基因芯片接触式点样条件的优化
论文 生物芯片技术
生物芯片技术——生物化学分析论文08应化2江小乔温雪燕袁伟豪张若琦2011-5-3一、摘要：生物芯片技术，被喻为21世纪生命科学的支撑技术，是便携式生化分析仪器的技术核心，是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。
由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交（Southern Blotting 和Northern Blotting 等）技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量(low through-put)等不足。
二、关键词生物芯片；检测；基因三、正文（一）、生物芯片的简介生物芯片技术是一种高通量检测技术，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序（Sequencing by hybridization, SBH）等，为"后基因组计划"时期基因功能的研究及现代医学科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具，将会使新基因的发现、基因诊断、药物筛选、给药个性化等方面取得重大突破，为整个人类社会带来深刻广泛的变革。
该技术被评为1998年度世界十大科技进展之一。
（1）它包括基因芯片、蛋白芯片及芯片实验室三大领域。
基因芯片(Genechip)又称DNA芯片(DNAChip)。
它是在基因探针的基础上研制出的，所谓基因探针只是一段人工合成的碱基序列，在探针上连接一些可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。
它将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。
蛋白质芯片与基因芯片的基本原理相同，但它利用的不是碱基配对而是抗体与抗原结合的特异性即免疫反应来检测。
基因芯片
基因芯片技术及应用田燕丹130820005 微生物专业摘要：基因芯片技术是随着人类基因组计划的实施而发展起来的一种前沿生物技术，具有高度平行性、多样性、微型化和自动化的特点。
它涉及物理学、化学、生物化学、核酸化学、分子生物学、计算机科学等多个学科，是多学科多技术交叉的结晶。
目前在基因组学研究、基因序列分析、疾病诊断、药物筛选、环境监测等方面得到了广泛的应用。
本文就基因芯片的原理、分类、制备、应用四个方面对其进行介绍。
关键词：基因芯片；原理；分类；制备；应用1 基因芯片的工作原理基因芯片又称DNA芯片、DNA微阵列，它是由大量已知序列的DNA或者寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，是最主要的且发展最早、最快的一种生物芯片。
与传统的基因检测技术相比，其最大特征是能同时定量或者定性的检测成千上万的基因信息，并且具有微型化、自动化、网络化等特点，使得该技术的到了迅速的普及与应用。
基因芯片借用了计算机芯片的原理，运用缩微技术，把已知序列核酸密集有序地排列固定在固相平面载体预先设置的区域内，形成微型的检测器件，再将待测样本标记后同芯片进行杂交，检测原理是利用核酸的碱基互补配对原理，样本中的标记分子与芯片上的配对探针分子特异性结合，通过激光共聚焦荧光扫描仪或其他检测手段获取信息，经电脑系统处理、分析得到结合在探针上的待测样本中特定大分子的信息，从而检测对应片段是否存在、存在量的多少。
由于能够实现生物信息的大规模检测分析，基因芯片成为了一种进行DNA序列分析及基因表达信息分析的强有力工具。
2基因芯片的分类根据制备方式、芯片介质、探针类型等的不同，基因芯片可分成许多类型[1]。
2.1根据芯片的制备方式根据芯片的制备方式，可以将基因芯片分为两大类：原位合成芯片和直接点样(合成后点样)芯片。
与直接点样芯片相比，原位合成芯片精确度高、密度高，但其成本也高，设计、制备繁琐。
2.2 根据芯片的介质分类芯片根据固相支持物(基片)的种类不同，可以分为玻璃芯片、膜芯片、塑料芯片等。
基因芯片数据处理流程与分析介绍
基因芯片数据处理流程与分析介绍关键词：基因芯片数据处理当人类基因体定序计划的重要里程碑完成之后，生命科学正式迈入了一个后基因体时代，基因芯片(microarray) 的出现让研究人员得以宏观的视野来探讨分子机转。
不过分析是相当复杂的学问，正因为基因芯片成千上万的信息使得分析数据量庞大，更需要应用到生物统计与生物信息相关软件的协助。
要取得一完整的数据结果，除了前端的实验设计与操作的无暇外，如何以精确的分析取得可信数据，运筹帷幄于方寸之间，更是画龙点睛的关键。
基因芯片的应用基因芯片可以同时针对生物体内数以千计的基因进行表现量分析，对于科学研究者而言，不论是细胞的生命周期、生化调控路径、蛋白质交互作用关系等等研究，或是药物研发中对于药物作用目标基因的筛选，到临床的疾病诊断预测，都为基因芯片可以发挥功用的范畴。
基因表现图谱抓取了时间点当下所有的动态基因表现情形，将所有的探针所代表的基因与荧光强度转换成基本数据(raw data) 后，仿如尚未解密前的达文西密码，隐藏的奥秘由丝丝的线索串联绵延，有待专家抽丝剥茧，如剥洋葱般从外而内层层解析出数千数万数据下的隐晦含义。
要获得有意义的分析结果，恐怕不能如泼墨画般洒脱随兴所致。
从raw data 取得后，需要一连贯的分析流程(图一)，经过许多统计方法，才能条清理明的将raw data 整理出一初步的分析数据，当处理到取得实验组除以对照组的对数值后(log2 ratio)，大约完成初步的统计工作，可进展到下一步的进阶分析阶段。
图一、整体分析流程。
基本上raw data 取得后，将经过从最上到下的一连串分析流程。
(1) Rosetta 软件会透过统计的model，给予不同的权重来评估数据的可信度，譬如一些实验操作的误差或是样品制备与处理上的瑕疵等，可已经过Rosetta error model 的修正而提高数据的可信值；(2) 移除重复出现的探针数据；(3) 移除flagged 数据，并以中位数对荧光强度的数据进行标准化(Normalized) 的校正；(4) Pearson correlation coefficient (得到R 值) 目的在比较技术性重复下的相似性，R 值越高表示两芯片结果越近似。
基因芯片实验原理与方法
