基因芯片接触式点样条件的优化

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基片的处理和选择
医生在线
249
21412 21414 2141:
醛基片的制备 氨基片以 ;<戊二醛水溶液浸泡 91; = ， 将 ’>0/? 膜固定于洁净玻片上。 用 %@6?A776>3999 荧光共聚焦扫描
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物
技
术
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研究报告
基因芯片接触式点样条件的优化
黄海燕! 韩金祥
!山东省医药生物技术研究中心 " 济南 &9##W&#
摘要：样品的点制是基因芯片制备中的关键一步， 影响因素众多， 如点样液和液面高度、 基片的选择、 控制湿度、 点样 针运行速度、 与基片接触时间等。对玻片点制各条件进行了摸索和优化， 并对膜芯片的点制参数进行筛选， 以期得到 规整和重现性好的样品点。 关键词 ! 基因芯片 " 接触式点样 " 玻片 " 膜芯片 " 优化 中图分类号 ! XYUW 文献标识码： .
1?+5;6< :S67@D 5H7< R6;+4<<， <S+H ?< 5H4 H47DH5 ;1 1KS7: <?3RK4 ， +H;<4@ <S]<56?54 ， HS37:752 +;@56;K， R7@ ^4K;+752 ?@: 3?@2 48R46734@5< 5H4 5734 ;1 +;@5?+57@D _75H 5H4 <S]<56?54B J@ ;6:46 5; ?+‘S764 7664DSK?6 ?@: +;@<7<54@5 <R;557@D :;5<， H?^4 ]44@ :;@4 5; 4<5?]K7<H 5H4 ]4<5 +;@:757;@<B AS75?]K4 R?6?34546< ;1 R6;:S+7@D -2K;@%+H7R H?^4 ?K<; ]44@ 4@S64:B 23- 4’,51： D4@4 +H7R ； +;@5?+57@D R67@57@D ； <K7:4 ； -2K;@%+H7Ra ;R5737b?57;@
点后即可达到较高的点的均一性。液面高度为4 PP 时， 预点 39 个样品点之后才可达到较高的均一性， 并 且 39YU9 个样品点之间的均一性并非一直很理想， 所 以并非样品量越多越好。要想取的重现性好的样品 点，既要保证点样针靠虹吸作用能使针孔内载液面 上升至一定高度，又不能使针尖外侧沾染过多的点 样液。以样品孔内液面高度 2 PP 预点 :9 个点为宜， 既节约样品， 又能得到理想的样品点。结果参见图2 。
片表面的终速度分别调整为 : 、 ;、 29 PP O F， 与 玻 片 的 接 触 时 间分别设置为 2; 、 4; 、 :; PF。
21313
不同点样液对样品点的影响
以 :L %%* 、 点样液、 ;9<
图 ! 不同点样液面高度对样品点的影响 上图液面高度为 2 PP；下图液面高度为 4 PP
选 取 21312 和 2131: 中 的 最 优 条 件 ， 单针点 M5%) 制 备 的 点 样 液 ， 制同一张醛基片， 每个样品点 3 个点。点样后处理同 21312 。
078A2<99## 芯片点样仪探讨了核酸样品 的 接 触 式 点
制， 并对点制条件进行了筛选和优化。
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材料和方法
材料 （,-. C@D7@4 E456?: ， 0>/ 仪 FG /4<4?6+H ） I 078A2<99##
