高效液相色谱法指导培训讲义
合集下载
《高效液相色谱培训》课件
讲解色谱柱的分类、特点以及如何选择合适的色谱柱。
3 柱温控制及常见问题解决方法
详细介绍柱温控制的重要性以及常见问题的解决方法。
二、方法优化
1
流动相的优化与选择
教授流动相的组成与优化方法，以及选择
色谱条件的优化与调整
2
合适流动相的技巧。
分享优化色谱条件和调整方法，以提高分
离效果和分析效率。
3
常见问题与解决方法示例
样品的制备和处理
详细介绍高效液相色谱实验中样品制备和处理的关键步骤。
谱条件设置与调整
指导合理设置色谱条件和对色谱图进行调整，以获得最佳结果。
岗位操作流程及安全要求
说明高效液相色谱岗位的操作流程和实验室安全要求。
五、实验结果分析
1
峰形参数与定量分析
2
探讨峰形参数在定量分析中的作用以及如
何优化峰形。
3
《高效液相色谱培训》 PPT课件
# 高效液相色谱培训
液相色谱是一种广泛应用于化学和生物分析领域的分离技术。本课程将带您 深入了解高效液相色谱的基础知识、方法优化、常见应用、实验操作以及实 验结果的分析与报告撰写。
一、基础知识
1 高效液相色谱简介
介绍高效液相色谱的基本原理、仪器设备和常见术语。
2 色谱柱类型与选择
提供一些常见问题及相应的解决方法示例， 帮助您更好地处理实际应用中的困难。
三、常见应用
药物分析应用
讨论高效液相色谱在药物分析领域 的应用案例和技术要点。
生物大分子分离及分析应用
介绍高效液相色谱在生物大分子分 离和分析方面的重要应用。
环境监测应用
探讨高效液相色谱在环境监测中的 关键应用和技术趋势。
四、实验操作
3 柱温控制及常见问题解决方法
详细介绍柱温控制的重要性以及常见问题的解决方法。
二、方法优化
1
流动相的优化与选择
教授流动相的组成与优化方法，以及选择
色谱条件的优化与调整
2
合适流动相的技巧。
分享优化色谱条件和调整方法，以提高分
离效果和分析效率。
3
常见问题与解决方法示例
样品的制备和处理
详细介绍高效液相色谱实验中样品制备和处理的关键步骤。
谱条件设置与调整
指导合理设置色谱条件和对色谱图进行调整，以获得最佳结果。
岗位操作流程及安全要求
说明高效液相色谱岗位的操作流程和实验室安全要求。
五、实验结果分析
1
峰形参数与定量分析
2
探讨峰形参数在定量分析中的作用以及如
何优化峰形。
3
《高效液相色谱培训》 PPT课件
# 高效液相色谱培训
液相色谱是一种广泛应用于化学和生物分析领域的分离技术。本课程将带您 深入了解高效液相色谱的基础知识、方法优化、常见应用、实验操作以及实 验结果的分析与报告撰写。
一、基础知识
1 高效液相色谱简介
介绍高效液相色谱的基本原理、仪器设备和常见术语。
2 色谱柱类型与选择
提供一些常见问题及相应的解决方法示例， 帮助您更好地处理实际应用中的困难。
三、常见应用
药物分析应用
讨论高效液相色谱在药物分析领域 的应用案例和技术要点。
生物大分子分离及分析应用
介绍高效液相色谱在生物大分子分 离和分析方面的重要应用。
环境监测应用
探讨高效液相色谱在环境监测中的 关键应用和技术趋势。
四、实验操作
高效液相色谱和应用培训
K与k’与组分、流动相和固定相的热力学性质有关常数，还随着柱温变 化
k’大小
k’太小-没有充分利用填料的能力 k’太大-分析时间太长 k’一般范围1~10 d.选择性系数α
可以衡量两种物质的分离程度
α=K2/1= k2’/ k1’
2.2 塔板理论
定义：把色谱分离过程比作蒸馏过程，将连续的色谱过程分割成多次的平衡过程的 重复。 公式：n=L/H; n=5.54(tR/W1/2)2;n=16(tR/tW)2 N为理论塔板数，L为色谱柱长度；H为塔板高度
噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不 稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流 动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生 漂移。
色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上 的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。
评价： 理论塔板数越大，固定相分离的潜能越大 容量因子有差异的组分，柱效越高，分离效果越好 塔板理论对于色谱体系的设计和色谱条件的选择的指导意义有限，不能解释影响塔 板高度的各种因素。
2.3速率理论-Van Deemter方程
速率理论主要解释使色谱峰展宽，柱效降低的各种动力学因素
H=A+B/u+C*u
如不进行过滤，则会 导致堵塞柱子，如果 有不容颗粒在流动相 中，会对泵进行磨损
流动相脱气
HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡， 影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏 度、基线稳定性，甚至使无法检测。此外，溶解在流动相中的氧 还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体 还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析结果带来误差。
