放射免疫分析技术
放射免疫检测技术
一、放射免疫检测技术的基本原理
1、7个基本概念 ⑸比活度：是单位质量标记物的放射强度，
单位为Bq/g。
标记抗原的比放射性越高，所需标记 抗原量越少，实验系统的敏感度越高。
但过高的比放射性可能会损伤抗原的 免疫活性。如碘标记化合物以单碘标记为 宜。
一、放射免疫检测技术的基本原理
1、7个基本概念 ⑹放射化学纯度：是指结合于抗原上的放
射强度占总放射强度的百分率。
影响因素: ①被标记物不纯，杂质也被放射性核素标
记； ②标记后的分离纯化不完全； ③标记化合物贮存过程中的碘脱落。一、放射免疫检测技术来自基本原理1、7个基本概念
⑺免疫活性：指标记抗原结合于抗体的 放射强度占总放射强度的百分率。 以检查标记后免疫活性损失情况。
一、放射免疫检测技术的基本原理
• 4．样品误差。样品的收集方法、贮存温度、放置条件， 微量样品取样的准确度，样品可能造成的污染以及样品的 变性（如免疫反应活性的降低、蛋白质的变性等）也都能 造成测量的误差。
• 5．提取及层析分离过程中的丢失。
六、核废物的处理
• 放射性废物中的放射性物质，采用一般 的物理、化学及生物学的方法都不能将 其消灭或破坏，只有通过放射性核素的 自身衰变才能使放射性衰减到一定的水 平。而许多放射性元素的半衰期十分长 ，并且衰变的产物又是新的放射性元素 ，所以放射性废物与其它废物相比在处 理和处置上有许多不同之处。
原量成反相关；IRMA为非竞争结合，反应参数与待 检抗原成正相关。 ④特异性 IRMA 特异性较RIA高。 ⑤灵敏度和检测范围 IRMA测定的灵敏度明显高于RIA ， IRMA标准曲线工作范围较RIA宽1~2个数量级。 ⑥其他 RIA 所用抗体为多克隆抗体，对亲和力和特异性 要求较高，但用量很少；IRMA 为试剂过量的反应， 对抗体亲和力的要求不及 RIA，但用量大。此外， RIA 可以测量半抗原，但IRMA只能测定至少有两个 以上表位的抗原。
放射免疫分析测定方法-临床免疫
放射免疫分析测定方法-临床免疫放射免疫分析测定方法：用放射免疫分析进行测定时分三个步骤，即抗原抗体的竞争抑制反应、B和F的分离及放射性的测量。
（一）抗原抗体反应将抗原（标准品和受检标本）、标记抗原和抗血清按顺序定量加入小试管中，在一定的温度下进行反应一定时间，使竞争抑制反应达到平衡。
不同质量的抗体和不同含量的抗原对温育的温度和时间有不同的要求。
如受检标本抗原含量较高，抗血清的亲和常数较大，可选择较高的温度（15～37℃）进行较短时间的温育，反之应在低温（4℃）作较长时间的温育，形成的抗原抗体复合物较为牢固。
（二）B、F分离技术在RIA反应中，标记抗原和特异性抗体的含量极微，形成的标记抗原抗体复合物（B）不能自行沉淀，因此需用一种合适的沉淀剂使它彻底沉淀，以完成与游离标记抗原（F）的分离。
另外对小分子量的抗原也可采取吸附法使B与F分离。
1.第二抗体沉淀法这是RIA中最常用的一种沉淀方法。
将产生特异性抗体（第一抗体）的动物（例如兔）的IgG免疫另一种动物（例如羊），制得羊抗兔IgG血清（第二抗体）。
由于在本反应系统中采用第一、第二两种抗体，故称为双抗体法。
在抗原与特异性抗体反应后加入第二抗体，形成由抗原-第一抗体-第二抗体组成的双抗体复合物。
但因第一抗体浓度甚低，其复合物亦极少，无法进行离心分离，为此在分离时加入一定量的与一抗同种动物的血清或IgG，使之与第二抗体形成可见的沉淀物，与上述抗原的双抗体复合物形成共沉淀。
经离心即可使含有结合态抗原（B）的沉淀物沉淀，与上清液中的游离标记抗原（F）分离。
将第二抗体结合在颗粒状的固相载体之上即成为固相第二抗体。
利用固相第二抗体分离B、F，操作简便、快速。
2.聚乙二醇（PEG）沉淀法最近各种RIA反应系统逐渐采用了PEG溶液代替第二抗体作沉淀剂。
PEG沉淀剂的主要优点是制备方便，沉淀完全。
缺点是非常特异性结合率比用第二抗体为高，且温度高于30℃时沉淀物容易复溶。
放射免疫分析
• b. 常用的分离方法
• 1. 双抗体法
– 特点： 分离完全，非特异结 合小，环境影响小， 效价高，但分离时间 长，成本高。
• 2. 沉淀法 聚乙二醇（w=6000）
– 特点： 快速，价廉，来源方便，受环境影响大
• 3. 双抗体PEG法
– 将双抗体和沉淀法两者结合进行分离。
– 本法具有两种方法的优点，并克服了双抗体分离时间 长和沉淀法非特异性结合高的缺点。
• b. 抗血清的制备：
• 1.大分子物质可直接免疫动物诱导抗体产生，但 是小分子物质为半抗原，必须与载体结合制成人 工抗原（半抗原-蛋白质），才能进行免疫。 • 2．选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊。 • 3．应用佐剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊毛 脂、石蜡油 +卡介苗）。 • 4．选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股 沟、腋窝、脊柱两侧皮内多点）、间隔时间（加 强）与次数。
放免分析的优点
• 灵敏度高
• 特异性强
