫、碘液、95%酒精、沙黄、生理盐水、%吕氏碱性美蓝染液、自来水等。 1．2仪器设备 试验仪器：显微镜、蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、试管、酒精灯、接种针（环）、针、培养皿、盖玻片、载玻片、三角玻璃涂布棒等。 2 试验方法 培养基的制备 2.1.1营养琼脂培养基 称取4.5克营养琼脂粉，加入100ml水加热溶解，分装，在121℃下蒸汽灭菌。20min后取出导入无菌平皿中冷却凝固。 2.1.2土豆培养基 将去皮土豆200g切成2cm左右小块加入1000ml水煮沸10min，过滤补充水份，加入20g琼脂粉，20g葡萄糖，加热溶化，分装，121℃下蒸汽灭菌20min。 2.1.3麦芽汁培养基 称取5g麦芽粉加入100ml和2g琼脂，在115℃下蒸汽灭菌20min。 2.1.4糖发酵培养基的制备 2.1.4.1葡萄糖发酵管 取0.25g葡萄糖加入100ml的已配置好的糖溶液混合均匀即可. 2.1.4.2葡萄糖发酵管 取0.25g乳糖加入100ml已配置好的糖溶液混合均匀即可.
乳酸菌得分离、纯化与鉴定
乳酸菌得分离、纯化与鉴定 第一部分:乳酸菌得分离、纯化 一、实验器材: 1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙; 0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g; 2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤: 1、培养基配制(BCG牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成) (B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2、药品配制 2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀,放置24小时后过滤即可。 2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。 2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭得棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。 2、4 0、1%得吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。混合A与B液即成,按1:100稀释即可。 2、4 生理盐水:称取9g氯化钠,溶解在少量蒸馏水中,稀释到1000毫升。 3、菌悬液得配制
细菌 、放线菌 、酵母菌及霉菌的分离与纯化
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化 一、实验目的 1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。 2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。 4. 学习平板菌落计数法。 二、实验原理 将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。 要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。 表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求 样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度 /℃培养时间/d 土样细菌稀释分离10-5，10-6， 10-7 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2 土样放线菌稀释分离10-3，10-4， 10-5 高氏1号28 5～7 土样霉菌稀释分离10-2，10-3， 10-4 马丁氏琼脂28～30 3～5 面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5， 10-6 马铃薯葡萄糖28～30 2～3 细菌分离平 板 细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2 三、实验材料 1. 菌源土样 2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。 3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。 4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。 4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。 （一）系列稀释平板法 1. 取土样 选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。同时取10～15g，称重后经105℃烘干8h，置干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。 2. 制备土壤稀释液 称土样1g于盛有99mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次，摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。
一株反硝化菌的分离与鉴定
一株高效好氧反硝化菌的分离及特性研究 杨俊忠，倪砚，许尚营，徐可瀚，刘义，曾丽霞，刘德立? 华中师范大学生命科学学院，湖北省遗传调控与整合生物学重点实验室，武汉 （430079） E-mail: deliliu2002@https://www.360docs.net/doc/2e8091255.html, 摘要：利用富集培养的方法从南昌市郊某养鱼塘采样分离出22株反硝化细菌，其中8株反硝化率较高，从中选择一株效果最好的作为研究对象，命名为HS-N62。该菌在12h将培养基SC 中起始浓度为140mg/L的硝酸盐氮（NO3-N，10mmol/L）完全降解，并且没有NO2-的积累。对其生长特性进行了研究，最适生长温度的范围是30℃-37℃，最适生长的pH 值范围是6. 0～8. 0，最适C/N比为10：1，并能利用多种碳源生长。运用正交试验探讨了该菌株最适的反硝化条件。通过菌株形态观察、生理生化及16S rDNA 分子鉴定，菌株HS-N62与Pseudomonas sp.亲缘关系最为接近，同源性达99 %，初步鉴定该菌为Pseudomonas sp.。关键词：好氧反硝化；分离鉴定；特性研究 1. 引言 近几十年来，我国水产养殖业迅猛发展，但在水产养殖过程中的氨、硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐等营养元素含量过高所造成的富营养化现象日益严重，结果造成大量鱼虾死亡，最终导致重大经济损失，因此，控制水体中的硝态氮和亚硝态氮成为规模化养殖成功的关键之一[1]。反硝化是将硝酸盐或亚硝酸盐还原成N O或N2的过程。传统观点认为：反硝化细菌大 2 都是兼性厌氧，细菌的反硝化作用是在无氧条件下发生。但近几年国内外的不少研究报道证明好氧反硝化菌的存在。细菌好氧反硝化的发现,突破了传统理论的认识，为生物脱氮技术提供了一种崭新的思路[2]。 具有反硝化能力的细菌就目前所知分布于50 多个属，许多菌属如假单胞菌属( Pseudomonas )、产碱菌属( Alcaligenes)和副球菌属( Paracoccus ) 都存在好氧反硝化现象[3]。