k’大小
k’太小-没有充分利用填料的能力 k’太大-分析时间太长 k’一般范围1~10 d.选择性系数α
可以衡量两种物质的分离程度
α=K2/1= k2’/ k1’
2.2 塔板理论
定义：把色谱分离过程比作蒸馏过程，将连续的色谱过程分割成多次的平衡过程的 重复。 公式：n=L/H; n=5.54(tR/W1/2)2;n=16(tR/tW)2 N为理论塔板数，L为色谱柱长度；H为塔板高度
噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不 稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流 动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生 漂移。
色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上 的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。
评价： 理论塔板数越大，固定相分离的潜能越大 容量因子有差异的组分，柱效越高，分离效果越好 塔板理论对于色谱体系的设计和色谱条件的选择的指导意义有限，不能解释影响塔 板高度的各种因素。
2.3速率理论-Van Deemter方程
速率理论主要解释使色谱峰展宽，柱效降低的各种动力学因素
H=A+B/u+C*u
如不进行过滤，则会 导致堵塞柱子，如果 有不容颗粒在流动相 中，会对泵进行磨损
流动相脱气
HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡， 影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏 度、基线稳定性，甚至使无法检测。此外，溶解在流动相中的氧 还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体 还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析结果带来误差。
高效液相色谱法教学【全】精选全文
P307~311
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
高效液相色谱法培训课件
高效液相色谱法培训课件
欢迎参加本次高效液相色谱法（HPLC）培训。在这个课程中，我们将会探究 这项重要的分析技术，介绍其原理、仪器和设备，体相和一列分离材料（通常是一种固定的液相柱）分 离并分析混合物。我们将介绍是什么让HPLC区别于其他分析方法，深入探讨 液相柱，以及如何选择适当的流动相。
环境监测
HPLC在环境监测中亦有 广泛的应用，我们将探究 HPLC在环境监测领域中 的各种应用。
食品安全检测
HPLC在食品安全检测领 域中也被广泛使用，例如 检测食品中的添加剂、有 害物质以及质量控制。
样品准备与处理
我们将讨论如何选择适当的样品处理方法，如何处理样品，以及样品前处理 的步骤。我们还将探讨如何选择适量的标准品和如何使用标准曲线。
常见问题与解决方法
色谱峰形不对称的原因与调整 方法
我们将探究造成色谱峰形不对称的原因，以及 如何调整色谱峰。
杂质峰的出现与解决方法
我们将探究杂质峰出现的原因，以及如何从样 品中去除杂质峰。
HPLC的仪器和设备
HPLC可能需要用到多种仪器，例如梯度系统和检测器。我们将介绍这些仪器 的功能以及如何在实验室中使用它们。我们还会详细介绍如何使用手动和自 动进样器。
操作流程
样品准备
样品制备可能是HPLC分析过程中最重要的部分 之一。我们将讨论如何正确样品准备以及如何 处理样品中的杂质。
色谱柱和流动相的选择
颜色、粘度和PH值等都会影响流动相的选择。 我们将详细讨论如何选择适当的流动相以及如 何选择适当的色谱柱。
手动和自动化进样的步骤
手动和自动化进样器的使用会影响实验的结果， 这个章节将讨论如何正确使用手动和自动化进
梯度洗脱的方法
我们将讨论什么是梯度洗脱，如何正确选择梯 度的组成。
欢迎参加本次高效液相色谱法（HPLC）培训。在这个课程中，我们将会探究 这项重要的分析技术，介绍其原理、仪器和设备，体相和一列分离材料（通常是一种固定的液相柱）分 离并分析混合物。我们将介绍是什么让HPLC区别于其他分析方法，深入探讨 液相柱，以及如何选择适当的流动相。
环境监测
HPLC在环境监测中亦有 广泛的应用，我们将探究 HPLC在环境监测领域中 的各种应用。
食品安全检测
HPLC在食品安全检测领 域中也被广泛使用，例如 检测食品中的添加剂、有 害物质以及质量控制。
样品准备与处理
我们将讨论如何选择适当的样品处理方法，如何处理样品，以及样品前处理 的步骤。我们还将探讨如何选择适量的标准品和如何使用标准曲线。
常见问题与解决方法
色谱峰形不对称的原因与调整 方法
我们将探究造成色谱峰形不对称的原因，以及 如何调整色谱峰。
杂质峰的出现与解决方法
我们将探究杂质峰出现的原因，以及如何从样 品中去除杂质峰。
HPLC的仪器和设备