长征途中的感人故事（精选5篇）长征途中的感人故事篇1长征，是决定中华人民是否能站起来的重要决策，长征路上无数英雄人物用自己的胸膛，堵住了敌人的炮火，许多热血青年纷纷加入共产党，在那艰难的长征路上，是战士们用自己的身躯，才铺平了我们如今幸福的生活道路。
在长征路上，战士要走过草地，那草地一望无际，只要一不留神，就有可能陷入沼泽。
战士们的粮食吃完了，只能忍饥挨饿。
他们一天走200多公里的路，休息的时候坐下，可有的战士坐下就再也站不起来了。
穿过草地，他们又面对着一座座雪山的挑战，战士们一个个毫不犹豫的上了山。
在雪山上，他们每时每刻都有可能面临掉下去与雪崩的危险，他们饿了就杀马吃、后来就用皮带、棉花、草根来充饥，战士们的体力已经快支撑不住了，便走一百步休息一下，后来减到三十步，就不能再减了，如果再减的话，就会永远长眠在雪山上了。
过雪山时，战士们在零下30度穿着单衣，一个个冻的手发红。
牺牲的战士5个人或6个人一起埋在雪地里，剩下的战士望着那里恋恋不舍的含泪而去，那些英勇的战士翻越了20多座雪山，受尽了磨难，牺牲了成千上万名战士。
长征终于胜利了!中华人民站起来了!长征，我为你骄傲，为你自豪，泪水与血水汇成了一条小溪，翻起朵朵长征事迹的浪花，在这幸福的岁月里，这条小溪依然在人们心中流淌着……长征途中的感人故事篇2去年暑假，我读过一本让我深深感动的书——长征路上的故事。
红军在长征的时候，遇到了许多的困境：红军要过的草地是荒芜人烟的，甚至连鸟兽也没有，只有大片大片绿油油的水草，一不小心，就会踩进烂泥潭，越陷越深;红军一路上衣杉褴褛，在爬雪山的时候经常被凛冽的寒风吹袭;红军过大渡河时，由于敌人先在桥上做了埋伏，把桥上的木板全部都拿掉了，所以让红军很前进，他们一边爬铁索桥，还一边与敌人交战……红军是多么顽强啊!面对这么多的困难，他们毫不退缩。
没有粮食了，他们就用野菜、野果、树皮充饥，有的时候，甚至把自己的枪皮带、皮鞋切成小块，煮了充饥;面对自然环境极其恶劣的夹金山，战士们强帮弱，大帮小，走不动的扶着走，扶不动的抬着走，战士们都豪迈地表示：“一定要让每个战友安全地越过夹金山。
原位合成法制造基因芯片技术概述
原位合成法制造基因芯片技术概述【摘要】近年来，DNA微阵列原位合成技术发展迅速，成为各国学者研究的重点。
原位合成法主要包括光脱保护法、喷印合成法、光致酸合成法、电喷雾合成法、虚拟掩模法和分子印章压印法等方法。
【关键词】基因芯片；原位合成法；分子印章压印法基因芯片的原位合成法是基于组合化学的合成原理，按精确设计的分布和顺序，通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序，运用现代高精度仪器和DNA合成化学技术在基片上直接并行定点合成所需的DNA 探针，这些合成的DNA微探针即构成了高集成度的DNA微阵列，即通称的“高密度基因芯片”。
其特点是：不仅由于集成了成千上万的密集排列的基因探针，能够在同一时间内分析大量的基因，使人们迅速地读取遗传密码，而且就同样探针数量的基因芯片来说，由于可实现大批量、低成本的集约化生产，制作成本将远低于点样法制作的寡核苷酸基因芯片，并且重复性好。
近年来，DNA微阵列原位合成以及相关技术（芯片微阵列设计及探针优化、基片修饰改性、靶基因标记方法、结果检测及分析仪器等）一直是研究的热点，代表着基因芯片的技术水平和发展趋势。
原位合成法制造基因芯片技术和方法有以下一些。
1、光脱保护法该技术为美国Affymetrix公司首创和拥有。
根据人为合成寡核苷酸是由3’端开始而终止于5’端的特点，该技术的核心是创造性地在核苷酸单体的5’端修饰了一个光敏基团及将微电子行业的光刻技术与DNA合成技术有机地结合在一起。
在进行DNA微阵列原位合成前，先设计好各阵列点对应的探针碱基序列，整个DNA微阵列各探针的第一个碱基构成整个芯片上的第一层，第二个碱基构成第二层，……，然后按照各层碱基的分布情况每层设计四块掩模，每张掩模的透光区域分别对应于该层碱基中四种碱基中的一种。
在进行DNA微阵列合成前，还需对芯片基体材料进行一定的修饰处理。
所谓修饰处理，就是通过一系列物理和化学处理过程，使基体材料表面带有可与核酸单体3’端共价偶联的功能基团（如-OH、-CHO和-NH2等）。
基因芯片的必备知识和操作流程
基因芯片技术的诞生为生物技术工作人员打开了一道科研的便利之门，曾被评为1998年年度十大科技进展之一。
本文对基因芯片的实验原理、技术基础、分类、用途、操作主要环节等内容做详细的介绍。
基因芯片技术的诞生为生物技术工作人员打开了一道科研的便利之门，曾被评为1998年年度十大科技进展之一。
本文对基因芯片的实验原理、技术基础、分类、用途、操作主要环节等内容做详细的介绍。
1.基本原理和技术基础基因芯片以DNA杂交为基本原理，基于A和T、G和C的互补关系。
它是在探针的基础上研制出的。
所谓探针是一段人工合成或筛选出的已知顺序的碱基序列，样品分子上连接有一些cy3、cy5等可检测的物质。
经激光共聚焦荧光显微镜检出杂交或反应信号，通过计算机处理、分析，即可获得所需信息。
例如，用红、绿荧光分别标记实验样本和对照样本的cDNA，混合后与微阵列杂交，可显示实验样本和对照样本基因的表达强度(显示红色、绿色或黄色)，由此可在同一微阵列上同时检测两样本的基因表达差异。
在基因芯片工作过程中，固定位点使用不同分子生物学技术和碱基互补配对原则与待测基因片段杂交，并通过自动阅读设备分析杂交结果，达到定性、定量分析的目的。
基因芯片通过应用平面微细加工技术和超分子自组装技术，把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。
基因芯片的检测主要建立在放射标记技术、荧光标记技术、质谱分析、化学发光等技术上。
使用荧光标记的基因芯片需要专用的荧光扫描仪。
对于高密度的基因芯片，目前最常用的是激光共聚焦显微镜和高性能的冷却CCD。
目前专用于荧光扫描的扫描仪大致分为两类：一类是基于CCD(charge-coupled device，电荷耦合装置)的检测光子;另一类则是基于PMT(photomultiplier tube，光电倍增管)的检测系统。
生物芯片的发展得益于微细加工技术和现代分子生物技术的结合。
基因芯片数据分析
(1) cDNA microarrays
cDNA clones
载玻片
差异表达基因的筛选
Treatment / control Normal / tumor tissue Brain / liver …
荧光标记的靶基因
(2) DNA chips
DNA chips的制备：Affymetrix photolitography
探针长度：25 bp 每个基因：22-40个探针 Perfect Match (PM) vs.
