蛋白的纯化
蛋白质纯化知识详解
蛋白质纯化知识详解一、蛋白纯化原则蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。
蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。
一般蛋白纯化采用的方法为树脂法。
粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速、颗粒大、粒径分布宽，并可以迅速将蛋白与污染物分开，必要时可加入相应的保护剂（例如蛋白酶抑制剂），防止目的蛋白被降解。
精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些分子量大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。
选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。
仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。
二、纯化程序分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。
1、前处理分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。
为此，动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。
然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。
动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。
植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。
细菌细胞的破碎比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。
蛋白质纯化工艺
蛋白质纯化工艺蛋白质纯化工艺是一种将混合物中的蛋白质分离和纯化的过程。
蛋白质在生物科学和生物技术领域有着广泛的应用，因此蛋白质纯化工艺的研究和开发具有重要的意义。
蛋白质纯化的目的是从复杂的生物样品中分离出所需的蛋白质，并去除其他杂质。
在蛋白质纯化过程中，常用的方法包括离子交换、凝胶过滤、亲和层析、透析等。
离子交换是一种常用的蛋白质纯化方法，它基于蛋白质和离子交换树脂之间的相互作用。
树脂上的固定离子与溶液中的离子相互吸附，从而实现蛋白质的分离和纯化。
离子交换方法通常分为阳离子交换和阴离子交换两种。
阳离子交换树脂选择性地吸附带有负电荷的蛋白质，而阴离子交换树脂则选择性地吸附带有正电荷的蛋白质。
凝胶过滤是一种基于蛋白质的分子大小和形状差异进行纯化的方法。
凝胶过滤方法通过将混合物通过一系列孔径不同的凝胶材料，使大分子蛋白质被滞留，而小分子溶质则通过凝胶。
这种方法适用于分离不同分子量的蛋白质。
亲和层析是一种利用蛋白质与特定配体之间的亲和力进行纯化的方法。
亲和层析方法可以利用蛋白质与金属离子、抗体、配体等之间的特异性相互作用，实现蛋白质的选择性吸附和纯化。
亲和层析方法具有选择性强、纯化效果好的优点，因此在蛋白质纯化中得到广泛应用。
透析是一种通过溶液中的溶质浓度梯度来实现溶质扩散的方法。
在蛋白质纯化中，透析方法常常用于去除溶液中的低分子量杂质，如盐和小分子有机物。
透析方法的基本原理是将蛋白质溶液与含有较低浓度的缓冲液分隔开，通过半透膜的渗透作用，使溶液中的小分子杂质扩散到缓冲液中，从而实现蛋白质的纯化。
除了上述常用的蛋白质纯化方法外，还有许多其他方法，如亲水交换色谱、逆流电泳、等电点聚焦等。
这些方法的选择取决于所需纯化的蛋白质特性、目标纯化程度和纯化效率等因素。
蛋白质纯化工艺是一项重要的生物技术工作，通过合理选择和组合不同的纯化方法，可以实现对复杂混合物中蛋白质的高效分离和纯化。
蛋白质纯化工艺的研究和应用将为生物科学研究和生物技术开发提供有力支持，也将为蛋白质相关领域的进一步发展带来新的机遇和挑战。
蛋白质分离纯化
性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 (3)粗提: 离心除去固体杂质后，可经过沉淀法、超
滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。 (4)精制：可用层析法、电泳法等进行精制。 (5)成品加工：测定蛋白质旳性质并干燥成成品。
－5℃，25％乙醇沉淀卵清蛋白。
蛋白质旳纯化措施
等电点沉淀法
蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分 子之间旳静电排斥力最小，因而轻易汇集 形成沉淀。
当蛋白质混合物溶液旳pH 被调到某一成份 旳等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉 淀出来。而那些等电点高于或低于该pH 旳 蛋白质依然留在溶液中。
该法合用于在等电点pH稳定旳蛋白质。
b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂
+
基质
c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离
+
+ 杂质
基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex
应用
分离纯化酶、 抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶旳构造与功能