• 精确度高
• 用血量少
• 缺点：污染；放射性核素衰变及不 稳定
第三章 放射免疫分析
放射免疫分析法 免疫放射分析法 临床应用
免疫放射分析法 （immunoradiometric assay， IRMA）
• 1968年，Miles和Hales创立了免疫放射分析法 （IRMA）。 • IRMA与IRA不同，它是将放射性核素标记在抗体 上，而不是标记在抗原上。同时所用的标记抗体 与待测抗原比较是过量的。
• CA50——胰腺癌、肝癌、结、直肠癌、卵 巢癌、子宫癌、胃癌、肺癌、食道癌。 • CA19-9——对胰腺癌和胆囊癌诊断有较高 特异性，阳性率＞80%，绝对值升高明显。 • CA125——非粘液性卵巢癌诊断特异性强。 • CYFRA21-1——肺癌的诊断和疗效观察。
免疫放射分析基本原理
免疫放射分析基本原理
免疫放射分析（Radioimmunoassay，简称RIA）是一种常用的生物化学分析方法，通过使用放射性同位素标记的抗体来测量样品中特定物质的含量。
其基本原理如下：
1. 准备试样：需要测量的物质（抗原）存在于待测样品中。
样品可以是血清、尿液、分离得到的纯化物质等。
2. 标记抗体：选择能与待测物质结合的特异性抗体，并将该抗体与放射性同位素标记结合。
常用的同位素标记有^125I和
^3H。
放射性同位素标记的抗体是利用放射性同位素的射线释放特性来进行测量的关键。
3. 反应体系：将标记抗体和待测样品中的抗原加入到一个反应管中，使抗体与抗原发生特异性结合。
这一步骤通常需要一定的时间（通常为数小时）来达到最大的结合效率。
4. 分离无结合物质：通过加入剩余的非标记抗体或其他方法，分离无结合的标记抗体和未结合的物质（无结合物质）。
这一步骤可用于增加测量的灵敏度。
5. 分离被结合的标记抗体：将反应体系分离，常见的方法是利用沉淀或吸附等技术，将被结合的标记抗体与其他成分分离开来。
6. 测量放射活性：通过放射计或闪烁计数仪等设备，测量分离得到的被结合的标记抗体的放射活性。
放射活性与待测物质的
浓度呈正相关关系。
7. 构建标准曲线：使用已知浓度的标准物质重复上述步骤，测量其放射活性，并作为标准曲线的数据点。
通过与标准曲线的比较，可以确定待测样品中物质的浓度。
总之，免疫放射分析是一种利用放射性同位素标记的抗体来测量待测样品中特定物质含量的分析方法。
通过与已知浓度的标准物质进行比较，可以准确地测量待测物质的浓度。
放射免疫分析实验
结果误差分析
随机误差
由于实验过程中随机因素引起的误差，如操 作不熟练、仪器不稳定等。
系统误差
由于实验过程中某些恒定因素引起的误差， 如试剂不纯、仪器校准等。
生物学变异
由于个体生物学差异引起的误差，如个体差 异、生理状态等。
减少误差的方法
通过标ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ化操作、质量控制、仪器校准等方 式减少误差。
05
实验注意事项与安全防护
废弃物的处理与环保要求
分类处理
减量、减容
将放射性废弃物与其他废弃物分开处理， 避免交叉污染。
尽量减少废弃物的产生和体积，采用适当 的处理方法进行减容。
无害化处理
环保监测
确保废弃物经过无害化处理后，不对环境 和人体健康造成影响。
对废弃物的处理过程和最终排放进行监测 ，确保符合环保要求。
THANKS
抗原与抗体反应
放射免疫分析实验基于抗原与抗 体反应的原理，利用标记的抗体 与抗原结合，形成可被检测的复
合物。
放射性同位素标记
抗体被放射性同位素标记，以便通 过放射性计数器进行检测。
信号放大
通过使用标记的抗体，可以将信号 放大，提高实验的灵敏度和特异性。
实验应用
01
02
03
激素检测
放射免疫分析实验在激素 检测中广泛应用，如甲状 腺激素、肾上腺皮质激素 等。
。
放射性同位素的管理与使用规范
审批与授权
只有经过授权的人员才能进行放射性 同位素的操作和管理。
记录与追踪
对放射性同位素的采购、储存、使用 和废弃等过程进行详细记录，确保可 追溯性。
计量与监测
定期对放射性同位素进行计量和监测， 确保其质量和安全。
第七章-放射免疫分析技术和免疫放射分析技术
• 在RIA中，类似抗原竞争结合抗体，使B值降低， 而IRMA中表现的类似抗原与标记抗体结合，是使 B值升高。
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• 此法是利用标记抗体来测定待测抗原，为了与放射免疫分 析区别，故称免疫放射分析（immunoradiometric assay IRMA）,免疫放射分析的反应系统是非竞争性的全量反应， 故亦称非竞争性免疫分析法。
• 一、基本原理
• 放射性核素标记在抗体上，然后以过量的标记抗体与待测 抗原结合，未结合的标记抗体通过和固相的抗原免疫吸附 剂反应而除去，溶液中放射性与未知抗原浓度呈相关，这 是经典的IRMA法，近年来发展有双位点IRMA以及在双位 点IRMA基础上的标记第三抗体法，双标记抗体法和IRMA －BAS法等更为完善。IRMA法的基本数学模型同样遵循 质量作用定律，其式如下：
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• 4、准确度