MisMatch (MM) probes
A. 选择硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等支持物 B. 采用光导化学合成和照相平板印刷技术在硅片等表面合成寡核苷酸探 针; 或者通过液相化学合成寡核苷酸链探针，或PCR技术扩增基因序列， 由阵列复制器，或阵列机及电脑控制的机器人，将不同探针样品定量点 样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上 C. 紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片
基因芯片数据分析
1. 基因芯片(Microarray) 2. 图像处理与数据标准化 3. 基因芯片的数据分析
1. 基因芯片简介
基因芯片 (1987): 固定有寡核苷酸、DNA或cDNA等 的生物芯片。利用这类芯片与标记生物样品进行杂 交，可对样品基因表达谱生物信息进行快速定性和 定量分析。
高通量、点阵以及Northern杂交 同时测定细胞内数千个基因的表达情况 将mRNA反转录成cDNA与芯片上的探针杂交
芯片的体积非常小：微量样品的检测 基因表达情况的定量分析
生物芯片的基本要点
基因芯片数据标准化
基因芯片数据标准化基因芯片技术的发展为生物医学研究提供了全新的视角和方法，使得科学家们能够更加深入地了解基因的表达和调控机制。
然而，基因芯片数据的标准化问题一直是该领域的一个重要挑战。
标准化是指将原始数据转化为可比较的形式，以便进行数据分析和挖掘。
本文将探讨基因芯片数据标准化的意义、方法和挑战。
首先，基因芯片数据标准化的意义非常重大。
标准化可以消除不同芯片平台、实验批次和实验室之间的技术差异，使得数据具有可比性和可重复性。
这对于不同研究团队之间的数据共享和比较具有重要意义。
此外，标准化还可以提高数据的质量和准确性，为后续的生物信息学分析奠定基础。
其次，基因芯片数据标准化的方法主要包括数据预处理、正则化和标准化。
数据预处理包括背景校正、数据过滤和缺失值处理，以确保原始数据的质量。
正则化是将原始数据进行归一化处理，消除不同样本之间的技术差异。
标准化则是将归一化后的数据进行比较和统一化处理，以便进行后续的数据分析。
然而，基因芯片数据标准化面临着诸多挑战。
首先，不同芯片平台和实验设计会导致数据的技术差异，如何有效地消除这些差异是一个关键问题。
其次，标准化方法的选择和参数的设定对结果具有重要影响，如何选择合适的方法和参数是一个需要深入研究的问题。
此外，基因芯片数据本身具有高维度和复杂性，如何有效地进行标准化和降维处理也是一个挑战。
综上所述，基因芯片数据标准化是基因芯片技术研究中的一个重要环节。
标准化的意义重大，可以提高数据的可比性和可重复性，为后续的生物信息学分析奠定基础。
标准化的方法包括数据预处理、正则化和标准化，但也面临诸多挑战。
因此，我们需要不断探索和改进标准化方法，以应对日益增长的基因芯片数据分析需求。
希望本文的讨论能够为相关研究提供一些参考和启发，推动基因芯片数据标准化领域的进一步发展。
基因芯片分析的理论与方法
原理
基因表达实际上是细胞、组织、器官受遗传和环 境影响的结果。 一个基因的转录和表达由细胞的生化状态所决定， 在一个基因的转录过程中，一组转录因子作用于 该基因的启动子区域，控制该基因转录，而这些 转录因子本身又是其它基因的产物。 当一个基因通过转录、翻译形成功能基因产物后， 它将改变细胞的生化状态，从而直接或间接地影 响其它基因的表达，甚至影响自身的表达。多个 基因的表达不断变化，使得细胞的生化状态不断 地变化。
Expression Chips
Genomic Chips
Sequencing Chips
gene expression pattern Biological Sample Functional Information
基因芯片的分类
根据探针类型分类
cDNA-Chip < 2,000 n expression
GO发展了具有三级结构的标准语言 （ontologies）。根据基因产物的相关分子功能， 生物学途径，细胞学组件而给予定义，无物种 相关性。
关于KEGG
KEGG (Kyoto 书数据库）
Encyclopedia of Genes and Genomes) （京都大学基因和基因组百科全 KEGG 是系统分析基因功能的数据库， 将基因组的信息与基因功能联系起来， 旨在揭示生命现象的遗传与化学蓝图
KEGG中的通路分为五大类： 1． 新陈代谢通路 2． 遗传信息处理通路 3． 环境信息处理通路 4． 细胞内通路 5． 人类病症相关通路 PATHWAY提供所选定通路的参考资料、涉及的反应和 在其他生物中的通路情况。由GIF等平板文件类型图示， 方框显示为涉及的酶EC名称，圆滑框为反应类型，以 实线和箭头连接反应物和方向，虚线指向预测的反应类 型。
基因芯片小知识（二）数据分析
基因芯片小知识（二）数据分析发送生信到本公众号（freescience联盟）后台，查看系列相关文章~提取生物样品的mRNA并反转录成cDNA，同时用荧光素或同位素标记。
在液相中与基因芯片上的探针杂交，经洗膜后用图像扫描仪捕获芯片上的荧光或同位素信号，由此获得的图像就是基因芯片的原始数据（raw data），也叫探针水平数据。
获取探针水平的数据是芯片数据处理的第一步，然后需要对其进行预处理（pre-processing），以获得基因表达数据（gene expression data）。
基因表达数据通常用矩阵形式表示，称为基因表达矩阵。
基因表达矩阵的每一行代表一个基因的表达量，一列代表一个样本的所有基因的表达情况。
一背景（background）处理背景处理即过滤芯片杂交信号中属于非特异性的背景噪音部分。
一般以图像处理软件对芯片划格后，每个杂交点周围区域各像素吸光度的平均值作为背景。
但此法存在芯片不同区域背景扣减不均匀的缺点，同时会使1％～5％的点产生无意义的负值。