d. 偶联复合物经解离后，得到纯旳待纯化分子
+
蛋白质旳纯化措施
在外电场旳作用下，带电颗粒将向着与其电性 相反旳电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质 溶液旳pH值不等于等电点时，蛋白质颗粒均带 有不同旳电荷。因为不同蛋白质旳分子量不同， 所带旳电荷不同，因而在电场中移动旳速度也 不相同。
用已知分子量旳蛋白质作为原则，则能够估算出 不同蛋白质旳分子量。
离心技术
1．离心机类别 一般离心机 6000转/分 高速离心机 2-3万转/分 超速离心机 3万转/分
2．沉降系数（S）概念
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法蛋白质是细胞中的重要生物大分子，具有多样的结构和功能。
为了研究蛋白质的性质和功能，需要将蛋白质从混合样品中分离纯化出来。
蛋白质的分离纯化方法有很多种，主要包括离心法、电泳法、层析法和亲和纯化法等。
下面将逐一介绍这些方法及其原理。
1. 离心法离心法是利用离心机将混合物中的蛋白质分离出来。
首先将细胞裂解，得到细胞裂解液，然后进行离心，以将细胞器、胞外物质和亲粒子（如蛋白质颗粒）分离。
离心可以根据不同物质的相对密度和大小进行分层分离，快速旋转离心机可以很好地分离出不同密度的颗粒。
2. 电泳法电泳法是将带电的蛋白质沿着电场移动，根据蛋白质的带电性质和大小分离的方法。
蛋白质可以根据电荷性质分为阴离子蛋白和阳离子蛋白，也可以根据亲水性质分为亲水性蛋白和疏水性蛋白。
电泳法常用的有SDS-PAGE、等电聚焦电泳等。
其中，SDS-PAGE可以根据蛋白质的分子量进行分离。
3. 层析法层析法是通过蛋白质与载体之间的亲和性或者分离介质之间的亲和性进行分离的方法。
层析法主要分为凝胶层析、离子交换层析、亲合层析和大小排阻层析等。
凝胶层析法是利用凝胶的网格结构来分离蛋白质，如凝胶过滤层析、凝胶过渡层析等。
离子交换层析法是利用蛋白质对离子交换树脂的吸附性质进行分离。
亲合层析法是通过亲和柱中的配体与蛋白质的亲和作用进行分离。
大小排阻层析法是根据蛋白质的分子量和形状进行分离。
4. 亲和纯化法亲和纯化法是利用特定的亲合剂与目标蛋白质之间的特异性亲和性进行分离纯化的方法。
亲和纯化主要包括亲和柱层析法、浸没纯化法、亲和剂电泳法等。
亲和柱层析法是将具有亲和填料的柱子与样品接触，通过洗脱再生的操作，将目标蛋白质从其他组分中分离纯化出来。
浸没纯化法是将特定亲合剂浸泡在蛋白质混合物中，使其与目标蛋白质发生亲和结合，然后以特定条件洗脱目标蛋白质。
亲和剂电泳法是负载亲和剂的凝胶片上进行电泳，使蛋白质与亲和剂结合，再通过电泳将其分离纯化出来。
四种蛋白纯化方法
四种蛋白纯化方法1. 溶液沉淀法溶液沉淀法是一种常用的蛋白纯化方法，适用于从复杂的混合物中分离目标蛋白。
该方法基于蛋白质在不同条件下的溶解度差异，通过添加盐类或有机溶剂来诱导蛋白质的沉淀。
步骤：1.样品制备：将待纯化的样品经过初步处理，如细胞破碎、组织切割等，得到含有目标蛋白的混合物。
2.溶解度测试：在不同条件下（如pH、温度、盐浓度等）测试目标蛋白质的溶解度，并确定最适合其沉淀的条件。
3.沉淀：根据前一步骤确定的最佳条件，向样品中添加盐类或有机溶剂，使目标蛋白质发生沉淀。
可以通过离心将沉淀物与上清液分离。
4.溶解：将沉淀物重新溶解在适当的缓冲液中，得到纯化后的目标蛋白。
优点：•简单易行，不需要复杂的设备和操作。
•适用于从复杂混合物中纯化目标蛋白。
缺点：•可能会导致非特异性沉淀，使得纯化后的蛋白含有杂质。
•沉淀方法对蛋白质的溶解度要求较高，不适用于所有蛋白。
2. 凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于分子大小的蛋白纯化方法，适用于分离不同分子量范围的蛋白。
该方法利用孔径可调的凝胶柱或膜来分离目标蛋白和其他小分子。
步骤：1.样品制备：将待纯化的样品经过初步处理，如细胞破碎、组织切割等，得到含有目标蛋白的混合物。
2.凝胶柱选择：根据目标蛋白的分子量范围选择合适孔径的凝胶柱或膜。
3.样品加载：将样品加载到凝胶柱上，并使用缓冲液进行洗涤，以去除小分子。
4.蛋白洗脱：通过改变缓冲液的组成或pH值，使目标蛋白从凝胶柱上洗脱下来。
5.收集纯化蛋白：将洗脱得到的蛋白收集起来，即可得到纯化后的目标蛋白。
优点：•可以根据分子量范围选择合适的凝胶柱，实现高效分离。
•纯化后的蛋白质纯度较高。
缺点：•操作相对复杂，需要一定的专业知识和技术。
•只适用于分子量差异较大的目标蛋白。
3. 亲和层析法亲和层析法是一种基于生物分子间特异性相互作用的蛋白纯化方法，适用于富含目标蛋白的混合物。
该方法利用目标蛋白与特定配体之间的亲和力进行分离和纯化。
蛋白纯化方法
蛋白纯化方法一、离心。
离心是一种常用的蛋白纯化方法，它利用蛋白质在不同离心速度下沉降速度的差异来分离蛋白。
通过逐步调整离心速度和时间，可以将混合物中的不同颗粒分离开来，从而得到目标蛋白的富集样品。
离心方法操作简单，适用于大多数蛋白质的初步富集。
二、凝胶过滤层析。
凝胶过滤层析是一种分子大小分离的方法，通过在凝胶柱中筛选不同大小的蛋白质分子，实现蛋白的分离和纯化。
这种方法操作简便，分离效果好，适用于大多数蛋白质的纯化。
三、离子交换层析。
离子交换层析是一种利用蛋白质表面电荷差异进行分离的方法。
在离子交换柱中，蛋白质会根据其表面电荷与离子交换树脂发生相互作用，从而实现蛋白质的分离和纯化。
这种方法操作简单，分离效果好，适用于具有不同电荷特性的蛋白质。
四、亲和层析。
亲和层析是一种利用蛋白质与亲和层析介质之间特异性结合进行分离的方法。
通过选择合适的亲和层析介质，可以实现对特定蛋白质的高效分离和纯化。
这种方法操作简单，适用于特定蛋白质的纯化。