• 准确度是指测量值与真值符合的程度。
• RIA和IRMA也都是以准确度为指标，来衡 量分析方法本身的质量。
• 准确度和精密度是两个独立的统计学指标， 因为有的分析尽管精密度很高，但准确度 不一定好，但如准确度很好，则精密度必 定也好。
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• 5、稳定性
• 3、剂量反应曲线
• Yalow以胰岛素为例，与抗体（两个结合1 位点分别为Aba与Abb）相互作用，其反应 曲线图2.2,
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《放射免疫分析》课件
放射免疫分析是一种广泛应用于医学与生物领域的实验技术，结合放射性同 位素和免疫反应，用于检测和定量测量生物样本中的特定分子。
简介
1 什么是“放射免疫分析”
放射免疫分析是一种使用放射性同位素标记的抗体或分子探针进行定量测量的实验技术。
2 有哪些应用场景
放射免疫分析广泛应用于临床诊断、生物学研究和药物开发等领域，特别是在肿瘤标志 物检测、激素水平测量和免疫检测方面。
3 放射免疫分析的过程
放射免疫分析包括样本 前处理、标记试剂制备、 样品配制、反应体系建 立和实验操作步骤等多 个步骤。
实验流程
1
样本前处理
对样本进行处理，使其符合放射免疫
标记试剂制备
2
分析的要求，例如去除干扰物质、浓 缩或稀释样品。
将放射性同位素与特定抗体或分子标
记在一起，以便在免疫反应中检测和
发展趋势
未来，放射免疫分析可能朝 着更高灵敏度、更低辐射和 更简化实验操作的方向发展， 也有望应用于新领域，如点of-care测试和分子影像学。
结论
结合实验结果，总结放 射免疫分析的特点和应 用，并对未来发展进行 展望。
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定量目标分子。
3
样品配制
将待测样品与标记试剂进行适当的混
合与反应，使目标分子与标记试剂发
反应体系建立
4
生特异性的结合。
为免疫反应提供适宜的环境，调整pH
值、温度和离子浓度等参数，以促进
免疫反应的进行。
5
实验操作步骤
按照合适的实验步骤和时间要求，进 行免疫反应、洗涤、分离等操作，以 获得准确的测量结果。
放射免疫分析
二、 (一)标讥抗原和抗体用量最佳化设计。 1、标记抗原用量选择。 2、抗血清的使用滴度选择及其方法。 (二) 1、 2、标准曲线工作范围 (三) (四)
15
(五) 1 、反应容积 缩小反应容积可相应减少 抗体和标记抗原的绝对用量，使非标记 抗原的竞争力相应增强，有利抗原、抗体结合反 应的平衡结合常数K与温度有关必须通过 实验来确定最佳工作条件。 (六)B与F (七)
7
(四)掌握标准曲线的斜率对测定的影响 标 准曲线的斜率对放射免疫分析方法的灵 敏度和精密度均有影响。
1、亲和常数K 2、 3、 ( 五 ) 掌握 Bo( 总结合 ) 、 T( 总管 ) 、 NSB 的概
8
第二节 放射免疫分析方法学 一、掌握建立放射免疫分析方法的必备条件 (一) (1)标准抗朱与待测抗原的免疫性必须一致， 即它们与抗体的亲和力和特异性应相同。 标准抗原与待测抗原所处的介质条件应基 本相同。 (2)抗原必须纯度度。 (3)标准抗原的量必须准确。 (4)标准抗原应有很好的稳定性。
13
2、 (1) 双抗法 (Ab2 法 ) ：应用抗 IgG 的第二抗体 来分离B和F的方法称为双抗体法。 双抗体法具有特异、高效、非特异性结合 低、重复性好等优点。在使用此法时，往 往加入适量的第一抗体同种动物血清作载 体。同时第二抗体必须是过量(但也不宜过 大)，且以不影响反应平衡为宜. (2) 固相分离法：将特性抗体 ( 第一或第二 抗体)或抗原结合在固相物质。 (3)金黄色葡萄球菌A蛋白分离法。
第四章
放射免疫分析
目的与要求： 掌握放射免疫分析的基本原理， 实验室配置及质量控制。 内容： 放射免疫分析 (RIA) 是由 Yalow 和Berson于 1960年创建的一种体 外放射分析技术。这是检验专业 学生必须掌握和重点。
放射免疫分析临床应用刘冬
放射免疫分析临床应用刘冬放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）是一种以放射性示踪剂和免疫反应结合技术来测定生物标志物的一种方法。
该技术已广泛应用于临床医学中用于检测和测量患者体内的一些特定物质含量，如激素、抗体、肿瘤标志物等。
本文将重点介绍放射免疫分析在临床应用中的一些例子。
一、激素测定激素是机体内起调控作用的重要化学物质。
通过测定患者体内激素的水平，可以评估一些疾病的发生和发展，以及患者对治疗的反应。
常见的激素测定项目包括甲状腺激素、生长激素、性激素等。
放射免疫分析可以通过测定血液或尿液中激素的浓度，来帮助医生进行确诊和治疗方案的制定。
例如，对于甲状腺功能亢进患者，可以通过测定血液中的甲状腺素水平来确定是否需要进行手术或药物治疗。
二、肿瘤标志物测定肿瘤标志物是一种可以在肿瘤患者体内检测到的特殊物质。
