乳鼠肾细胞原代培养传代培养
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法1. 引言嘿，大家好！今天咱们聊聊动物细胞的培养，听起来可能有点高大上，但其实就像种花一样，只是“花”是细胞，养护的方法也有讲究。
说白了，细胞也有自己的“家”，咱们得给它们创造个舒适的环境，让它们在里面嗨起来！接下来，我就带你走进这个充满神奇和乐趣的细胞世界。
2. 原代培养2.1 什么是原代培养？原代培养，简单来说，就是从活体动物身上直接提取细胞，然后把它们放在培养皿里，就像把新鲜的花插进水里一样。
你知道吗，这些细胞就像刚从大自然里来的小家伙，特别活泼，适应能力强。
不过，这可不是随便就能搞定的，得有点技术活。
2.2 原代培养的方法首先，咱得准备好一切工具，这可是基础中的基础，不能马虎。
咱们要用到无菌技术，确保培养环境干净得像新洗的碗，不然细胞们就会遭殃。
提取细胞时，通常会用胰酶把它们从组织中“松开”，就像剥开一个大榴莲，里边的果肉才好吃嘛。
然后，把这些细胞放到培养基里。
培养基就像细胞的“快餐”，里面有细胞需要的各种营养物质和生长因子。
要记得，细胞也要“吃好”，才能长得壮壮的，不然就不成气候了。
培养的环境也不能小看，温度、pH值、二氧化碳浓度都得保持稳定。
咱们得把细胞放在适合的温度下，就像给它们开个温暖的“家庭聚会”。
如果环境不合适，细胞就会抗议，甚至罢工！3. 传代培养3.1 什么是传代培养？说到传代培养，那就是把原代培养中的细胞继续繁殖，让它们“生儿育女”。
这就像一个大家庭，越来越壮大，热闹得不得了。
传代培养可以让我们获得更多细胞，方便后续的实验和研究。
3.2 传代培养的方法传代培养的关键在于及时分离细胞，咱不能让细胞们挤在一起，这样容易“打架”。
通常，当细胞长满培养皿后，就需要把它们分离开。
这个过程又得用到胰酶，跟原代培养一样，轻轻松松把它们从皿里“请”出来。
接下来，咱们需要把细胞分到新的培养皿里，再给它们加上新鲜的培养基，确保它们能继续健康成长。
注意，细胞们需要一点时间适应新环境，就像搬家后要习惯新居的味道一样。
动物细胞的原代及传代培养
动物细胞的原代及传代培养一、试验目的1、了解动物细胞原代培养的原理及基本方法，掌握组织块法及消化培养法的操作过程，掌握无菌操作的技术要领；2、了解传代培养方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长情况。
二、实验原理动物细胞的原代培养是指把直接从动物获得的细胞、组织或器官在体外培养直至第一次传代为止。
要求在严格无菌的条件下对动物进行切割成组织块或经消化液使组织细胞游离为单个细胞，然后在人工配制的营养液内使其不断地生长和繁殖。
传代培养是指将细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移、接种到另一培养瓶的培养过程。
三、实验材料和试剂鸡胚，HeLa细胞实验器材：无菌工作台，细胞培养箱，离心机，无菌解剖器材，培养皿，培养瓶，滴管等。
实验试剂：平衡盐液，细胞消化液，培养液四、实验步骤（一）动物细胞的原代培养1、取材①将鸡蛋用酒精消毒，用剪刀敲破鸡蛋的圆端，剥壳去膜，倒掉壳内的液体；②拉出鸡胚，剪去头后置于装有Hank液的培养皿内，用Hank液清洗；③然后用镊子小心拔掉鸡胚的毛，将拔完毛的鸡胚。
2、组织块培养法①剪取背部及大腿部的皮肤肌肉组织十余块于培养皿中，用剪刀剪成1mm3大小的组织块；②用弯头吸管吸取组织块送入培养瓶底部，均匀排列；③翻转培养瓶后吸取3管培养液，滴入到培养瓶内（注意：吸管不能碰到瓶口）；④标记在培养瓶写上“原代”，写上姓名和学号。
3、消化培养法①剪取十余块组织块放入干净的培养皿中，吸取3-5管消化液，放入37℃的培养箱中消化10-20min，到组织变成松散、粘稠状，然后加入1管营养液（停止消化）；②取一只干净的细管将组织块打散，放置一段时间，用吸管吸取上清液于离心管中，离心10min；③倒掉上清液，用营养液悬浮沉淀，转入干净的培养瓶中，加入适量的培养液，37℃的培养箱中培养；④标记在培养瓶写上“消化”，写上姓名和学号。
（二）动物细胞的传代培养①取已长成单层HeLa细胞的培养瓶，倒掉培养液，加入3管消化液，37℃条件下消化2-5min，在显微镜下观察细胞单层出现缝隙，倒去消化液，停止消化；②加入3-4管培养液，用弯头吸管反复吹打壁上的细胞层（尽量不形成气泡），添加2-4管培养液；③用吸管吸取一半左右细胞悬液，分装到另一个培养瓶中；④作标记，注明细胞代号、日期和操作者姓名；⑤37℃静置培养，24小时后即可观察。