也可利用芯片最低信号强度的点（代表非特异性的样本与探针结合值）或综合整个芯片非杂交点背景所得的平均值做为背景。
Brown等提出利用整个芯片杂交点外的平均吸光度值作为背景的best-fit方法，使该问题得到较好的解决，并有效地提高了处理数据的质量。
背景处理之后，我们可以将芯片数据以矩阵的格式输出。
二数据筛选经过背景校正后的芯片数据中可能会产生负值，显然负值是没有生物学意义的。
数据集中还可能包括一些单个异常大（或小）的峰（谷）信号，它们被认为是随机噪声。
另外，对于负值和噪声信号，通常的处理方法就是将其去除。
然而，数据的缺失（除了上述原因会造成数据缺失以外，扫描的过程中也可能会产生缺失）对后续的统计分析（尤其是层式聚类和主成分分析）有致命的影响，所以在进行分析前需要数据筛选。
数据筛选的步骤是先筛选点样，然后是数据标准化、截断异常值，最后筛选基因。
cDNA芯片制备条件的优化
农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2005,13(4):516~523*基金项目：国家基础研究重点发展规划(973)项目（No.TG2000016104）和全国优秀博士学位论文作者专项资金资助项目（No.200151）资助。
李长绿：男，1975年生，博士。
E-mail:<lichanglv@>.**通讯作者。
Author for correspondence.E-mail:<chxwu@>.收稿日期：2004-05-14接受日期：2004-09-20·研究论文·cDNA 芯片制备条件的优化*李长绿王秀利李宁吴常信**(中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，北京100094)摘要:应用SpotBotT M 芯片点样仪对4种不同的芯片点样液(3×SSC 、50%DMSO 、3×SSC+1.5mol/L 甜菜碱和MSP)和5个不同公司生产的7种芯片片基(UltraGAPS T M 、GAPS Ⅱ、SuperAmine 、SuperAmine Barcoded 、Baio 氨基载玻片、PL-100C 多聚-L-赖氨酸片基和POLY-PREPTM 片基）进行了比较分析，发现UltraGAPS TM 、GAPS Ⅱ、SuperAmine 和SuperAmine Barcoded 片基用3×SSC+1.5mol/L 甜菜碱能得到最佳的点样和杂交结果。
同时对克隆PCR 产物的扩增和纯化方法、用于点样的DNA 样品的浓度、点样环境条件(温度、相对湿度等)、点样后芯片的处理方法、探针的标记方法、芯片的杂交及杂交后的处理等进行了比较、分析和优化。
应用优化后的条件成功地在每张芯片上点制27648个点，并杂交、扫描得到高质量的芯片结果。
关键词：cDNA 芯片；杂交；点样；优化Optimization of cDNA MicroarrayLI Chang-Lu WANG Xiu-Li LI Ning WU Chang-Xin**()Four types of printing solvent (3×SSC,50%的DMSO,3×SSC+1.5mol/L betaine and MSP)and seven printing sub-strates (UltraGAPS T M substrates,GAPS Ⅱsubstrates,SuperAmine Barcoded substrates,SuperAmine substrates,Baio Amine slides,PL-100C Poly-L-Lysine slides and POLY-PREP TM slides),came from five different companies,were compared and analyzed with the spotting robot of SpotBot TM .The results showed that the combination of four slides,UltraGAPS TM ,GAPS Ⅱ,SuperAmine andSuperA-mine Barcoded with 3×SSC+1.5mol/L betaine could produce the best printing and hybridization results,the optimized pa-rameters.At the same time,a comprehensive comparison,analysis and optimization of the amplification methods of clone DNA,the purification methods of PCR products,the concentrations of arrayed DNA in the printing solutions,the printing environment condi-tions (including environmental temperature,relative humidity and so on),the treatment methods of substrates after printing,the label-ing methods of probe,the conditions of hybridization and post-hybridization washing were carried out.The microarrays with 27648spots per substrate were successfully produced,and the high quality hybridization results were subsequently achieved using these opti-mizedconditions.cDNA microarray;hybridization;printing;optimizationcDNA 芯片又称为DNA 微阵列(microarray)、DNA 芯片或基因芯片，于20世纪90年代中期诞生于美国的斯坦福大学(Schena .,1995;1996)。