通过测定血液中的肿瘤标志物的水平，可以帮助医生进行肿瘤的筛查、诊断和监测治疗效果。
放射免疫分析可以对常见的肿瘤标志物，如癌胚抗原（CEA）、前列腺特异性抗原（PSA）等进行快速、准确的检测。
例如，在临床上，对于可能患有肺癌的患者，测定血液中的CEA水平可以帮助医生进行早期诊断和有效治疗。
三、感染性疾病诊断感染性疾病的早期诊断对于患者的治疗和康复至关重要。
通过测定患者体液中的抗体水平，可以判断患者是否被特定的病原体感染。
放射免疫分析可以用来检测和诊断一些常见的感染性疾病，如乙肝、艾滋病等。
例如，对于可能患有乙型肝炎的患者，可以通过测定血液中的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）和乙肝病毒表面抗体（HBsAb）来判断患者的感染状态和治疗效果。
综上所述，放射免疫分析技术在医学临床应用中发挥着重要的作用。
通过对患者体内特定物质含量的测定，可以帮助医生进行疾病的早期诊断、有效治疗和预后评估。
随着医学技术的不断发展，放射免疫分析技术在临床应用中的前景将会更加广阔。
放射免疫分析名词解释
放射免疫分析名词解释放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）是一种用于检测和定量分析生物样品中特定抗原或抗体浓度的方法。
它是将放射性同位素标记于抗原或抗体上，在放射性同位素发出的放射线与样品中的抗原或抗体发生特异性结合后进行测定，从而得出相应物质的浓度。
放射免疫分析的基本原理是免疫反应，即抗原与抗体之间的特异性结合。
在RIA中，通常选择具有放射性的同位素标记物作为追踪试剂。
标记物可以是同位素标记的抗原或抗体，其中最常用的是放射性同位素碘-125（^125I）或碘-131（^131I）。
这些放射性同位素会发出特定能量的射线，可以通过辐射探测器测量。
RIA的步骤包括样品预处理、标记物制备、抗体反应和分离、洗涤、放射测定等。
首先，需要将待测物标记为放射性同位素，常见的方法是用碘-125标记。
然后，将标记物与样品中的抗原或抗体进行相互反应，形成抗原-抗体复合物。
接着，通过分离和洗涤步骤，去除未结合的放射性同位素。
最后，使用辐射探测器测量放射性同位素发出的射线，由此可以得到样品中特定抗原或抗体的浓度。
放射免疫分析的优势在于其高灵敏度和高特异性，可以检测到极低浓度的物质。
它广泛应用于医学、生物学、生物化学等领域，用于检测和量化各种生物分子，如荷尔蒙、抗体、蛋白质、癌标志物等。
RIA还可以用于研究免疫反应、疾病诊断、药物筛选和治疗监测等方面。
然而，放射免疫分析也存在一些问题。
首先，使用放射性同位素会造成辐射危害，对实验操作人员和环境有一定风险。
其次，放射性同位素的半衰期较短，需要定期更换，增加了实验的复杂性和成本。
此外，由于放射性同位素的使用受到严格的监管和限制，一些实验室可能无法获得所需的放射性同位素。
总体而言，放射免疫分析是一种广泛应用的生物分析技术，具有高灵敏度和高特异性。
随着科技的进步，更多无放射同位素的免疫分析方法被开发出来，如酶免疫分析、荧光免疫分析等，逐渐取代了放射免疫分析的应用。
放射免疫分析
202043;
+
+
+
+
+
Ag
Ab
+
Bound
Free
标准曲线
• 标准曲线又称为剂量反应曲线， 以一系列递增浓度的Ag及一定 量的Ag*与恒定量限量的Ab竞 争结合反应而得，是对待测物进 行定量分析的基础。
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标准曲线实例
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标准曲线:
① 配制一系列已知浓度的标准抗原，分别向其中加入固定 量的标记抗原和抗体，反应平衡后，分离抗原的结合部分和 游离部分，测定*Ag-Ab的放射性B。 ②B0为标准抗原浓度=0时的放射性值。
3
第三章 放射免疫分析
放射免疫分析法 免疫放射分析法 临床应用
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放射免疫分析法 （Radioimmunoassay，RIA）
• 1959年，Yalow和Berson创立了放射 免疫分析法（RIA），并因此于1977 年获得诺贝尔生物医学奖。
• 这种方法结合了放射性核素测量的 高灵敏性和免疫抗原-抗体反应的高 特异性两大特点，开创了生物活性 物质微量测定技术的先河。
• 3．滴度 （效价）高：指将血清稀释时能与抗原
发生反应的最高稀释度。它反映抗血清中有效抗 体的浓度。稀释倍数越高，滴度(titer)越高，表 示抗体的效价越高。
• 4．稳定性好：能长期保存，化学性质、效价稳
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• b. 抗血清的制备：
• 1.大分子物质可直接免疫动物诱导抗体产生，但 是小分子物质为半抗原，必须与载体结合制成人 工抗原（半抗原-蛋白质），才能进行免疫。
放射免疫分析