本文从常年养鱼的池塘中采样筛选出多株好氧反硝化细菌，并研究了其生长条件及其反硝化效率，可为好氧反硝化脱氮的实际应用提供依据。 2. 材料与方法 2.1 培养基 富集培养基（SM，g/L）：NaNO3 0.85，丁二酸钠2.84，KH2PO4 1.36，MgSO4·7H2O 0.19，2 ml 微量元素溶液，pH 7.0～7.4。 反硝化培养基(SC，g/L)：NaNO3 0.85，丁二酸钠 4.72，酸水解酪素5.0，Na2HPO4 7.9，KH2PO4 1.5，MgSO4·7H2O 0.10，2 ml 微量元素溶液，pH 7.0～7.4。微量元素(g/L)：CuSO4·5H2O 4.0，FeSO4·7H2O 0.70，FeCl3·6H2O 7.0，CoCl3·6H2O 0.20，NaMO4·2H2O 3.4 0，CaCl2·2H2O 2.0，pH 7.0 [3-4]。 BTB培养基(g/L)：丁二酸钠4.72，NaNO3 0.85，KH2PO4 1.0，FeSO4·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.1，琼脂15，pH 7.0。 基金项目：教育部博士点基金项目(20060511002)和“211”重点学科建设项目；湖北省科技攻关计划项目(2007AA201C50，2007AA301C26)。
实验十二___土壤中产抗生素放线菌的分离纯化
实验十二土壤中产抗生素放线菌的分离纯化 实验目的： 1、从土壤中分离产抗生素的放线菌。 2、抗生素产生菌的抗菌谱测定。 3、掌握微生物的基本操作。 实验原理： 放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖，革兰染色为阳性的单细胞原核微生物，是细菌中的一种特殊类型。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。 许多临床应用的抗生素均由土壤中分离的放线菌产生。微生物大量存在与土壤中，其中包括细菌、放线菌和真菌等，采用选择性培养基可分离土壤中的放线菌。产抗生素的放线菌经液体培养后，其分泌的抗生素存在于离心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌试验进行检测，从而筛选到所需的抗生素产生菌。 实验材料： 1、土壤菜园土。 2、实验菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的8h培养物。 3、培养基淀粉琼脂和淀粉液体培养基。 4、其它 10％的酚、牛津杯、灭菌生理盐水、接种环、无菌涂棒、酒精灯、无菌吸管等。 实验方法： 一、土壤中放线菌的分离 1、配制淀粉培养基 配方一淀粉琼脂培养基（高氏培养基） 可溶性淀粉 2克；硝酸钾 0.1克；磷酸氢二钾 0.05克；氯化钠 0.05克；硫酸镁 0.05克；硫酸亚铁 0.001克；琼脂 2克水 100毫升先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2～7.4，分装后灭菌，备用。 配方二面粉琼脂培养基 面粉 60克；琼脂 20克；水 1000毫升 把面粉用水调成糊状，加水到500毫升，放在文火上煮30分钟。另取500毫升水，放入琼脂，加热煮沸到溶解后，把两液调匀，补充水分，调整pH值到7.4，分装，灭菌，备用。 2、土壤悬液梯度稀释 （1）将5.0g土壤加入到50ml灭菌的生理盐水中，震荡10min制备土壤悬液。（2）用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml灭菌的生理盐水中10倍稀释。
水体中反硝化细菌的分离、筛选与初步鉴定
水体中反硝化细菌的分离、筛选与初步鉴定 邵基伦环境工程专业 摘要：当今世界环境污染日益加重，尤其是水体污染已严重影响人们的日常生活与身体健康。水污染是多方面的因素综合作用，而以氨氮的污染最为广泛且严重。所以控制污水中的氨氮含量是污水处理中的重要内容。污水脱氮的基本原理是污水中的含氮有机物首先经过微生物的氨化作用转化为氨，硝化细菌的硝化作用，将氨氧化为亚硝酸盐，并继续氧化为硝酸盐。硝酸盐经过反硝化细菌的反硝化作用转化为氮气等环节成分而释放到大气中，从而实现污水脱氮。硝化作用是这一过程中的一个中间环节，也是一个重要环节。硝化作用是指氨经过微生物的作用氧化为亚硝酸和硝酸的过程，由硝化细菌完成。硝化细菌是一类好样化能自养细菌，包括亚硝化细菌和硝化细菌两个亚群。硝化细菌能够利用还原态无机氮化合物进行自养生长，硝化细菌的生命活动在污水脱氮中起重要作用。由于硝化细菌是化能自养菌，其生长速率很慢，因此硝化、亚硝化细菌的生命活动成为污水脱氮的关键步骤之一。它们能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养殖业及环境保护具有重要意义。硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接影响硝化效果和生物脱氨的效率。因为硝化细菌、亚硝化细菌在污水脱氮中的特殊意义，对这类微生物的研究受到广泛关注。 氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。对于硝化细菌来说生长环境中的温度对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。大多数硝化细菌的合适生长温度为10～38 ℃，高于20℃时硝化细菌的活性较高，但超过38℃消化作用将会消失。当环境气温低于20℃时，氨的转化会受到影响。一般认为，适宜硝化菌和亚硝化菌生长介质的pH值分别为6.0～8.5和6.0～8.0。水体DO的高低影响到好氧、厌氧微生物的比例，大多数研究人员认为DO的浓度应当控制在1.0～2.0 mg/L,低于0.5 mg/L时硝化作用明显减弱。另外,碳氮比、碱度等对硝化及脱氨均有影响。 本实验采用人工培养基方法富集培养硝化细菌．研究了富集培养过程中硝化与亚硝化细菌的结构和性质变化。结果表明，在25-28℃，pH7．5～8.5，D0 2-5mg／L，氨氮浓度100—150mg ／L条件下，经过19d和15d的富集培养，可以得到硝化速率为4.18mg(NH3-N)-[g(MLSS)/h]和10.1mg(NH4-N)-[g(MLSS)/h]的硝化细菌培养物．在这种富集培养过程中，硝化细菌培养物的污泥色泽和结构、MLSS、SV30、SVI、硝化强度和硝化速率等均出现规律性变化且随培养方法不同表现出明显差异。
乳酸菌的分离培养
乳酸菌的分离培养 保加利亚乳杆菌 组长： 组员： 实验目的： 1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察； 2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术； 3.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌。 4.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。 5.了解酸奶中乳酸菌分离原理, 观察乳酸菌的基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目的测定的方法。 6.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。明确显微镜计数的原理并学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。 7．初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 8.