点样仪 （>?654<7?@ 公司） ， .66?2J5EF AF0( 点 样 针 （E4K4>H43 公 司） （E4K4>H43 公司） I A0L(& 067@5H4?: I A+?@.66?2*### 荧光共 聚焦扫描仪 （0?+M?6: N7;A+74@+4 公司） （,FAP ） （<;R557@D 9#O 二 甲 基 亚 砜 I (Q AA>I &Q 点 样 液 （E4K4>H43 公司） （.37+;@ 公 司 ） <;KS57;@ ） I F7+6;>;@"## 纯化 柱 I （>CT ?<<;+7?54 ， ， 醛基片 （本 实 验 >AA%"## 硅 烷 化 氨 基 片 J@+ ） 室制备） ， 多 聚 赖 氨 酸 片 （香 港 城 市 大 学 基 因 组 技 术 研 究 中 心） （0H?3?+7? N7;54+H ） ， （本 实 验 室 制 I -2K;@ 膜 -2K;@ 膜 芯 片 。 备） ， (U* 孔方形平底板 （V647@46）
收稿日期： &##&%""%&Y 基金项目： 国家攻关项目 I 山东省重点攻关项目 I 山东省优秀中青年 科学家基金项目 作者简介： 黄海燕 （"$YW% ） ， 女， 硕士研究生。 C%3?7K!2?@HHYWc"W(B+;3
是可制备高密度阵列， 通常可达到 & 9## :;5< = 33&； 其二为非接触式点样， 即喷点， 是以压电原理将样品 通过毛细管直接喷至支持物表面。因喷点的斑点较 大， 故探针密度低， 通 常 只 有 *## :;5< = 33&， 多用于 蛋白芯片的制备。 我 们 利 用 本 实 验 室 的 >?654<7?@ 公 司 的
水洗， 室温干燥。
’>0/? 膜芯片的制备
实验用基片的选取
仪对各氨基片、醛基片、多聚赖氨酸片分别进行全片扫描检 测。 扫描参数为 B0C/7/D=/7E ： *>: ； !6FE7 D/GE7： H; ； I5#： H; 。 选取荧光背景信号最弱基片供试。
21:
荧光标记 I*$ 产物的制备 在总体积为 299 !0 的 反 应 体 系 中 掺 入 荧 光 素 *>:JK*#I，
酸片上的液滴面积较大， 且边缘圆润规整， 接近于圆 形， 点的均一性高， 最为美观。氨基片上印迹的液滴 面积最小， 形态不很规则。醛基片点样效果界于二者 之间。这与玻片表面处理方法和与核酸样品的结合 原理有关。在多聚赖氨酸包被的玻片表面点制核酸 是利用物理吸附的原理。而氨基片和醛基片利用的 则是在核酸和玻片表面发生化学反应，形成化学键 的原理。
结果 取样孔液面高度对预点数目的影响 实验显示液面高度为 2 PP，预点 49ห้องสมุดไป่ตู้:9 个样品
41:
点样时针的下降速度及在玻片上的停留时间对 扫描结果显示， 速度越大， 流体惯性导致产生的
样品点的影响
医生在线
黄海燕等： 基因芯片接触式点样条件的优化
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积减少约$ ’ )。且肉眼可见点制!# 个点以后，样品点 颜色发白， #% 个点之后几乎看不到可识别的点。扫 描结果也显示 #% 个点之后的信号明显减弱。这是由 于湿度不够，样品孔内和针缝内虹吸上来的样品液 蒸发严重，导致盐浓度升高。故湿度不够不利于得 到均一的样品点。如点样时间较长，影响尤甚。当 基片上有些区域点间出现不同程度 +,为 -*. 、 C*. ， 的液滴粘连现象。这是由于湿度过大，玻片表面形 成一层水膜， 与 )0 112 极性相同， 易于凝成大液滴
2131;
湿度控制对样品点的影响
保湿罩内相对湿度值
414
不同基片对样品点的影响 见图 4， 同条件下扫描结果显示印迹于多聚赖氨
（$+ ） 分 别 设 置 为 N;< 、 T;< 、 U9< 、 U;< 、 H9< 。 以 :L %%* 样 品 点样后处 液点样， 以醛基片为基片， 单针分别点 299 个样品点。 理同 21312 。
甚至大面积扩散。-%. 为最适条件， 点直径和荧光强 度均一性较好（此结果与实验室内温度 +D 和相对湿 度+,相关， 进行本实验时， 。 参 +,为**.， +D为!-E） 见图@ 。