五、逆流层析。
逆流层析是一种利用蛋白质与逆流层析介质之间的亲和性进行分离的方法。
通过逆流层析柱中的逆流洗脱，可以实现对蛋白质的高效分离和纯化。
这种方法操作简单，适用于特定蛋白质的纯化。
总结。
蛋白纯化是生物化学研究中不可或缺的重要步骤，选择合适的纯化方法对于获得高纯度的蛋白样品至关重要。
本文介绍了几种常用的蛋白纯化方法，包括离心、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析和逆流层析，希望能为您的实验提供一些参考。
在实际操作中，需要根据目标蛋白的特性和实验要求选择合适的纯化方法，并结合实际情况进行优化，以获得高质量的蛋白样品。
祝您的实验顺利，取得理想的结果！。
蛋白质的纯化
• 应用
• 脱盐 Sephadex G10、25 • 缓冲溶液交换 • 中间纯化 Sephadex G200 • 精纯 Sephacryl 、Superdex
常用填料
异：作用强弱 用途
亲和色谱
• 是利用生物分子间专一的亲和力而进行 分离的一种层析技术 。例如，抗原－抗 体、酶－底物或抑制剂、激素－受体、 糖蛋白—凝聚素等等。
• 目的蛋白纯品 制备抗体 偶联到基质上 层析分离
常用分析与检测技术
• 含量测定：凯氏定氮法、UV、Lowry 法、BCA法、Bradford法等
＋－ －＋ ＋ －＋
－
＋
－
＋－ － ＋
－
＋－
－ 蛋白质表面电荷疏水区域分布示意图
－
“盐促吸附层析”
在适当高盐浓度下，蛋白质的疏水残基与固定相上 的疏水配基产生吸附作用。
• 特点：它分离效率高，上样量大，特别 适合分离盐析沉淀的样品。
• 填料：烷基琼脂糖凝胶、苯基琼脂糖凝 胶，丁基琼脂糖凝胶，辛基琼脂糖凝胶 等。
常见问题分析
• 不吸附：缓冲溶液PH不对；离子强度太高； • 峰形不稳或出现奇异峰：柱床中有气泡或缓冲
溶液不纯 • 分辨率低：梯度太大；流速太高 • 前沿峰：柱过载；填充效果差；柱需再生 • 峰拖尾：样品在柱滤膜上或凝胶床顶部沉淀 • 基线随梯度上移：盐浓度临近CMC
疏水层析
＋
＋－ － －＋
＋
• 等电点沉淀：其局限是，须事先了解蛋白的PI；且沉淀过程中可 能发生变性和失活，部分蛋白等电点沉淀后不容易溶解，因此较 少用于目的蛋白的沉淀。用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的 沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。
常用的蛋白质纯化方法和原理
常用的蛋白质纯化方法和原理蛋白质的纯化是生物化学研究中非常重要的一步，纯化蛋白质可以用于结构解析、功能研究、动态过程研究等各种生物学实验。
常用的蛋白质纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法、亲和色谱法、逆渗透法和层析法等。
下面将对这些方法的原理和步骤进行详细阐述。
1. 盐析法盐析法是根据蛋白质在溶液中的溶解性随盐浓度的变化而变化的原理进行蛋白质的纯化。
该方法是利用蛋白质在高盐浓度下与水结合能力降低，使其从溶液中沉淀出来。
应用盐析法时，需要先调节溶液的盐浓度使蛋白质溶解，然后逐渐加入盐使其过饱和，蛋白质便会析出。
最后通过离心将蛋白质的沉淀物分离，得到纯化的蛋白质。
2. 凝胶过滤法凝胶过滤法是利用凝胶的pores 来分离蛋白质的一种方法。
凝胶通常是聚丙烯酰胺（也称作Polyacrylamide）或琼脂糖。
研究者将蛋白质样品加入到过滤膜上，较小的蛋白质能够通过pores，较大的分子则被排出。
通过选择不同大小的凝胶孔径，可以根据蛋白质的大小来选择合适数目的过滤膜。
凝胶过滤法需要进行缓冲液体积的连续换流，将蛋白质与其他杂质分离开来。
3. 离子交换色谱法离子交换色谱法是利用蛋白质与离子交换基质之间静电吸引力的不同而分离的方法。
离子交换基质通常是富含正离子或负离子的高分子材料。
在离子交换色谱法中，样品溶液在特定的pH 下流经离子交换基质，带有不同电荷的蛋白质能够与基质发生反应，吸附在基质上。
为了获得纯化蛋白质，需要通过梯度洗脱，逐渐改变缓冲液pH 或离子浓度，使吸附在离子交换基质上的蛋白质逐渐释放出来。
4. 亲和色谱法亲和色谱法是利用蛋白质与特定的配体相互作用特异性进行分离的方法。
配体可以是天然物质，如金属离子、辅酶或抗体，也可以是人工合成的结构。
在亲和色谱法中，样品溶液经过含有配体的固定相，与配体发生特异性相互作用，蛋白质与其它组分分离。
然后可以通过改变某些条件（如pH、温度或离子浓度）来洗脱纯化的蛋白质。
蛋白质纯化
蛋白质纯化蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。
一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。
为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。
蛋白纯化的一般原则蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。
蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。
一般蛋白纯化采用的方法为树脂法。
粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速、颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，必要时可加入相应的保护剂（例如蛋白酶抑制剂），防止目的蛋白被降解。
精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些分子量大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。