HPLC可能需要用到多种仪器，例如梯度系统和检测器。我们将介绍这些仪器 的功能以及如何在实验室中使用它们。我们还会详细介绍如何使用手动和自 动进样器。
操作流程
样品准备
样品制备可能是HPLC分析过程中最重要的部分 之一。我们将讨论如何正确样品准备以及如何 处理样品中的杂质。
色谱柱和流动相的选择
颜色、粘度和PH值等都会影响流动相的选择。 我们将详细讨论如何选择适当的流动相以及如 何选择适当的色谱柱。
手动和自动化进样的步骤
手动和自动化进样器的使用会影响实验的结果， 这个章节将讨论如何正确使用手动和自动化进
梯度洗脱的方法
我们将讨论什么是梯度洗脱，如何正确选择梯 度的组成。
HPLC高效液相色谱培训__PPT
HPLC的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程 中改变流动相的组成或浓度。 高压梯度 ①线性梯度; ②阶梯梯度 低压梯度
22
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
优点：只要通过梯度程序 控制器控制每台泵的输出， 就能获得任意形式的梯度 曲线，而且精度很高，易 于实现自动化控制。 缺点：使用了两台高压输 液泵，使仪器价格变得更 昂贵，故障率也相对较高， 而且只能实现二元梯度操 作。
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography ，HPLC
1
Tanghui.pha.shzu
第一节 概 述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代 末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术， 随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广 泛的化学分离分析的重要手段。
10
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
11
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
1．高压输液系统
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流 动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输 液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高 压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。
28
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填 料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成 匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液 的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。 一般柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～ 40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
22
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
优点：只要通过梯度程序 控制器控制每台泵的输出， 就能获得任意形式的梯度 曲线，而且精度很高，易 于实现自动化控制。 缺点：使用了两台高压输 液泵，使仪器价格变得更 昂贵，故障率也相对较高， 而且只能实现二元梯度操 作。
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography ，HPLC
1
Tanghui.pha.shzu
第一节 概 述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代 末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术， 随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广 泛的化学分离分析的重要手段。
10
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
11
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
1．高压输液系统
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流 动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输 液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高 压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。