加样： 1、Ag（系列标准品及待测样品）50ul/每管 2、Ag* 200ul/每管 3、Ab 100ul/每管 混匀，37℃ 45分钟，加分离剂离心，测定 结合部分放射性。
放射免疫分析的几种标准曲线图：
抗原抗体的结合反应遵循质量作用定律， 即：
当反应达到平衡时， k1[Ag][Ab]=k2[AgAb]。设KA为平衡结 合常数，也称亲和常数，则有：
Ag + Ab → AgAb + Ag* ↓ Ag*Ab
式中Ag *代表标记抗原，Ag代表非标 记抗原，Ab代表特异性抗体，Ag * Ab代 表标记抗原抗体复合物，AgAb代表非标 记抗原抗体复合物。
当反应体系中同时存在Ag、Ag *和Ab， 而Ag *的量一定、Ab的量限定（分子数少于抗 原）时，随着Ag的增加，Ag * Ab的量相应减 少，即与Ag（包括标准抗原或待测抗原）的 量呈负相关竞争性抑制。当反应达到平衡后， 将反应体系中的标记抗原抗体复合物与游离的 标记抗原分离，测定其放射性。以标准抗原的 浓度为横坐标，以标记抗原抗体复合物的结合 率（B/T、B/F、B/B0）为纵坐标，绘制剂量 效应曲线（calibration curve），也称标准曲 线。
3）亲和力和亲和常数测定：亲和力表 示特定的抗原、抗体之间的结合能力， 常用亲和常数KA来表示。KA越大，表 示抗原、抗体之间结合能力越强，B/F 值大，方法的灵敏度高。 随着单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）技术的发展，提高 了现代体外分析技术的特异性和亲和力。
（二）、放射性标记物 放射性标记物是体外放射分析的测 量依据，常用的标记核素有125I和3H。 对标记物的质量要求包括： （1）比活度（specific activity）：体外 放射分析法的定量范围一般在10-9-1012mol水平，标记物的用量应等于或小于 被测物的最小量，以得到较好的灵敏度。 高比活度的标记物是确保分析方法灵敏 度的前提。
放射免疫分析名词解释
放射免疫分析名词解释
放射免疫分析（RIA）是一种检测技术，可以用来测定多种体内物质，包括激素、细胞因子、蛋白质和抗原。
它可以应用于动物和人体，并且具有灵敏度高、可操作性好的优点，被广泛应用于临床和科研领域。
放射免疫分析由以下几个步骤构成：首先，将样本中待测物质结合到放射抗体中。
放射抗体是一种特异性抗体，能够特异性结合待测物质，避免其他物质干扰检测结果。
放射抗体可以是膜抗原抗体、非膜抗原抗体或者多肽抗体。
其次，将样本和放射抗体制成滴定曲线，测定放射抗体结合待测物质的含量。
最后，通过计算放射抗体浓度滴定曲线的相关系数来计算样本中的待测物质的含量。
放射免疫分析为临床和科研提供了许多方便，特别是在生理学方面，其应用极为广泛。
它可以用来检测各种激素、蛋白质和细胞因子的表达水平，对疾病的研究有重要意义。
放射免疫分析也可以检测各种抗原，为临床诊断疾病提供有力的支持。
放射免疫分析由于具有高灵敏度和特异性，可以很好地检测微量物质，在临床和科研领域具有重要的应用价值。
近年来，放射免疫分析在药物研发和食品质量检测方面也越来越受到重视，为科学研究和技术创新提供重要的技术支持。
综上所述，放射免疫分析是一种重要的检测技术，它不仅在临床检测中具有重要的应用价值，而且也受到越来越多科学研究和技术创新的重视。
它也可以帮助我们更准确、更早期地诊断疾病，为患者身
体健康提供有力的支撑。
放射免疫分析
放射免疫分析放射免疫分析放射免疫分析是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性和抗原抗体反应特异性相结合的一种免疫技术。
放射免疫技术放射免疫分析免疫放射分析放射免疫分析技术的应用放射免疫技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大的推动作用。
基本类型及原理1.放射免疫分析（RIA）2.免疫放射分析（IRMA）常用的放射性核素放射免疫技术常用的放射性核素有125Ⅰ、131Ⅰ、3H、14C等。
使用最广泛的是125Ⅰ，可采用探测γ射线的晶体闪烁计数器测量。
标志物制备及鉴定125Ⅰ以放射性碘原子通过置换被标志物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。
（1）氯胺T（ch-T）法。
（2）乳过氧化物酶标记法。
（3）间接标记法。
放射性标志物的纯化（1）凝胶过滤法：分子筛。
（2）离子交换层析法：极性差异。
（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）：电荷和直径。
（4）高效液相色谱法。
放射性标志物的鉴定1.放射化学纯度：大于95%。
2.免疫活性：标志物与抗体结合的能力。
3.比放射性：标志物中所含的放射性强度。
方法学评价除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以下指标：（1）可靠性。
（2）剂量-反应曲线。
（3）高剂量钩状效应。