基因芯片的制作方法
3.5 原位合成法
操作平台
Affymetrix芯片的特点：
光导原位合成的寡核苷酸芯片 高密度的点阵技术 独特的PM-MM探针设计
1.光导原位合成原理
2.高密度的点阵技术
1平方厘米的面积至少可排列上百万个探针合成区（“点”)
3. Affymetrix独特的PM-MM探针设计
图3-11 PM-MM探针设计方案
手臂分子
特异性探针
探针分子与基片表面的作用方式
化学偶联：探针分子与基片表面活性基团发生化学 反应，生成新的共价键。
物理吸附：探针分子与基片表面通过次级键相连接。
3.4 点样仪及点样过程
接触式点样
非接触式点样
1. 接触式点样
点样针。 基本过程： 点样针接触探针溶液，通过浸润现象或毛细现象， 使液体转移到针尖或针的狭缝中。针尖再接触基片，样 品在基片上留下斑点，完成一次点样。
硫醇基修饰的玻片 环氧硅烷化修饰的玻片等
（1）氨基修饰的玻片
羟基
氨基
图3-3 APS修饰玻璃表面反应示意
（2）同型双功能偶联剂包被修饰的玻片
异硫氰基
对苯乙异硫氰酸
醛基
戊二醛
连接分子
手臂分子
特异性探针
（3）连接硫醇基修饰的玻片
硫醇基
图3-7 SMPB连接硫醇基核苷酸和氨基玻片
（4）环氧硅烷化修饰的玻片
不需要 寡核苷酸 约25nt 需要 不需要 高 高 需要
直接点样法
寡核苷酸，cDNA，基因组 DNA，蛋白等 不限制 不需要 需要 低 低
应用
基因表达，突变检测
基因表达，突变检测，CGH
3.2 芯片载体的制作
1. 常见的载体类型
基因芯片实验原理及方法
基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)，又称DNA微阵列(DNA Micorarray)，是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。
在一定条件下，载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。
如果把样品中的核酸片段进行标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。
详细实验方法∙基因芯片实验原理与方法实验材料∙组织或细胞样本试剂、试剂盒∙Oligo-dT (T15) - Roche∙dNTPs∙RNasin∙Superscript II∙Cot-1 DNA∙EDTA∙NaOH∙Tris仪器、耗材∙扫描仪：ScanArray 3000∙图像处理软件：Genepix 3.0∙Cartesian 7500点样仪∙硅烷化玻片∙PCR仪器∙Scan Microarray一、目的本实验的目的是学会cDNA芯片的使用方法。
了解各种基因芯片的基本原理和优缺点。
基因芯片这一技术方法在1991年的Science杂志上被首次提出，其高通量、并行检测的特点适应了分析人类基因组计划所提供的海量的基因序列信息的需要，可以说，人类基因组计划是基因芯片技术发展的原因，而对深人研究基因突变和基因表达的有效方法的需求又是促进基因芯片技术发展的动力。
由于基因芯片高速度、高通量、集约化和低成本的特点，基诞生以来就受到科学界的广泛关注，正如晶体管电路向集成电路发展的经历一样，分子生物学技术的集成化正在使生命科学的研究和应用发生一场革命。
根据固定在芯片载体上的核酸分子的不同，基因芯片可以分为cDNA芯片和寡核昔酸芯片等。
寡核昔酸芯片主要基于光引导聚合技术，该技术是Affymetrix公司开发的专利技术，由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
二、原理基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)，又称DNA微阵列(DNA Micorarray)，是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。
基因芯片数据标准化
基因芯片数据标准化1芯片数据分析中的标准化主要分为芯片内标准化和芯片间标准化。
2芯片内标准化根据目的不同可分为消除染色偏差的Lowess Normalization，消除点样针头引起的空间差异的Print-tip Normalization。
3常用的芯片间标准化有Quantile Normalization，Global Normalization。
4对基因芯片数据的标准化处理，主要目的是消除由于实验技术所导致的表达量(Intensity)的变化，并且使各个样本(sample)和平行实验的数据处于相同的水平，从而使我们可以得到具有生物学意义的基因表达量的变化。
5双通道的cDNA芯片标化方法如下：MA plot作图是用来观察芯片数据的分布情况，其中：M=log2R/GA=log2RG^1/2以M(log ratio表达量)为纵坐标，A(log intensity表达量)为横坐标做出数据的散点分布图。
片间标准化(multiple slides normalization)--中位数标准化（Median Normalization）由于五种组织（seeding、tiller、root、panicle1、panicle2）是分别在五张芯片上作杂交试验的，所以第一步的标准化是将五张试验芯片的数据调整到同一水平，常用的方法是平均数、中位数标准化(mean or median normalization)。
即：将五组实验的数据的log ratio 中位数或平均数调整为 0。
对于双通道数据来说，这种标准化方法就是将每张芯片上的数值减去各自芯片上对数比值的中位数，这样该芯片的对数比值中位数就变成了0。