选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。
仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。
蛋白质纯化的一般注意事项在进行任何一种蛋白质纯化得时候，都要时刻注意维护它的稳定，保护它的活性，有一些通用的注意事项需要牢记，它们包括：1.操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。
2.不要太稀，蛋白浓度维持在μg/mL～mg/mL。
3.合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液pH避免与pI相同，防止蛋白质的沉淀。
4.使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA 酶，降解DNA，防止DNA对蛋白的污染。
蛋白质的纯化方法
蛋白质的纯化方法蛋白质是生命体中最基本的组分之一，对于深入理解生命科学方面的各个领域是至关重要的。
然而，蛋白质作为生物大分子，其结构和特性十分复杂，因此需要采用一系列的纯化方法，使其从杂质中得以分离出来。
1. 盐析法盐析法是通过不同浓度的盐水进行分离蛋白质。
盐水的浓度会对蛋白质的稳定性、电荷、溶解度以及亲水性产生影响，使得蛋白质从盐水溶液中析出。
通过盐析法可以分离出不同的蛋白质分子量、电荷等性质相差较大的蛋白质。
这种方法可以用于初步分离，然后再用其他方法进一步纯化。
层析法依据蛋白质和基质之间的亲和力、大小、形状、电荷等差异进行分离。
将蛋白质样品通过某种基质包装的柱子进行逐层析出，蛋白质在不同基质上的亲和力使得其被不同基质吸附，最终通过洗脱等后处理方法，将其分离出来。
3. 水解法水解法是将蛋白质样品加入酸性或碱性等反应性溶液中，使蛋白质分子断裂成更小的肽链。
通过不同的水解方法和处理方法，可将蛋白质分离出来。
4. 电泳法电泳法根据蛋白质的电性和分子大小来进行分离。
通过蛋白质在电场中的电荷和电泳时的分子大小来颗粒分裂，将其分离出来。
电泳法包括等电聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-PAGE电泳、双向电泳等方法，其中比较常用的是SDS-PAGE电泳。
5. 亲和层析法亲和层析法利用蛋白质与特定配体之间的强亲和力来进行分离。
通过在某一配体上固定蛋白质，利用比较特异的亲和性从多种蛋白质中选择性地吸附目标蛋白质，最终将目标蛋白质从基质中析出。
透析法是一种通过滤过和受限扩散等原理，通过基质和蛋白质之间的分子量和性质差异来进行分离。
透析法通常用于去除杂质，如去除蛋白质样品中的盐、淀粉等。
综上所述，蛋白质纯化方法的选择取决于蛋白质的性质，结构和形态等因素。
无论采用哪种方法，都需要在实验前根据目标蛋白质的性质进行调研和试验，谨慎选择，才能得到理想的分离效果。
蛋白纯化方法
蛋白纯化方法蛋白纯化是生物化学领域中非常重要的一环，它是指将混合的蛋白质溶液中的目标蛋白质与其他蛋白质、核酸、多糖等生物大分子分离出来的过程。
蛋白纯化的方法有很多种，每一种方法都有其特定的应用场景和适用对象。
在本文中，我们将介绍几种常见的蛋白纯化方法，希望能对您有所帮助。
一、离心法。
离心法是一种常用的蛋白纯化方法，其原理是利用不同蛋白质在离心过程中受到的离心力不同而实现分离。
通过逐步增加离心力，可以将混合蛋白质溶液中的不同蛋白质分离出来。
离心法适用于分子量差异较大的蛋白质，但其操作过程较为繁琐，需要较长的离心时间。
二、凝胶过滤法。
凝胶过滤法是利用凝胶孔隙大小的差异将不同大小的蛋白质分离的方法。
在凝胶柱中，大分子蛋白质无法进入凝胶孔隙，只能在凝胶表面流动，从而被分离出来。
凝胶过滤法操作简单，适用于分子量较大的蛋白质。
三、离子交换层析法。
离子交换层析法是利用蛋白质表面带电性质的差异将蛋白质分离的方法。
在离子交换柱中，蛋白质会根据其带电性质的不同而被吸附在柱子上，通过改变缓冲液的离子浓度和pH值，实现蛋白质的分离。
离子交换层析法适用于带电性质不同的蛋白质。
四、亲和层析法。
亲和层析法是利用亲和剂与目标蛋白质之间的特异性结合来实现分离的方法。
亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，它们与目标蛋白质具有特异的结合能力，通过在柱子中固定亲和剂，可以将目标蛋白质特异地吸附在柱子上，然后通过改变条件将其洗脱出来。
亲和层析法适用于具有特异结合亲和剂的蛋白质。
五、透析法。
透析法是一种利用半透膜将小分子溶质与大分子溶质分离的方法。
在透析过程中，溶液被置于半透膜袋中，通过半透膜的选择性通透性，可以将小分子溶质从大分子溶质中分离出来。
透析法操作简单，适用于蛋白质与小分子溶质的分离。
总结。
蛋白纯化是生物化学研究中非常重要的一环，不同的蛋白纯化方法适用于不同类型的蛋白质。
在进行蛋白纯化时，需要根据目标蛋白质的特性选择合适的纯化方法，以实现高效、纯度高的蛋白质分离。
蛋白纯化的方式
蛋白纯化的方式篇一：蛋白纯化是一种常用的生物化学实验技术，用于从混合物中分离和纯化特定的蛋白质。
蛋白纯化的方式可以根据蛋白质的特性和所需纯化级别的不同而有所不同。
一种常见的蛋白纯化方式是亲和层析。
亲和层析基于蛋白质与特定配体的非共价结合，通过将待纯化混合物通过含有配体的亲和树脂柱，使目标蛋白与配体结合，再通过洗脱步骤将目标蛋白与配体分离。
这种方法特异性高，但需要配体的制备。
离子交换层析是另一种常用的蛋白纯化方式。
该方法基于蛋白质与离子交换树脂上的带电位点之间的相互作用。
通过调整溶液的pH和离子强度，蛋白质可以被吸附到或洗脱出离子交换树脂上。