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性。 实验原理：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，本实验中 用革兰氏染色法进行染色，革兰氏染色法是根据细菌细胞壁成分不同,脱色效果不同从而可以将细菌区分为G+和G-菌。通过革兰氏染色以及形态学观察，乳酸菌呈紫色，为革兰氏阳性菌；乳酸菌应为乳杆菌和乳球菌的混合体。酸奶中含有乳酸菌，而且目前市场上销售的酸奶中通常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌四种菌。细菌及其它一些微生物的大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计；培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组份的营养物质调制而成的营养基质；灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物，包括芽孢；自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。 实验器材： 样品：含乳酸菌的酸奶 ①培养基：改良MRS固体培养基 蛋白胨5g 牛肉膏5g 酵母提取物 2.5g 柠檬酸二铵1g 水500mL 乙酸钠2.5g K2HPO4 1g MnSO4·4H2O 0.125 吐温80 0.5mL 琼脂12.5g MgSO4·7H2O 0.29g CaCO3 5g 葡萄糖10g 。 仪器用品：500ml烧杯一个100ml量筒一个无菌培养皿12个 250ml容量三角瓶2个5ml无菌移液管1ml无菌移液管6只 15ml试管7只高压灭菌锅天平
微生物菌种的分离和纯化方法
微生物菌种的分离和纯 化方法 https://www.360docs.net/doc/2e8091255.html,work Information Technology Company.2020YEAR
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。 1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法
乳酸菌的分离、纯化与鉴定
乳酸菌的分离、纯化与鉴定 第一部分：乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材： 1. 实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液（溴甲酚绿、无水乙醇）、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95%L 醇、沙黄）、15/乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCI、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL（分析纯）、20gCaCO3固体、酵母膏20g、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g、蔗糖10g ； 2. 仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、 pH试纸、酸乳瓶、培养皿（?9或? 12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml 锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤： 1. 培养基配制（BCG牛乳培养基）： （A）溶液：取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml, 混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅 80C灭菌20 min ; （1.6%溴甲苯酚绿（BCG 乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）（B）溶液：酵母膏10g，水500ml, CaCO3 10g琼脂20g,加热溶解，用精密pH 试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121 T高压蒸汽灭菌 20Mi n。 以无菌操作趁热将（A）（B）溶液均匀混合。 2. 药品配制 2.1结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫 2g溶于20ml 95%^醇中）20ml, 1%莊酸氨水溶液80ml。将两液混匀，放置24小时后过滤即可。 2.2卢哥氏碘液：碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。 2.3蕃红溶液：番红2.5g , 95%^醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml 与80ml蒸馏水混匀即可。 2.4 0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g ,95%^醇300ml; B液：0.01% K0H100ml。混合A和B液即成，按1： 100稀释即可。 2.4生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到 1000毫升。
放线菌的分离与筛选方法
放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。 1.拮抗放线菌的筛选方法： 1.1平板划线法： 待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。选择抑制活性强的复筛。 1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法 将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。 1.3纸片法或生长速率法： 主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测
发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有 无抑菌圈或抑菌圈的大小。 2.放线菌分离与筛选. 2.1培养基； 2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%） 3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。 2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基 2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速 度迅速。 重铬酸钾50-75ug/ml(150ug/ml为宜)或另添加1-2ug/ml青霉素，可 显著抑制细菌和真菌生长，不影响放线菌的数量和种类。 2.3靶标菌：枯草杆菌大肠杆菌金黄葡萄球菌八联球菌变形 杆菌 2.4放线菌分离与筛选 2.4.1传统的分离筛选思路； 以对某些如病原菌或杂草，昆虫为靶标的抑制和杀灭效果为标准筛选 产生活性物质的放线菌，即筛选拮抗放线菌。 初筛：将分离得到菌株进行真对靶标抑制活性筛选。 优点：较早知道是否筛选到拮抗菌株，筛选范围广。缺点：方法粗放，