放射免疫分析放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是以放射性核素标记的抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合有限的特异性抗体为基本原理来测定待检样品中抗原量的一种分析法。
Ag*+Ag+Ab Ag*-Ab+Ag-Ab+Ag*+Ag分离结合与游离标志物1.第二抗体沉淀法。
2.聚乙二醇（PEG）沉淀法。
3.PR试剂法：先将二抗与PEG按一定比例混合成悬液后进行试验。
4.活性炭吸附法。
放射性测量及数据处理可对标记抗原抗体复合物（B）或游离标记抗原（F）进行放射性测量，绘制标准曲线，查出相应的待检抗原浓度。
第七章 放射免疫分析
第七章放射免疫分析第一节放射免疫技术一、基本类型及原理（一）放射免疫分析（RIA）以放射性核素标记抗原与未标记抗原竞争结合特异性抗体，测定样品中抗原量的一种分析法。
（二）免疫放射分析（IRMA）用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析法。
二、常用的放射性核素125I、131I、3H、14C等，使用最广泛的是125I。
三、放射性标记物制备及鉴定（一）原理：以放射性碘原子置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。
蛋白质、肽类等含有上述基团，可用125Ⅰ直接标记，不含上述基团的甾体激素或药物分子，须连接相应基团才能用于放射性碘标记。
（二）标记及类型1.直接标记法：肽类、蛋白质和酶的碘化标记。
常用的方法为：①氯胺 T（ch-T）法；②乳过氧化物酶标记法。
2.间接标记法：也称连接标记法，是最常用的间接碘标记方法。
该法主用于甾体类化合物、环核苷酸、前列腺素等缺乏碘标记基团的小分子化合物的标记。
（三）放射标记物的纯化1.凝胶过滤法：分子筛机制。
2.离子交换层析法：游离125Ⅰ与标记物分子极性差异进行吸附解离。
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）：按分子所带电荷和直径不同在电场作用下分子迁移速率不同。
4.高效液相色谱法。
（四）放射标记的鉴定1.放射化学纯度：单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率，要求＞95%。
该参数还是观察在贮存期内标记物脱碘程度的重要指标。
2.免疫活性：制备的标记物与抗体结合的能力。
3.比放射活性：单位化学量标记物中所含的放射性强度，即每分子被标记物平均所结合放射性原子数目。
四、方法学评价除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以下指标：（一）可靠性：又称健全性，是评价被测物与标准品的免疫活性是否相同。
借助标准曲线与样品稀释曲线的平行性分析来判断。
平行性好者可靠。
（二）剂量-反应曲线：通过已知浓度的标准品和相应的反应参数绘制成剂量-反应曲线，待测物定量是通过计算其反应参数在剂量-反应曲线上对应的标准品浓度值而确定。
《放射免疫分析》课件
03
在标记反应过程中进行实时监测，确保反应顺利进行
。
分离与测量
分离方法选择
01
根据实验需求选择合适的分离方法，如离心、过滤、层析等。
测量设备校准
02
确保测量设备准确无误，并进行必要的校准和验证。
测量过程控制
03
在测量过程中进行质量控制，确保测量结果的准确性和可靠性
。
结果分析
数据处理
对实验数据进行整理、统计和分析，提取有用的信息 。
应用领域的拓展
临床诊断
扩大在肿瘤、心血管、神经退行性疾病等 领域的诊断应用，提高疾病早期发现和治
疗效果评估的准确性。
生物医药研究
应用于新药研发、药物代谢、蛋白质组学 等领域，为生物医药研究提供有力支持。
环境监测与食品安全
拓展在环境污染物、农药残留、食品添加 剂等方面的检测应用，保障环境和食品安
全。
亲和层析
利用抗原抗体之间的特异性结合进 行分离。
04
测量方法
液体闪烁计数器
用于测量放射性核素发出的射线。
γ射线计数器
用于测量放射性核素发出的γ射线。
液体闪烁能谱仪
用于测量放射性核素发出的射线能谱。
γ射线能谱仪
用于测量放射性核素发出的γ射线能谱。
03
放射免疫分析的实验操作 流程
实验前的准备
实验器材和试剂准备
抗原-抗体反应
01
02
03
特异性
抗原与抗体之间的特异性 结合，决定了反应的特异 性。
亲和力
抗原与抗体之间的亲和力 决定了结合的牢固程度。
反应动力学
反应速度和平衡状态对实 验结果的影响。
分离技术
01
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放射免疫分析技术摘要RIA 是一种微量分析法, 就是利用放射性核素标记抗原或抗体, 然后与被测的抗体或抗原结合, 形成抗原抗体复合物的原理来进行分析的。
它兼有放射性同位素的灵敏性和抗原、抗体反应的特异性两大特点。
该法还具有准确性高和精密度好, 便于标准化以及操作简便、经济等优点。
由于RIA具有灵敏度高，特异性强，测量简单，成本低等优点，RIA在应用方面具有一定的生命力。
但是，又因为它最致命的弱点就是使用放射性核素，此外标记物有效使用时间短，难以实现操作和测量的自动化等，它的进一步发展受到一些局限。