这种方法适用于从混合物中分离具有不同电荷的蛋白质。
凝胶过滤是一种按分子大小分离蛋白质的常用方法。
通过将待纯化的混合物通过具有特定孔径大小的凝胶柱，大分子蛋白质会被阻滞在凝胶内，而小分子蛋白质则可以通过凝胶。
这种方法适用于分离分子大小差异较大的蛋白质。
除了以上常见的方式外，还有许多其他的蛋白纯化方法，如透析、凝胶电泳、超速离心等。
通常，为了获得高纯度的蛋白质，研究人员会结合多种纯化方法进行多步骤的纯化过程。
总之，蛋白纯化是一项复杂的工作，需要根据目标蛋白质的性质选择合适的纯化方式。
不同的纯化方法可以相互结合，以获得高纯度的蛋白质样品，为后续的实验和研究提供可靠的基础。
篇二：蛋白纯化是生物学和生物化学研究中重要的一步，它可以从混合的蛋白质溶液中分离出目标蛋白质，并去除其他杂质。
蛋白纯化的方式有多种选择，根据目标蛋白质的特性以及实验需求，可以选择不同的方法或结合多种方法来实现纯化。
一种常用的蛋白纯化方法是亲和层析。
亲和层析是利用某种特定的相互作用，例如蛋白质与配体、抗体与抗原之间的特异性结合，将目标蛋白质从混合物中分离出来。
这种方法通常需要在静态或动态的柱上固定具有特异性结合能力的配体或抗体。
目标蛋白质与柱上的配体或抗体结合，并通过洗脱步骤将杂质洗去，最终通过洗脱蛋白质的条件将目标蛋白质从柱上洗脱出来。
蛋白质纯化的方法
蛋白质纯化的方法
蛋白质纯化的方法有多种，包括但不限于以下几种：
1. 层析法：包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。
2. 电泳法：包括区带电泳、等电点聚焦等。
3. 有机溶剂提取：与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低，因此，控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。
4. 盐析：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。
5. 免疫沉淀法：利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。
6. 透析和超滤法：透析利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开；超滤法应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。
以上方法可以根据实际需要进行选择，必要时可以组合使用。
请注意，不同方法的效果和适用范围可能存在差异。
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。
升浓度为宜。
缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必须在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。
蛋白质纯化方法
蛋白质纯化方法蛋白质作为生物体内重要的功能分子之一，其纯化方法的选择对于生物学研究和工业生产中的蛋白质制备具有至关重要的意义。
纯化蛋白质能够去除与目标蛋白质无关的其他生物分子，从而提高蛋白质的纯度和活性。
在本文中，将介绍几种常用的蛋白质纯化方法。
一、溶液层析溶液层析是一种常用的蛋白质纯化方法。
该方法利用分子大小、电荷和亲水性等差异，将混合物中的蛋白质分离开来。
常见的溶液层析方法包括凝胶层析、离子交换层析和亲和层析等。
1. 凝胶层析凝胶层析是一种基于分子大小的分离方法。
常见的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺薄膜和聚糖凝胶等。
这些凝胶材料具有不同的孔隙结构，通过选择合适孔径的凝胶材料，可以将目标蛋白质与其他分子分离开来。
2. 离子交换层析离子交换层析是一种基于分子电荷的分离方法。
该方法利用纯化材料表面的离子交换基团与蛋白质间的电荷交互作用，将蛋白质分离开来。
阳离子交换材料选择带有阴电荷的材料，而阴离子交换材料选择带有阳电荷的材料。
3. 亲和层析亲和层析是一种基于分子亲和性的分离方法。
该方法利用纯化材料表面的特定化合物与目标蛋白质之间的特异性相互作用，将目标蛋白质与其他分子分离开来。
常见的亲和层析材料有亲和树脂和亲和薄膜等。
二、电泳分离电泳分离是一种基于蛋白质电荷和大小的分离方法。
常见的电泳分离方法包括SDS-PAGE和等电聚焦。
1. SDS-PAGESDS-PAGE是一种基于蛋白质分子大小的分离方法。
该方法利用十二烷基硫酸钠（SDS）将蛋白质分子包裹成带负电的复合物，使其在凝胶电泳时按照分子大小分离开来。
通过引入分子量标记物，可以根据标记物的迁移距离来确定目标蛋白质的分子量。
2. 等电聚焦等电聚焦是一种基于蛋白质电荷的分离方法。
该方法利用胶体颗粒的电动流动使蛋白质在电泳过程中在不同的pH值时停止运动，从而达到分离的目的。
等电聚焦在凝胶上形成pH梯度，蛋白质在梯度中由于电荷变化发生位置变化。
三、高效液相色谱高效液相色谱（HPLC）是一种高效的蛋白质纯化方法。
四种蛋白纯化的有效方法
四种蛋白纯化的有效方法四种蛋白纯化的有效方法在进行蛋白质研究和酶工程等领域的实验过程中，常常需要将目标蛋白从复杂的混合物中纯化出来。
蛋白纯化的目的是获取高纯度的目标蛋白样品，以便进一步进行结构和功能研究。
然而，由于蛋白质的复杂性以及其在混合物中的低浓度，蛋白纯化常常面临一系列的挑战。
为了克服这些挑战，科学家们开发了多种蛋白纯化的方法。
在本文中，我们将介绍四种常见而高效的蛋白纯化方法，并探讨其原理和适用性。
1. 亲和层析法：亲和层析法是一种利用目标蛋白与配体之间的特异性结合进行纯化的方法。