对于单通道数据（e.g.,Affymetrix），首先在待标准化的芯片与参照芯片上的每个对应基因上计算差值，然后在待标准化的芯片上减去该差值的中位数，以使两者间的总差值为0。
--分位数标准化（Quantile Normalization）一般芯片的杂交实验很容易产生误差，所以经常一个样本要做3~6 次的重复实验。
HPV基因芯片检测装置的匀光照明设计
HPV基因芯片检测装置的匀光照明设计HPV基因芯片检测是一种常见的临床检测方法，可以快速、准确地检测出HPV病毒的感染情况。
在HPV基因芯片检测中，匀光照明是一个关键的环节，它能够确保芯片检测的准确性和可靠性。
因此，在设计HPV基因芯片检测装置时，匀光照明设计是一个非常重要的环节。
一般来说，匀光照明设计应该满足以下几个基本要求：1.匀光性好。
要保证芯片上所有基因探针的信号强度尽可能均匀，从而避免误判或漏判的情况。
2.亮度稳定。
由于实验中需要进行多次检测，匀光照明的亮度应该保持稳定，否则会对数据的准确性产生影响。
3.光源均匀。
光源的位置应该尽量均匀，并且保证各个光源的光强度相同，从而确保整个芯片区域光源均匀。
在匀光照明设计中，采用电子线性光源来实现匀光照明，是比较常见的方法。
电子线性光源具有尺寸小、发光效率高、使用寿命长等优点，能够满足匀光照明的基本要求。
但是，由于光源的位置和数量等因素的影响，光源的均匀性和亮度稳定性往往难以达到最佳状态。
为了解决这个问题，需要对匀光照明进行优化设计。
一种常见的优化设计方案是采用多通道LED光源。
在这种方案中，采用多个LED光源来进行照明，每个LED光源照射一定范围内的芯片区域，从而实现芯片区域的均匀照明。
同时，多通道LED光源也可以实现亮度调节，以达到更好的亮度稳定性。
除了多通道LED光源，还可以采用反射镜来实现匀光照明。
反射镜具有优良的反射性能，在反射后可以将光线均匀地照射到芯片表面。
反射镜的位置和倾斜度可以调整，以实现匀光照明的需求。
总之，匀光照明设计是HPV基因芯片检测装置中非常重要的一环，直接影响到检测结果的准确性和可靠性。
为了实现更好的匀光照明效果，可以采用多通道LED光源、反射镜等辅助手段，从而实现更好的均匀性和亮度稳定性。
HPV基因芯片检测质控点设计和参数优化研究
HPV基因芯片检测质控点设计和参数优化研究兰金芝;刘扬;徐澍;张金娟;王欢;肖俊;江银辉;陈腾祥【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2018(043)010【摘要】目的:设计人乳头状瘤病毒(HPV)基因芯片的质量控制点,优化质量控制探针和人β珠蛋白基因引物浓度以及HPV引物浓度比例,以提高基因芯片的检测质量.方法:收集临床HPV患者宫颈刮片样本,提取样本HPV58的DNA,用HPV通用引物扩增病毒DNA;利用人β珠蛋白引物扩增样本中的β珠蛋白DNA,将扩增的PCR 产物与线性化的pMD18-T载体连接,构建人β珠蛋白和HPV58 L1区DNA质粒,转化大肠杆菌后,进行单克隆培养,获得HPV58样本和人β珠蛋白的DNA模板;以HPV58和人β珠蛋白DNA基因信息设计并制备扩增HPV和人β珠蛋白探针及PCR引物,将人β珠蛋白基因探针固定于基因芯片作为质量控制点(QC),按1:20、1∶10、1∶5和1∶4比例混合单克隆HPV扩增引物与人β珠蛋白扩增引物,采用PCR反向点杂交技术,对模板进行扩增后,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的产量,进行基因芯片孵育杂交和显色;用扫描仪扫描芯片,采用Image J软件对各阳性杂交信号点进行信号强度采集,计算最佳的人β珠蛋白扩增引物和HPV扩增引物浓度比值;将QC的探针点样浓度设为0.1 pmol/L、l pmol/L、10 pmol/L、50 pmol/L和100 pmol/L,检测信号强度,优化质量控制探针点样浓度.结果:扩增了HPV58病毒DNA和人β珠蛋白的DNA模板,设计了HPV58和人β珠蛋白探针及PCR引物;琼脂糖凝胶电泳检测分析发现,当人β珠蛋白扩增引物与HPV扩增引物的浓度比例为1∶10时,二者同时PCR扩增时,扩增的强度较为一致,得到的产物量相当,用此引物浓度比例进行PCR获得的产物与测试芯片进行杂交,显色的平衡性较好;对QC的点样浓度进行测试发现,当QC点样探针浓度为50 pmol/L时,可以获得最佳的检测效果.结论:通过对β珠蛋白扩增引物与HPV扩增引物的最佳浓度比例和质量控制探针最佳点样浓度的优化,提高了HPV检测点的检测质量.【总页数】6页(P1221-1226)【作者】兰金芝;刘扬;徐澍;张金娟;王欢;肖俊;江银辉;陈腾祥【作者单位】贵州医科大学基础医学院生理学教研室,贵州贵阳550004;贵州医科大学基础医学院生理学教研室,贵州贵阳550004;贵州医科大学临床医学院病理学教研室,贵州贵阳550004;贵州医科大学基础医学院机能学实验室,贵州贵阳550004;贵州医科大学基础医学院人体组织与胚胎学教研室,贵州贵阳550004;贵州医科大学生物与工程学院物理学教研室,贵州贵阳550004;贵州医科大学贵州省分子生物学重点实验室,贵州贵阳550004;贵州医科大学基础医学院生理学教研室,贵州贵阳550004【正文语种】中文【中图分类】Q789;R373;R446.5【相关文献】1.基因芯片检测妊娠期HPV感染情况及分型的研究 [J], 吴倩;林竞;赵丽华;林秋兰;王克杰;闫红燕2.基因芯片检测尖锐湿疣患者HPV感染及分型研究 [J], 林秋兰;林竞;赵丽华;王克杰;吴倩;闫红燕3.HPV基因芯片检测装置的匀光照明设计 [J], 刘忆惠; 陈建国; 甘振华; 杜民; 高跃明4.HPV基因芯片检测质控点设计和参数优化研究 [J], 兰金芝; 刘扬; 徐澍; 张金娟;王欢; 肖俊; 江银辉; 陈腾祥5.液态芯片检测妇女HPV感染及基因亚型分布 [J], 熊玉娟;刘本荣;朱庆义因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