28
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填 料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成 匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液 的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。 一般柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～ 40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
高效液相色谱法基本知识培训-化验员入门培训
容量因子(k’)
容量因子是色谱法中广泛采用的保留值参数, 它是样品组分的质量在两相中分配的比值,定义为
k’=固定相中溶质的质量(ms) = k・Vs
流动相中溶质的质量(mm)
Vm
VR=Vm+k’(Vm/Vs)·Vs= Vm+k’Vms = Vms·(1+k’)
式两边除以冲洗剂流速Fc则得
tR = tM(1+k’)
具氢键接受体和给予体两种性能。对于有 较强氢键作用力的样品,在后两种键合相上 所得的k’就大。如联苯胺和苯胺，在正相洗 脱的条件下,在氨基固定相上所得的k’比氰 基固定相显著增大。
极性键合相一般都用作正相色谱,即用非极性或极性 小的溶剂(如烃类溶剂)加入适量的极性溶剂(如三氯 甲烷、醇、乙腈等),以调节控制洗脱液的洗脱强度。 分离组分的出峰顺序与组分的极性大小顺序相同,即 极性弱的先出峰,极性强的后出峰。但对强极性的化 合物,上述极性键合相也可用反相色谱,如在分离糖类 或多肽化合物时,用乙腈-水作洗脱液也可以得到良好 的分离效果。
少固定相粒径，可以提高柱效，相应的柱压增高，可进行快
速分离。第三，提高容量因子（k’）方法提高分离度，可通 过以下方法实现：（1）调节流动相极性、pH值、离子强度 等；（2）梯度洗脱。另外，如果k’值过大，会造成分离时间 过长，并且谱带扩散严重，因此，比较适宜的k’值范围为 1≤k’≤10。
拖尾因子T
调整保留时间和调整保留体积
扣除死时间或死体积的保留值,定义为调整保 留时间(t’R)和调整保留体积(V’R),如下式所示。
t’R =tR-tM V’R =VR-VM 保留值是色谱过程热力学的重要参数。当色谱 操作条件一定时,不同物质的有其特定的保留值。 这是色谱定性分析的基本依据。在液相色谱中,由 于流动相参与了溶质分配过程,因此,样品组分的保 留值不仅与固定相的性质有关,而且受流动相性质 变化的影响很大。因此研究液相色谱中流动相组成 对保留值的影响,是分离条件最佳化的基础。
高效液相色谱培训(HPLC使用与维护)
常见故障排除
流动相不流动
检查泵密封圈是否磨损或损坏， 管路是否堵塞，流动相是否足够。
峰形异常
检查进样器是否堵塞，色谱柱是否 受损或污染，检测器是否正常工作。
基线漂移
检查流动相是否纯净，检测器是否 正常工作，仪器是否处于良好状态。
仪器保养与校准
01
02
03
定期校准
按照厂商推荐的时间间隔 和校准方法，对HPLC进 行校准，以确保仪器性能 和测量精度。
详细描述
HPLC技术在化学领域中广泛应用于有机化合物、无机化合物的分离和测定。在生物领域，HPLC用于 蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。在医学领域，HPLC用于药物分析、临床检验、毒物分析 等方面，为医学研究和诊断提供重要的技术支持。
HPLC的优点与局限性
总结词
HPLC具有高分离效能、高灵敏度、高选 择性等优点，但也存在一些局限性，如 对样品的前处理要求高、对流动相的纯 度要求高等。
考察学员在遇到问题时能否迅速、准确地 判断并采取有效措施解决问题。
实践操作与考核经验分享
严格遵守操作规程
在实践操作过程中，务必遵循正确的操 作规程和安全规范，确保实验结果的准
确性和可靠性。
团队协作与沟通
积极参与团队协作，与团队成员保持 良好的沟通，共同解决问题，提高工
作效率。
充分准备与复习
在考核前，充分复习理论知识，熟悉 实验操作流程和仪器设备的使用方法。
HPLC仪器操作流程
准备工作
检查仪器各部件是否正常，流动相是否充足 ，确保电源和气源连接正常。
流动相制备
根据实验要求配制流动相，并进行过滤和脱气 。
仪器启动
打开电源和气源，启动仪器，进行系统冲洗和平 衡。
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
• 因胶束色谱法的流动相是多相分散体系，在 整个色谱体系中又增加了一相，故也被称为 假相色谱（pseudo phase
chromatography）。
高效液相色谱法指导培训 讲义
手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
高效液相色谱法指导培训 讲义