这种方法基于目标蛋白与配体之间的亲和力，通过设计具有高亲和性的配体来选择性地结合目标蛋白。
在实验中，我们可以将配体固定于固相材料上，例如琼脂糖或石蜡烃树脂，并将载有目标蛋白的混合物与这些固定化的亲和基质进行接触。
随后，非特异性蛋白质被洗脱，而目标蛋白则被保留下来。
目标蛋白可以通过改变条件（例如改变pH值或添加竞争性配体）来洗脱。
亲和层析法的优点在于具有高选择性和高纯度的优势。
然而，由于亲和剂的设计和合成需要具有相关专业知识，并且选择适当的配体是关键。
亲和层析法在不同的纯化过程中的适用性会有所不同。
2. 凝胶过滤层析法（Gel Filtration Chromatography）：凝胶过滤层析法是通过分子量的差异将混合物中的蛋白质分离的一种方法。
凝胶过滤层析法是利用凝胶材料，例如琼脂糖或琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶，通过分子在凝胶孔隙中的渗透性而将蛋白分离开来。
较大的蛋白分子无法进入凝胶孔隙，因此会在凝胶的表面留下。
较小的蛋白分子则能够渗透进入凝胶孔隙中，因此会相对于较大的蛋白分子更早地溢出。
凝胶过滤层析法的优点在于操作简单、速度快，且可以对蛋白进行某种程度的分离。
然而，该方法的分离效果受到蛋白质在凝胶中的体积效应的限制，因此对于体积较大的蛋白分子，凝胶过滤层析可能无法实现理想的分离效果。
3. 离子交换层析法：离子交换层析法是一种基于蛋白与离子交换材料之间的电荷相互作用进行纯化的方法。
请举四种蛋白质类制品分离纯化方法,并说明一下其原理
请举四种蛋白质类制品分离纯化方法,并说明一下其原理
以下是四种蛋白质类制品分离纯化方法及其原理的举例:
1. 盐析法：盐析法是利用蛋白质在不同盐浓度下溶解度的差异进行分离纯化。
具体来说，在蛋白质溶液中添加适量中性盐，使得蛋白质的溶解度降低并析出，从而达到分离纯化的目的。
这种方法的原理是蛋白质与盐离子形成复合物，且复合物的溶解度较低，因此在盐浓度较高时，蛋白质会沉淀出来。
2. 等电点沉淀法：等电点沉淀法是利用蛋白质在不同 pH 值下的等电点进行分离纯化。
具体来说，将蛋白质溶液调节至其等电点 pH 值，使得蛋白质失去电荷，形成稳定的沉淀，从而达到分离纯化的目的。
这种方法的原理是蛋白质在不同 pH 值下带电荷的数量不同，因此在等电点时，蛋白质会沉淀出来。
3. 低温有机溶剂沉淀法：低温有机溶剂沉淀法是利用蛋白质在低温下溶解度的差异进行分离纯化。
具体来说，将蛋白质溶液引入与水可混溶的有机溶剂中，使得蛋白质的溶解度降低并析出，从而达到分离纯化的目的。
这种方法的原理是蛋白质在水中的溶解度受温度和溶剂性质的影响，而在有机溶剂中，蛋白质的溶解度较低，因此可以分离纯化。
4. 亲和色谱法：亲和色谱法是利用蛋白质与配体之间的特异性结合进行分离纯化。
具体来说，利用具有特异性结合能力的载体，将待分离的蛋白质与载体结合，然后通过改变洗脱液 pH 值或离子强度等方法，将结合在载体上的蛋白质洗脱出来。
这种方法的原理是蛋白
质与配体之间的相互作用可以影响蛋白质的溶解度、电离性质等，从而进行分离纯化。
蛋白质的纯化方法
蛋白质的纯化方法
蛋白质是生命体中的重要组成部分，具有多种生物学功能，因此蛋白质的纯化对于研究其生物学功能以及制备生物制品具有重要意义。
目前常用的蛋白质纯化方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、逆向相色谱层析等。
离子交换层析是根据蛋白质与离子交换树脂之间的电荷相互作
用分离蛋白质的一种方法。
其原理是利用不同离子交换树脂与蛋白质之间的电荷差异，将蛋白质通过树脂的吸附和洗脱来实现纯化。
凝胶过滤层析是一种分子筛分离的方法，其原理是利用不同孔径的凝胶筛选蛋白质。
较大分子的蛋白质无法通过较小孔径的凝胶，而较小分子的溶液则能够通过较小孔径的凝胶，从而实现纯化。
亲和层析是通过蛋白质与配体之间的特异性相互作用实现纯化
的方法。
亲和层析分为正向亲和和反向亲和两种。
正向亲和层析是利用蛋白质与其特定配体之间的结合选择性，将目标蛋白质从复杂混合物中分离出来。
反向亲和层析则是利用特定配体与目标蛋白质之间的结合选择性，将非目标蛋白质从复杂混合物中分离出来。
逆向相色谱层析是通过蛋白质与逆向相色谱树脂之间的亲水性
相互作用分离蛋白质的方法。
逆向相色谱层析的原理是利用蛋白质与逆向相色谱树脂的亲水性差异，将目标蛋白质从复杂混合物中分离出来。
以上是常用的蛋白质纯化方法，不同的方法适用于不同的蛋白质特性和实验需求。
蛋白质纯化工艺
蛋白质纯化工艺
蛋白质纯化是各种生物分子的重要技术，主要用于研究分子的结构，功能，互作等。
蛋白质纯化的过程主要包括以下几个步骤：
一、获得材料:
研究需要蛋白质的纯化，可以从细胞培养或动物身上提取出所需的蛋白质，同时也可以从其他属于同一物种的蛋白质中获得纯化蛋白质。
二、酶消解:
酶消解是将蛋白质破坏成多种小分子，从而使蛋白质的结构变化，减少其在某一步骤中的阻碍。
一般可以使用酶来实现蛋白质的消解，由于消解过程中会减少蛋白质的稳定性，因此需要在消解时注意控制温度以及酶的浓度，以避免蛋白质发生不可逆变化。
三、离心纯化:
将消解后的蛋白质通过离心操作进行纯化，根据蛋白质的不同，可以选择不同的离心方法，例如沉淀等方法，以进行细胞蛋白质的纯化，或者采用柱离心的方法，使细胞内的大分子分离出来。
四、提取和再纯化:
离心纯化后，可以采用溶剂提取的方法，对离心纯化的蛋白质进行纯化，同时也可以进行二次纯化，以提高蛋白质的纯度。
五、测定活性:
对纯化的蛋白质进行活性测定，可以检查蛋白质的活性是否达到所需要求，以此来评估蛋白质纯化的效果。
蛋白质纯化是一个复杂的过程，需要仔细设计，以保障蛋白质的纯度，确保实验的效果。