现在免疫分析技术都在朝着非同位素标记免疫分析的方向发展，自动化仪器已经投入到临床常规项目的检测中，使得传统的RIA使用市场逐渐缩小。
不过第五代RIA技术的出现，使得现在的RIA 技术较其他方法在方法学有了更多的优势，尤其是纳米磁性固相的应用，为RIA自动化的研制提供了很大帮助。
此外，在生命科学的实验领域，非放射标记免疫技术始终不能代替RIA。
关键字RIA IRIA 基本原理第五代RIA技术1959 年，美国科学家Berson 和Yalow 将放射性同位素测量的高灵敏度与抗原抗体的高特异性巧妙地结合起来，创立了放射免疫分析( radioimmuoassay，RIA) 技术。
RIA 经过半个多世纪的发展，可以分析成百上千种物质，包括激素、维生素、肿瘤相关抗原、抗体、药物、病毒等。
使那些曾认为无法检测的微量而又具有重要生物活性的物质得以精确定量，为医学、生命科学的发展做出划时代的贡献。
因此，1977 年Yalow荣获诺贝尔生理学或医学奖。
随后，各国学者发展了酶免疫分析( EIA) 、荧光( FIA) 、时间分辨荧光( TRFIA) 和化学发光( CLIA) 等非同位素标记免疫分析技术。
1. RIA基本原理放射免疫分析法的本质是一种分子相同的被侧物质和同位素标记物质, 同另一种浓度有限的特异性结合试剂进行的竞争性结合。
当同位素标记化合物和特异性结合试剂的量保持一定时, 加入的被侧物或标准物的量与标记物的量之和多于特异性结合试剂有效结合的数目时, 被测物或标准物与标记物一特异性结合试剂复合物之间就呈现一种函数关系。
即被测物的量越多, 则标记物的被稀释程度也就越大, 使标记物一特异性结合试剂复合物的量逐渐减少, 放射性强度侧定就越低。
根据这种原理来对生物体内的微量物质进行定量测定。
以标记化合物为P* . , 非标记化合物为P , 特异性结合试剂为Q, 其反应式构成了放射免疫分析法的理论基础( 图1 )。
为了进一步阐明放射免疫分析法的原理, 我们再用图2名加以说明。
图2 为我们提供简单的量的概念,图名中黑圆点代表标记抗原, 空白圆点代表非标记抗原, 双凹型符号代表抗体, A、B、C、D 分别代表四种不同浓度的非标记抗原。
基于标记抗原和非标记抗原的理化性质相同, 与抗体具有相同的结合力, 所以随着非标记抗原含量的增加, 标记抗原和抗体相结合的能力所受到的竞争抑制就越大, 因而B /F或B / B + F的比值相应愈小, 呈相反的关系。
图2放射免疫分析原理示意图因为标记抗原对抗体的结合被未标记抗原的竞争结合所抑制, 于是产生一条抑制曲线( 图3 )。
它反映了标记伉原的结合度、或游离度、或结合度与游离度之比和未标记抗原的函数关系, 这种关系可以有规律的表现在放射免疫测定的剂量反应曲线上。
这条曲线就是对样品进行定量的基础。
简单来说，放射免疫分析的原理: 就是利用放射性核素标记抗原或抗体, 然后与被测的抗体或抗原结合, 形成抗原抗体复合物的原理来进行分析的。
它又分为两种方法。
1.1竞争性RIA, 又称传统RIA主要特点: 标记的是抗原。
其原理: 未知抗原Ag+，标记抗原Ag* +，已知定量抗体Ab，标记抗原与抗体复合物Ag *Ab+，未知抗原与抗体复合物Ag Ab+，游离标记抗原Ag* ( 去除) ( 未知抗原多, 标记抗原与定量抗体结合的复合物就少, 表现为负相关) 。
临床上甲胎蛋白( AFP) , 癌胚抗原( CEA) , β2- 微球蛋白( β2-MG ) , 铁蛋白( Fer ) , 人绒毛膜促性腺激素β亚单位( H CG-β) 等的检测都是竞争性RIA 法原理。
竞争性RIA 法,根据加样顺序与温育次数的区别, 反应方式分三种:平衡法,将非标记抗原( 被测物与标准品) 、抗体、标记抗原依次加入反应管, 混匀后一次性温育至反应达到动态平衡, 再加分离剂分离B( 复合物) 与F( 游离物) 如: AFP, β2-MG, Fer;顺序加样法, 先将非标记抗原( 被测物与标准品) , 与抗体在反应管内作第一次温育, 待反应达到动态平衡后。
加入标记抗原, 再作第二次温育后, 分离B 与F 如: CEA;急诊检测法: 为临床急需检测结果而提出的反应方式, 不等RIA 反应达到动态平衡就终止反应; 分离剂的选择有, PEG( 聚乙二醇) , 第二抗体等。
现在一般采用的是: 第二抗体与PEG 合用的方法, 称为双抗体- PEG 法。
PEG 原理: PEG 浓度达到7%- 9%时能使抗原- 抗体复合物沉淀。
优点: 经济, 简便, 通用。
缺点: 重复性差, 非特异性结合率高。
第二抗体: 第一抗体是可与被测抗原进行特异结合的抗体, 来自家兔或豚鼠。
用第一抗体为抗原, 作用到羊, 马身上,产生的抗第一抗体的抗体称第二抗体。
第二抗体与第一抗体在适当条件下发生特异性结合, 生成分子量很大的免疫复合物( AgAb1 × Ab2 ) , 能自然沉淀。
优点: 分离效果好，非特异性结合率低。
缺点: 增加经费投入，需要第二次温育, 延长了时间。
所以就产生了两者合用的双抗体- PEG 法, 它结合了上述两种方法的优点。