空间排斥色谱（steric exclusion ） 也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸 与凝胶空径大小之间的相对关系而分离， 类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸 内，分子越大，保留时间越短。 凝胶渗透——以有机溶剂为流动相 凝胶过滤——以水溶液为流动相 对于相同化学组成的高分子化合物，其分 子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色 谱可以研究高分子化合物的分子量分布。
高效液相色谱法指导培训 讲义
• 进样方法
• 整个定量圈体积进样——为获得好的精密度， 进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于
层流影响，需要有过量的样品液来取代管
壁上的流动相（见下图）。
Sample
Mobile phase
高效液相色谱法指导培训 讲义
• 部分定量圈体积进样——当样品量少时， 采用部分体积进样，进样量由微量注射器 手动控制，要求：
• 不得超过定量圈体积的1/2量
例20l定量圈，进样体积不能超过10 l。 否则，部分样品将会从出口流失。这是因为 由于层流的关系，样品流经管中心的速度是 平均速度的两倍。 进样前应用流动相冲洗进样孔，以除去前 一针留下的样品。注射针必须清洗干净。
废液
定量圈 1
废液
泵2
6Hale Waihona Puke 泵26废液 5
废液 5
3
4
柱 进样孔
3
4 进样孔
柱
Load
Inject
高效液相色谱法指导培训 讲义
注意：使用后应清洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
• 进样注意点 • 进样阀的废液出口端高度
必须与进样针在同一水平 位置，以免虹吸作用，使 样品向针筒方向回流，或 从废液口流出。 • 使用前后，要用流动相 （不含酸碱等缓冲液）或 甲醇或水冲洗针孔，用针 孔清洗器）。
这种泵具有清洗容易，更换流动相方便等优 点，但脉动性较大是其缺点。目前多采用双 泵补偿法来克服这一问题。
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
注意
流动相 使用前
避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。
例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物，
四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混
合物，含强络合剂的溶液等。
高效液相色谱法
高效液相色谱法指导培训 讲义
第一节 概述
• 高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经 典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理 论与实验方法，流动相用高压泵输送，采用 高效固定相和在线检测等手段发展而成的分 离分析方法 。
• 与气相色谱法相比具有：适用范围广，样品 预处理简单，分离效率高，流动相选择范围 广，检测方法多为非破坏性的，流出组分可 回收等优点。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类 烷基磺酸盐——用于碱类
高效液相色谱法指导培训 讲义
• 离子色谱法（ ion chromatography ） –离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利用 物质在离子交换柱上迁移的差异而达 到分离，用于亲水性阴阳离子的测定。 根据是否采用抑制柱，可分为抑制型 离子色谱和非抑制型离子色谱。
高效液相色谱法指导培训 讲义
液-固吸附
液-液分配 正相色谱 一般反相色谱
反相色谱 离子对色谱
键 合
离子抑制色谱 相
一般离子交换色谱
色
谱
离子交换色谱 离子色谱
HPLC
氨基酸分析
空间排斥色谱
凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
假相色谱
胶束色谱 环糊精色谱
亲合色谱，手性色谱，毛细管电泳
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
第二节 高效液相色谱仪
流
动
相
高压泵
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
高效液相色谱法指导培训 讲义
检测器
输液泵
多用柱塞往复泵，柱塞向前运动，液体输出， 流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸 入缸体。如此往复运动，将流动相 源源不断 地输送到色谱柱中。
柱塞往复泵属于恒流泵，流量不受柱阻影响， 泵压最高为400kg/cm2。
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
• 因胶束色谱法的流动相是多相分散体系，在 整个色谱体系中又增加了一相，故也被称为 假相色谱（pseudo phase
chromatography）。
高效液相色谱法指导培训 讲义