分 别 取 29 、 49 !0 至 :U3 孔 方 形 平 底 板 （液 面 高 度 分 别 为 2 和 4 。ISV%>F;;99 点样仪通过机械手臂运行点样程序。三根点 PP） 样针平行接触式点制醛基片。 针在取样接触 :U3 孔板底部和点 样接触基片时针柄抬出 %I+:4 I7S?W=E6K 约 91; PP 。分别点制 以荧光共聚焦扫描仪进行扫描 299 个样品点。室温避光干燥， 并用 XC6?WA776> 软件对信号进行量化分析。
2131N
点制膜芯片条件的优化
以 ’>0/? 膜 为 基 质 ， 单 针 点
针尖接触膜芯片表面的终速 制。 湿度控制选取 2131; 最优条件。 度分别设置为 4 、 :、 ; PP O F。与膜 接 触 时 间 分 别 设 置 为 ; 、 29 、 运行程序点制 299 个点。 2; PF，
4 412
基因芯片是指将大量核酸片段 （寡核苷酸、 基 因 组 ,-.、 有序地固化于支 +,-.、 +/-. 或 0-.） 持物 （如玻片、 硅片或膜等载体） 的表面， 组成密集二 维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶 分子杂交， 通过特定的仪器 （如荧光共聚焦扫描仪或 电荷耦联摄影相机等） 对杂交信号的强度进行快速、 并行、 高效的检测分析， 从而判断样品中靶分子的数 量。基因芯片的基本流程包括芯片的制备、 靶样品的 制备和标记、 杂交、 杂交信号的获取和数据分析等。 其中芯片的制备是关键的一步，关系到芯片的质量 和可信度。因研究目的不同、 期望制作的芯片类型不 同， 制备芯片的方法也不尽相同。以,-. 为例， 基本 可以分为两大类，一类是原位合成，适用于寡核苷 酸； 一类是预合成后直接点样， 可用于大片断 ,-. 和 寡核苷酸。由于原位合成法比较复杂， 除了在基因芯 片研究方面享有盛誉的 .112345678 等公司使用该技术 合成探针外， 研究者大多使用合成后点样法。点样的 方式又分为两种。其一为接触式点样， 即点样针与固 相支持物表面接触， 将样品留在支持物上， 显著优点
T4R N9 F， :9 个循环。使用 5S@7/*/?299 纯化柱 F， N9R :9 F，
纯化荧光产物。 取适量纯化产物分别用 :L %%* 、 点样液、 ;9<
M5%)稀释至终浓度 29 !P/0 O !。 213 21312
样品点制最佳条件测试 取样液面高度对点的均一性影响
:L %%* 的 样 品 液
双引物各 N !0， 掺入荧光素的 3 29L 缓冲液 29 !0， 模板 M’A、 种 K’#I 混 合 物 2N !0 （KA O , O ##I 214; PP/0 O !， K*#I 212; ， PP/0 O !， *>:JK*#I 9129 PP/0 O !） !"# M’A 聚 合 酶 （; Q O ， 加 水 至 299 !0。 反 应 条 件 ： !0） H3R ; PS? 预 变 性 ； H3R :9
21314
不同 基 片 对 样 品 点 的 影 响
以 :L %%* 样 品 液 点 样 ， 上
样量和预点数目按 21312 所得结论。单根 %5I: 针 取 样 ， 预点后 依次点至氨基片、 醛基片、 多聚赖氨酸片， 每 张 片 上 点3个 点 。 点样后处理同 21312 。
2131:
点样针下降速度及与基片接触时间对样品点的影响 单根 %5I: 针点制。点样针接触玻 以 :L %%* 样品液点样，
样品液滴越大， 与玻片的接触时间越长， 会将此效应 放大。而接触时间过短 （$* &(） ， 会导致样品点的不 规则。速度为 ) && ’ (，接触时间为 !* &( 为优化条 件。 也尤利于一次取样点制较多的样品点 （?!%%个） 。
图0
以 "1)223*4 ")(523)* 点样液点制不同基片 >" 多聚赖氨酸片 F G" 醛基片 F 2" 氨基片
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