1.2非竞争性RIA, 又称免疫放射分析( IRMA)1968年Miles和Hales建立了利用核素标记的抗体检测抗原的放射分析法，为了与放射免疫分析区别，故称免疫放射分析技术(immunoradiometric assay，IRMA)。
主要特点: 标记的是抗体。
按反应原理分为两种: 单位点IRMA, 其原理: 抗原只有一个抗原决定簇, 所测的抗原为小分子抗原, * Ab+ AgAg* Ab + * Ab+ ImAd-Ag ImAd-Ag*Ab+ Ag* Ab ( 去除) ( 负相关) : ( ImAd-Ag) 固相抗原免疫吸附剂, 一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗原; 双位点IRMA: 抗原有两个抗原决定簇, 所使用的两种亚型抗体在与同一抗原分子结合时互不干扰ImAd-Ab+ Ag ImAd-Ab-Ag+ * AbImAd-Ab-Ag- * Ab+ * Ab( 过剩的, 游离的) : ( ImAd-Ab) 固相抗体免疫吸附剂, 一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗体双位点IRM A,又称双抗体夹心法, 从加样测定顺序上看, 有三种方法: 固相抗体先与未知抗原结合, 再与标记抗体结合( 正向两步法) 。
然后去除游离的标记抗体, 测固相抗体- 抗原- 标记抗体复合物的放射性计数; 未知抗原先与标记抗体结合, 再与固相抗体结合( 反向两步法) 。
然后去除游离的标记抗体, 测固相抗体-抗原- 标记抗体复合物的放射性计数; 未知抗原与固相抗体和标记抗体同时反应( 一步法, 又称同时加样法) 。
然后去除游离的标记抗体, 测固相抗体- 抗原- 标记抗体复合物的放射性计数。
这三种方法都生成夹心状的抗体- 抗原- 抗体复合物, 故又称双抗体夹心法。
糖类抗原CA50 , CA125 就用的是其中的第三种方法( 一步法) , 血清中的未知抗原与固相抗体和标记抗体同时反应, 生成夹心状的抗体- 抗原- 抗体复合物, 然后去除游离的标记抗体, 测固相抗体- 抗原- 标记抗体复合物的放射性计数。
2.放射免疫技术发展虽然RIA具有灵敏度高，特异性强，测量简单，成本低等优点，但是它最致命的弱点就是使用放射性核素，此外标记物有效使用时间短，难以实现操作和测量的自动化等，它的进一步发展受到一些局限。
早在1983年，Witherpoon就在《免疫分析--将来核医学的地位会存在吗》就谈到了关于放射免疫技术的未来的发展方向，很有可能是被其他先进的自动化技术所取代。
事实证明，现在免疫分析技术都在朝着非同位素标记免疫分析的方向发展，自动化仪器已经投入到临床常规项目的检测中，使得传统的RIA使用市场逐渐缩小。
但是，RIA和其它放射示踪技术仍处在不断更新换代发展阶段。
特别是第五代RIA技术的出现，使得现在的RIA技术较其他方法在方法学有了更多的优势，尤其是纳米磁性固相的应用，为RIA自动化的研制提供了很大帮助。
此外，在生命科学的实验领域，非放射标记免疫技术始终不能代替RIA。
据李振甲等人的总结，RIA技术从开创至今，按照技术的进步大可划分为五代。
第一代(1959～1964年)RIA技术及竞争结合蛋白分析法(CPBA)开创。
第二代(1965～1970年)众多学者对RIA技术进行了大量实验研究，将RIA和CPBA技术推进到了临床实用水平。
1968年建立了利用核素标记的抗体检测抗原的放射分析法(IRMA)。
第三代(1971～1980年)RIA技术广泛的用于小分子化合物的检测。
第四代(1981～1995年)小鼠抗绵羊红细胞的单克隆抗体(McAb)的出现为RIA提供了新型特异性抗体，使得放射免疫技术灵敏度、特异性提高。
第五代RIA技术,是目前正在研发并使用的，它是以磁性微粒子与RIA或IRMA相结合为特点的。
磁性微粒子直径小、表面连有活性基团等特性，使其在包被均一性、反应活性等方面都要优于经典的分析方法。
3放射免疫技术的最新进展第五代RIA技术出现后，相应的出现了许多不同的的方法。
3.1 双标记液相IRMA技术它是五代RIA技术中最具推广意义的。
主要特征是将两株高特异性单克隆抗体(McAb)分别标记125I和异硫氰酸荧光素(FITC)共同作为标记试剂，待测样品在液相中生成双标记夹心免疫复合物，以抗FITC磁性微粒子固相作为分离剂。
实验结果表明：(1)双标记液相IRMA比普通的IRMA节省了时间。
(2)对于中小化合物，双标记液相IRMA法的灵敏度明显高于酶免疫法和化学发光法。
(3)检测量程宽，特异性强，适宜大量样本检测。
3.2 磁性微粒子二抗分离法和磁性微粒子固相一抗法其原理都是以磁性微粒子代替了原来的PR分离剂，免疫反应和分离时间都有不同程度的缩短。
两种方法分析结果存在一定的系统误差，由于两种方法本身的差异以及检测时不可避免的环境因素影响，但此误差并不影响实际样品的检测及临床诊断。
4.放射免疫技术的应用4.1 激素类检测：(1)在垂体性腺激素：卵泡刺激素(FSH)，黄体生成激素(LH)，睾丸酮(T)，雌二醇(E2)，孕酮(P)，催乳素(PRL)，人生长激素(HGH)，人绒毛膜促性腺激素(HCG)，人胎盘催乳素(HPL)等。