手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
高效液相色谱法指导培训 讲义
空间排斥色谱（steric exclusion ） 也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸 与凝胶空径大小之间的相对关系而分离， 类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸 内，分子越大，保留时间越短。 凝胶渗透——以有机溶剂为流动相 凝胶过滤——以水溶液为流动相 对于相同化学组成的高分子化合物，其分 子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色 谱可以研究高分子化合物的分子量分布。
高效液相色谱法指导培训 讲义
• 进样方法
• 整个定量圈体积进样——为获得好的精密度， 进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于
层流影响，需要有过量的样品液来取代管
壁上的流动相（见下图）。
Sample
Mobile phase
高效液相色谱法指导培训 讲义
• 部分定量圈体积进样——当样品量少时， 采用部分体积进样，进样量由微量注射器 手动控制，要求：
• 不得超过定量圈体积的1/2量
例20l定量圈，进样体积不能超过10 l。 否则，部分样品将会从出口流失。这是因为 由于层流的关系，样品流经管中心的速度是 平均速度的两倍。 进样前应用流动相冲洗进样孔，以除去前 一针留下的样品。注射针必须清洗干净。
废液
定量圈 1
废液
泵2
6Hale Waihona Puke 泵26废液 5
废液 5
3
4
柱 进样孔
3
4 进样孔
柱
Load
Inject
高效液相色谱法指导培训 讲义
注意：使用后应清洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
• 进样注意点 • 进样阀的废液出口端高度
必须与进样针在同一水平 位置，以免虹吸作用，使 样品向针筒方向回流，或 从废液口流出。 • 使用前后，要用流动相 （不含酸碱等缓冲液）或 甲醇或水冲洗针孔，用针 孔清洗器）。
这种泵具有清洗容易，更换流动相方便等优 点，但脉动性较大是其缺点。目前多采用双 泵补偿法来克服这一问题。
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
注意
流动相 使用前
避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。
例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物，
四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混
合物，含强络合剂的溶液等。
高效液相色谱法
高效液相色谱法指导培训 讲义
第一节 概述
• 高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经 典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理 论与实验方法，流动相用高压泵输送，采用 高效固定相和在线检测等手段发展而成的分 离分析方法 。
• 与气相色谱法相比具有：适用范围广，样品 预处理简单，分离效率高，流动相选择范围 广，检测方法多为非破坏性的，流出组分可 回收等优点。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类 烷基磺酸盐——用于碱类
高效液相色谱法指导培训 讲义
• 离子色谱法（ ion chromatography ） –离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利用 物质在离子交换柱上迁移的差异而达 到分离，用于亲水性阴阳离子的测定。 根据是否采用抑制柱，可分为抑制型 离子色谱和非抑制型离子色谱。
高效液相色谱法指导培训 讲义
液-固吸附
液-液分配 正相色谱 一般反相色谱
反相色谱 离子对色谱
键 合
离子抑制色谱 相
一般离子交换色谱
色
谱
离子交换色谱 离子色谱
HPLC
氨基酸分析
空间排斥色谱
凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
假相色谱
胶束色谱 环糊精色谱
亲合色谱，手性色谱，毛细管电泳
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
第二节 高效液相色谱仪
流
动
相
高压泵
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
高效液相色谱法指导培训 讲义
检测器
输液泵
多用柱塞往复泵，柱塞向前运动，液体输出， 流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸 入缸体。如此往复运动，将流动相 源源不断 地输送到色谱柱中。
柱塞往复泵属于恒流泵，流量不受柱阻影响， 泵压最高为400kg/cm2。