原位合成的基因芯片制备技术生物芯片制备中材料的固定-中国试剂网
原位合成的基因芯片制备技术生物芯片制备中材料的固定方式主要包括原位合成法和点样法两种，点样法又分为接触式点样法和非接触式点样法。
原位合成法主要用于基因芯片的制备，点样法可用于基因芯片和蛋白质芯片的制备。
细胞芯片主要是通过细胞本身的贴壁生长来完成固定。
组织芯片通过一些黏性溶剂(如石蜡)使组织切片固定在载体上。
某些微流体芯片不需要材料的固定，只是通过硅材料上大量的微通道来完成检测，另外一些微流体芯片通过特殊的作用(如蛋白质的特异性结合、序列互补DNA片断等)把材料固定在微粒上来完成检测。
在此我们主要介绍原位合成技术和直接点样技术。
原位合成是直接在固体基质上用4种单核苷酸合成所需的DNA片段。
Affymetrix公司的GeneChipTM是高密度寡核苷酸微阵列原位合成的代表，制造工艺采用原位光刻合成。
其他原位合成制造工艺还有光敏抗蚀层并行合成法、微流体通道在片合成法、喷印合成法及分子印章在片合成法。
原位合成芯片是指将多个寡核苷酸片段用单核苷酸底物直接合成到载体的特定位置上制备的芯片，主要包括以下几种制备方法。
1．Affymetrix公司的方法它是将光平版印刷技术(photolithographicapproach)运用到DNA合成化学中，利用固相化学、光敏保护基及光刻技术得到位置确定、高度多样性的化合物集合。
该法利用光敏保护基来保护碱基单位的5’羟基。
第一步利用光照射使固体表面上的羟基脱保护，然后固体表面与光敏保护基保护、亚磷酰胺活化的碱基单体接触，合成只在那些脱保护基的地方进行。
光照区域就是要合成的区域，该过程通过一系列掩膜来控制。
如此循环以合成寡核苷酸，直到设定的寡核苷酸长度。
每个寡核苷酸片段代表了一种特定的基因存在于DNA芯片的特定位置上，可合成任意序列15—25个碱基长度的片段。
这种方法可使每cm2上的探针数量达到106个，每种探针为5～10btm的方形区域，探针的间距约为20btm。
这种方法的最大的优点就是可以在较小的区域内制造大量不同的探针，如1cm2可以有400 000种探针。
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基因芯片是指将大量核酸片段 （寡核苷酸、 基 因 组 ,-.、 有序地固化于支 +,-.、 +/-. 或 0-.） 持物 （如玻片、 硅片或膜等载体） 的表面， 组成密集二 维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶 分子杂交， 通过特定的仪器 （如荧光共聚焦扫描仪或 电荷耦联摄影相机等） 对杂交信号的强度进行快速、 并行、 高效的检测分析， 从而判断样品中靶分子的数 量。基因芯片的基本流程包括芯片的制备、 靶样品的 制备和标记、 杂交、 杂交信号的获取和数据分析等。 其中芯片的制备是关键的一步，关系到芯片的质量 和可信度。因研究目的不同、 期望制作的芯片类型不 同， 制备芯片的方法也不尽相同。以,-. 为例， 基本 可以分为两大类，一类是原位合成，适用于寡核苷 酸； 一类是预合成后直接点样， 可用于大片断 ,-. 和 寡核苷酸。由于原位合成法比较复杂， 除了在基因芯 片研究方面享有盛誉的 .112345678 等公司使用该技术 合成探针外， 研究者大多使用合成后点样法。点样的 方式又分为两种。其一为接触式点样， 即点样针与固 相支持物表面接触， 将样品留在支持物上， 显著优点
水洗， 室温干燥。
’>0/? 膜芯片的制备
实验用基片的选取
仪对各氨基片、醛基片、多聚赖氨酸片分别进行全片扫描检 测。 扫描参数为 B0C/7/D=/7E ： *>: ； !6FE7 D/GE7： H; ； I5#： H; 。 选取荧光背景信号最弱基片供试。
21:
荧光标记 I*$ 产物的制备 在总体积为 299 !0 的 反 应 体 系 中 掺 入 荧 光 素 *>:JK*#I，
结果 取样孔液面高度对预点数目的影响 实验显示液面高度为 2 PP，预点 49Y:9 个样品
41:
点样时针的下降速度及在玻片上的停留时间对 扫描结果显示， 速度越大， 流体惯性导致产生的
样品点的影响
医生在线
黄海燕等： 基因芯片接触式点样条件的优化
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积减少约$ ’ )。且肉眼可见点制!# 个点以后，样品点 颜色发白， #% 个点之后几乎看不到可识别的点。扫 描结果也显示 #% 个点之后的信号明显减弱。这是由 于湿度不够，样品孔内和针缝内虹吸上来的样品液 蒸发严重，导致盐浓度升高。故湿度不够不利于得 到均一的样品点。如点样时间较长，影响尤甚。当 基片上有些区域点间出现不同程度 +,为 -*. 、 C*. ， 的液滴粘连现象。这是由于湿度过大，玻片表面形 成一层水膜， 与 )0 112 极性相同， 易于凝成大液滴
点后即可达到较高的点的均一性。液面高度为4 PP 时， 预点 39 个样品点之后才可达到较高的均一性， 并 且 39YU9 个样品点之间的均一性并非一直很理想， 所 以并非样品量越多越好。要想取的重现性好的样品 点，既要保证点样针靠虹吸作用能使针孔内载液面 上升至一定高度，又不能使针尖外侧沾染过多的点 样液。以样品孔内液面高度 2 PP 预点 :9 个点为宜， 既节约样品， 又能得到理想的样品点。结果参见图2 。
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基片的处理和选择
医生在线
249
21412 21414 2141:
醛基片的制备 氨基片以 ;<戊二醛水溶液浸泡 91; = ， 将 ’>0/? 膜固定于洁净玻片上。 用 %@6?A776>3999 荧光共聚焦扫描
生
物
技
术
通
讯
