高效液相色谱法指导培训讲义

废液
定量圈 1
废液
泵2
6
泵2
6
Байду номын сангаас
废液 5
废液 5
3
4
柱 进样孔
3
4 进样孔
柱
Load
Inject
高效液相色谱法指导培训 讲义
注意：使用后应清洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
• 进样注意点 • 进样阀的废液出口端高度
必须与进样针在同一水平 位置，以免虹吸作用，使 样品向针筒方向回流，或 从废液口流出。 • 使用前后，要用流动相 （不含酸碱等缓冲液）或 甲醇或水冲洗针孔，用针 孔清洗器）。
高效液相色谱法指导培训 讲义
空间排斥色谱（steric exclusion ） 也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸 与凝胶空径大小之间的相对关系而分离， 类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸 内，分子越大，保留时间越短。 凝胶渗透——以有机溶剂为流动相 凝胶过滤——以水溶液为流动相 对于相同化学组成的高分子化合物，其分 子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色 谱可以研究高分子化合物的分子量分布。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类 烷基磺酸盐——用于碱类
高效液相色谱法指导培训 讲义
• 离子色谱法（ ion chromatography ） –离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利用 物质在离子交换柱上迁移的差异而达 到分离，用于亲水性阴阳离子的测定。 根据是否采用抑制柱，可分为抑制型 离子色谱和非抑制型离子色谱。
高效液相色谱法指导培训 讲义
液-固吸附
液-液分配 正相色谱 一般反相色谱
反相色谱 离子对色谱
键 合
离子抑制色谱 相
一般离子交换色谱
色
谱
离子交换色谱 离子色谱
HPLC
氨基酸分析
空间排斥色谱
凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
假相色谱
胶束色谱 环糊精色谱
亲合色谱，手性色谱，毛细管电泳
高效液相色谱法指导培训 讲义
• 不得超过定量圈体积的1/2量
例20l定量圈，进样体积不能超过10 l。 否则，部分样品将会从出口流失。这是因为 由于层流的关系，样品流经管中心的速度是 平均速度的两倍。 进样前应用流动相冲洗进样孔，以除去前 一针留下的样品。注射针必须清洗干净。
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
高效液相色谱法指导培训 讲义
第二节 高效液相色谱仪
流
动
相
高压泵
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
高效液相色谱法指导培训 讲义
检测器
输液泵
多用柱塞往复泵，柱塞向前运动，液体输出， 流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸 入缸体。如此往复运动，将流动相 源源不断 地输送到色谱柱中。
柱塞往复泵属于恒流泵，流量不受柱阻影响， 泵压最高为400kg/cm2。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
高效液相色谱法
高效液相色谱法指导培训 讲义
第一节 概述
• 高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经 典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理 论与实验方法，流动相用高压泵输送，采用 高效固定相和在线检测等手段发展而成的分 离分析方法 。
• 与气相色谱法相比具有：适用范围广，样品 预处理简单，分离效率高，流动相选择范围 广，检测方法多为非破坏性的，流出组分可 回收等优点。
常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
这种泵具有清洗容易，更换流动相方便等优 点，但脉动性较大是其缺点。目前多采用双 泵补偿法来克服这一问题。
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
注意
流动相 使用前
避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。
例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物，
四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混
合物，含强络合剂的溶液等。
• 因胶束色谱法的流动相是多相分散体系，在 整个色谱体系中又增加了一相，故也被称为 假相色谱（pseudo phase
chromatography）。
高效液相色谱法指导培训 讲义
手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
高效液相色谱法指导培训 讲义
• 进样方法
• 整个定量圈体积进样——为获得好的精密度， 进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于
层流影响，需要有过量的样品液来取代管
壁上的流动相（见下图）。
Sample
Mobile phase
高效液相色谱法指导培训 讲义
• 部分定量圈体积进样——当样品量少时， 采用部分体积进样，进样量由微量注射器 手动控制，要求：