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第二部分：蛋白的纯化如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀，表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中，还有可能是二者中都有分布。
根据我们实验室的经验，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本上是可溶的。
但如果超声完之后，菌液是浑浊的，而且当离心之后，离下的沉淀比较多，而且沉淀的颜色也比较白，那基本上就是包涵体了。
包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成的无活性的蛋白质聚集体，难溶于氺，可溶于变性剂如尿素，盐酸胍等，其实，包涵体也就是我们常说的不可溶蛋白。
对于后者，可将上清和沉淀分别跑一个PAGE,看看上清中的量能达到多少，对于某些蛋白来说，一部分是以包涵体形式表达，一部分是以可溶的形式表达，而且量也不少，可以满足后续实验的需要，这个时候最好是纯可溶的，因为包涵体即使最后复性，活性也不太可信。
对于沉淀跑SDS-PAGE，如何处理，用什么使其溶解，还有在大肠杆菌中表达的蛋白，在提取过程中，使用什么蛋白提取缓冲液。
沉淀用Buffer B重悬，（组成：8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4，用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀（湿重）加5ml Buffer B,使其充分溶解（可以放在微量震荡器上震荡20min），然后室温下12000转离心20min，留上清，弃沉淀。
取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液，就可以跑PAGE了。
无论是纯可溶蛋白还是包涵体，在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer（组成：10mM 咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体（湿重）加2-5ml Lysis Buffer，充分悬起后，加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。
包涵体，简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的，主要的是疏水作用。
实际上就是很多个蛋白分子，这些蛋白并不是交联在一起的，用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性，解聚。
电泳检测的话，可以用SDS-PAGE检测，在上样之前，需要用上样缓冲液处理样品，处理后，包涵体也就解聚了，每个蛋白分子与SDS结合，形成了可溶物。
包涵体是不容易破碎的，超声可以破碎菌体释放里面的包涵体，但是不能破碎包涵体；但如果用水煮的话，包涵体会变性，会有一部分可溶于水，所以你跑的上清中有可能有包涵体存在，也有可能没有包涵体；建议：还是先将菌体超声破碎，然后离心，取沉淀和上清再跑一次电泳，如果沉淀上清中都有你要的蛋白，说明表达的结果是部分可溶；如果仅上清有就是可溶性表达；如果仅沉淀中有，就是完全包涵体了。
不过，一般情况下，应该是第一者的可能性大。
包涵体的纯化（一）对于表达在包涵体内的蛋白，可以通过降低诱导温度（可以试试4度诱导过夜）和IPTG的量，降低蛋白的表达速度，从而减少包涵体形成的速度，增加正确折叠蛋白的量等来使目的蛋白不表达在包涵体内达到可溶性表达。
但一般用pET28作为表达质粒且蛋白表达量较大时易形成包涵体。
包涵体：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
包涵体的组成与特性：一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF 和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶于水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。
包涵体表达的有利因素：1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。
2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。
3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。
4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。
菌体破碎一般采用：a 超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂。
此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施（超声时置于冰上），超声功率、超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮(5-10分钟)。
b反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
c化学处理法: 细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理.必要时可将三种方法结合起来使用以使菌体充分破碎在这我们以100 ml菌液为例：（此纯化方法可于室温中进行）诱导表达1 挑取含有重组质粒的菌落，接种于5 ml加有相应抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。