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./0123
’/14
5678 499:
甚至大面积扩散。-%. 为最适条件， 点直径和荧光强 度均一性较好（此结果与实验室内温度 +D 和相对湿 度+,相关， 进行本实验时， 。 参 +,为**.， +D为!-E） 见图@ 。
酸片上的液滴面积较大， 且边缘圆润规整， 接近于圆 形， 点的均一性高， 最为美观。氨基片上印迹的液滴 面积最小， 形态不很规则。醛基片点样效果界于二者 之间。这与玻片表面处理方法和与核酸样品的结合 原理有关。在多聚赖氨酸包被的玻片表面点制核酸 是利用物理吸附的原理。而氨基片和醛基片利用的 则是在核酸和玻片表面发生化学反应，形成化学键 的原理。
样品液滴越大， 与玻片的接触时间越长， 会将此效应 放大。而接触时间过短 （$* &(） ， 会导致样品点的不 规则。速度为 ) && ’ (，接触时间为 !* &( 为优化条 件。 也尤利于一次取样点制较多的样品点 （?!%%个） 。
图0
以 "1)223*4 ")(523)* 点样液点制不同基片 >" 多聚赖氨酸片 F G" 醛基片 F 2" 氨基片
分 别 取 29 、 49 !0 至 :U3 孔 方 形 平 底 板 （液 面 高 度 分 别 为 2 和 4 。ISV%>F;;99 点样仪通过机械手臂运行点样程序。三根点 PP） 样针平行接触式点制醛基片。 针在取样接触 :U3 孔板底部和点 样接触基片时针柄抬出 %I+:4 I7S?W=E6K 约 91; PP 。分别点制 以荧光共聚焦扫描仪进行扫描 299 个样品点。室温避光干燥， 并用 XC6?WA776> 软件对信号进行量化分析。
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物
技
术
通
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研究报告
基因芯片接触式点样条件的优化
黄海燕! 韩金祥
!山东省医药生物技术研究中心 " 济南 &9##W&#
摘要：样品的点制是基因芯片制备中的关键一步， 影响因素众多， 如点样液和液面高度、 基片的选择、 控制湿度、 点样 针运行速度、 与基片接触时间等。对玻片点制各条件进行了摸索和优化， 并对膜芯片的点制参数进行筛选， 以期得到 规整和重现性好的样品点。 关键词 ! 基因芯片 " 接触式点样 " 玻片 " 膜芯片 " 优化 中图分类号 ! XYUW 文献标识码： .
21314
不同 基 片 对 样 品 点 的 影 响
以 :L %%* 样 品 液 点 样 ， 上
样量和预点数目按 21312 所得结论。单根 %5I: 针 取 样 ， 预点后 依次点至氨基片、 醛基片、 多聚赖氨酸片， 每 张 片 上 点3个 点 。 点样后处理同 21312 。
2131:
点样针下降速度及与基片接触时间对样品点的影响 单根 %5I: 针点制。点样针接触玻 以 :L %%* 样品液点样，
收稿日期： &##&%""%&Y 基金项目： 国家攻关项目 I 山东省重点攻关项目 I 山东省优秀中青年 科学家基金项目 作者简介： 黄海燕 （"$YW% ） ， 女， 硕士研究生。 C%3?7K!2?@HHYWc"W(B+;3
是可制备高密度阵列， 通常可达到 & 9## :;5< = 33&； 其二为非接触式点样， 即喷点， 是以压电原理将样品 通过毛细管直接喷至支持物表面。因喷点的斑点较 大， 故探针密度低， 通 常 只 有 *## :;5< = 33&， 多用于 蛋白芯片的制备。 我 们 利 用 本 实 验 室 的 >?654<7?@ 公 司 的
2131;
湿度控制对样品点的影响
保湿罩内相对湿度值
414
不同基片对样品点的影响 见图 4， 同条件下扫描结果显示印迹于多聚赖氨
（$+ ） 分 别 设 置 为 N;< 、 T;< 、 U9< 、 U;< 、 H9< 。 以 :L %%* 样 品 点样后处 液点样， 以醛基片为基片， 单针分别点 299 个样品点。 理同 21312 。
双引物各 N !0， 掺入荧光素的 3 29L 缓冲液 29 !0， 模板 M’A、 种 K’#I 混 合 物 2N !0 （KA O , O ##I 214; PP/0 O !， K*#I 212; ， PP/0 O !， *>:JK*#I 9129 PP/0 O !） !"# M’A 聚 合 酶 （; Q O ， 加 水 至 299 !0。 反 应 条 件 ： !0） H3R ; PS? 预 变 性 ； H3R :9
T4R N9 F， :9 个循环。使用 5S@7/*/?299 纯化柱 F， N9R :9 F，
纯化荧光产物。 取适量纯化产物分别用 :L %%* 、 点样液、 ;9<
M5%)稀释至终浓度 29 !P/0 O !。 213 21312
样品点制最佳条件测试 取样液面高度对点的均一性影响
:L %%* 的 样 品 液
1?+5;6< :S67@D 5H7< R6;+4<<， <S+H ?< 5H4 H47DH5 ;1 1KS7: <?3RK4 ， +H;<4@ <S]<56?54 ， HS37:752 +;@56;K， R7@ ^4K;+752 ?@: 3?@2 48R46734@5< 5H4 5734 ;1 +;@5?+57@D _75H 5H4 <S]<56?54B J@ ;6:46 5; ?+‘S764 7664DSK?6 ?@: +;@<7<54@5 <R;557@D :;5<， H?^4 ]44@ :;@4 5; 4<5?]K7<H 5H4 ]4<5 +;@:757;@<B AS75?]K4 R?6?34546< ;1 R6;:S+7@D -2K;@%+H7R H?^4 ?K<; ]44@ 4@S64:B 23- 4’,51： D4@4 +H7R ； +;@5?+57@D R67@57@D ； <K7:4 ； -2K;@%+H7Ra ;R5737b?57;@