2 以1％的接种量转接到100 ml加有相应抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6－1.0，先取出300 μl诱导前的菌液，作为对照。
再向锥形瓶中加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养3－4 h。
3 取300μl经诱导后的菌液于EP管中，连同诱导前的菌液一起12,000 rpm离心1min后，将上清置于一个新的Eppendorf管中，细胞沉淀用等同于上清体积的ddH2O悬浮，分别制样。
（以80μl样品为例，需加20μl 4×loading buffer，8μl 1M的DTT，52μl上清或沉淀悬浮液）Ni2+亲和柱的制备1 颠倒混匀固化的Ni2+树脂，取1ml装入层析柱。
树脂自然沉降。
2 用3倍柱体积无菌水冲洗树脂。
3 用6倍柱体积1X Binding Buffer（包含6 M 尿素）洗柱，放置待用（4℃）。
包涵体纯化（参照Novagen的纯化protocol）1 以10,000 × g 离心10 min收菌后去上清。
重悬菌体于40 ml 1X Binding Buffer 。
2 超声破碎细胞至菌液应该变清亮。
3 以5,000 × g 离心15 min收集包涵体和细胞碎片。
4 去上清后重悬于20 ml 1X Binding Buffer。
5 超声破碎至悬液应该变清亮。
（在第五步之前可加溶菌酶处理或反复冻融几次以促使菌体破碎。
）6. 以5,000 × g 离心15 min后将沉淀重悬于5 ml 1X Binding Buffer（包含6 M 尿素）并加蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为1mmol/L 。
7 放置冰上1 h 以完全溶解蛋白后以16,000 × g离心30 min去除不溶物质。
并将上清在用Ni2+亲和柱纯化之前用0.45-μm 的滤膜过滤。
纯化带组氨酸的重组蛋白1 将过滤后的样品上柱，使流速降低以使样品与Ni2+树脂充分结合。
2 再用十倍体积的1X Binding Buffer（包含6 M 尿素）过柱。
3 用1X Wash Buffer（包含6 M 尿素）洗柱。
至流过液A280<0.01且基本保持水平。
(大约1~2h）4 用1X Elute Buffer（包含6 M 尿素）结合的蛋白,并开始收集样品(1ml/管)，直至A280又恢复至基准线。
收集的蛋白SDS-PAGE检测蛋白纯度。
纯化蛋白的透析和冻干1 透析袋预处理：用10mmol/L NaHCO3，1mmolEDTA煮沸透析袋30min；再用ddH2O煮10min。
2 将蛋白溶液移入透析袋。
3 将其放入10倍体积以上的含3 M 尿素的去离子水中，用磁力搅拌器搅拌，于4℃透析。
透析液中的尿素浓度以3 M—1.5 M—0.75M—0M 递减。
4 透析完成后将蛋白质溶液离心取上清，每500µl分到一个1.5mlEP管中，于真空冻干机（MAXI Dry Lyo）中冻干。
冻干的蛋白溶于PBS，SDS-PAGE检测蛋白纯度和降解程度。
5 用完的透析袋用去离子水洗净并煮沸10min，于20%乙醇中保存。
Ni2+亲和柱的后处理和重生1 纯化完毕后，Ni2+柱用去离子水过柱1～2h，再用20%乙醇过柱1～2h。
2 为保证亲和柱的活性，可进行再生先用下列试剂依次冲洗层析柱：2倍体积的6mol/L盐酸胍，0.2mol/L乙酸；5倍体积水；2倍体积2%SDS；1倍体积25%、50%、75%乙醇；5倍体积乙醇；1倍体积75%、50%、25%乙醇；1倍体积水；5倍体积100mmol/L EDTA；1倍体积水。
再用小于2倍体积的0.1mol/L NiSO4溶液再生，用水洗，最后用平衡缓冲液平衡。
8X Binding Buffer (8X = 4 M NaCl, 160 mM Tris-HCl, 40 mM imidazole, pH 7.9)8X Wash Buffer (8X = 4 M NaCl, 160 mM imidazole, 160 mM Tris-HCl, pH 7.9)4X Elute Buffer (4X = 4 M imidazole, 1 M NaCl, 80 mM Tris-HCl, pH 7.9)加入尿素的溶液需现配现用。
此外1X Wash Buffer中的咪唑浓度为20~60 mM，在实验中可依不同情况加以调节。
包涵体复性问题注意：在有的复性过程中有蛋白沉淀析出，有建议表示：甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用（透析液中加入了1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶效果）。
低分子化合物脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用；EDTA可以防止蛋白降解对于包涵体复性，一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。
此外复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/m。
复性原则1 低浓度（可稀释后再进行透析）2 平缓梯度（尿素浓度和pH:最适pH值范围为8.0-9.0之间）3 低温(温度适宜选择4℃)包涵体纯化（二）----（2010-7-31更新）当蛋白大量表达在包涵体且不易用NI2+柱纯化下来的时候，可以用以下的方法进行包涵体的洗涤纯化。