BHK-21传代细胞培养
BHK-21传代细胞培养BHK是仓鼠肾细胞[原理]细胞在培养瓶壁上长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
[材料和试剂]1、细胞：贴壁BHK-21细胞株2、试剂：0.25％胰蛋白酶、配制好的DMEM培养液、小牛血清、双抗溶液、7.5%碳酸氢钠3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、胶塞、量筒、注射器、针头、酒精灯、污物缸等[操作步骤]1、应需要计算好培养液的总用量，按10%的比例加入血清，按1%的比例加入双抗。
用7.5%的碳酸氢钠调PH至7.0~7.2左右。
2、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
3、加入0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中为宜。
4、瓶口塞好胶塞，平放在实验台上。
约2~3分钟会看到贴壁细胞层出现细针孔空隙，赶紧将胰酶弃去，加入少量培养液终止消化。
5、用注射器将贴壁的细胞反复吹打，使其均匀分散成悬液，再加入足量的培养液，分成两到三瓶。
塞好胶塞，置37℃温箱中继续培养。
细胞培养常用溶液的配制一、青、链霉素溶液青霉素钠盐(80万IU／瓶) 5瓶链霉素(100万IU／瓶) 4瓶将两者溶于400ml0.9％的无菌生理盐水，分装小瓶，-20℃保存。
双抗在培养基中的终浓度为100IU/ml为宜。
二、7.5%碳酸氢钠溶液的配制称取碳酸氢钠7.5g，加入超纯水使总体积为100ml。
高压灭菌，分装于小瓶中，4℃贮存。
三、1%酚红溶液的配制首先配制1mol/L的NaOH溶液。
称取NaOH4.0g，加入100ml超纯水，使NaOH 完全溶解，在室温或4℃贮存（最好现用现配）。
配制好NaOH溶液后，再称取1.0 g 酚红置研钵中，加1mol/L的NaOH（不多于7.0ml），研磨使酚红完全溶解，加超纯水至100ml，高压消毒，在室温或4℃贮存。
四、0.25%胰蛋白酶溶液的配制氯化钠8.0g氯化钾0.2g柠檬酸钠(Na3C6H5O7•5H2O) 1.12g磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O) 0.056g碳酸氢钠 1.0g葡萄糖 1.0g胰蛋白酶（1：250） 2.5g超纯水加至1000ml放4℃冰箱过夜，待胰蛋白酶充分溶解后，用0.2um微孔滤膜过滤除菌，分装于小瓶中，-20℃保存。
动物细胞原代培养过程
动物细胞原代培养一、剪取组织颈椎脱臼法处死小鼠，放在100ml的烧杯中用70％乙醇消毒3min。
用剪刀剪开腹部，取出肾、肝、脾（任意一种脏器）。
1、将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1‰ 新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。
2、将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔二、清洗在盛有PBS 液平皿中洗涤数次，剔除包膜、结缔组织，将剔除后脏器放入另一盛有PBS 平皿中。
三、剪切将肾、肝、脾剪成1mm3 （剪成肉末状）大小的组织块，再次清洗，洗去残留的血细胞，以备消化。
四、消化1、在50ml离心筒中加入0. 25％胰蛋白酶溶液25ml，在温暖的环境中或置于37 °水浴摇床中轻轻摇动15min，转速约为180r/min。
2、让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶。
（小牛血清在共用无菌操作台上取用）3、在离心管中残留未消化组织块中再次加入胰蛋白酶进行消化，重复步骤1和2。
五、制备单细胞悬液1、将混合的细胞悬液离心，1200rpm，5min，弃上清。
2、将沉淀用新鲜的无菌PBS重悬，再1000-1200rpm，5min离心。
3、用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止,然后再按照（1）进行离心，离心后弃去上清液，将沉淀用少量细胞培养液反复吹打。
制的细胞悬液。
六、接种1、将细胞悬液接种到细胞培养瓶中。
2、用滤器过滤RPMI1640再悬沉淀，并使终体积为20ml。
（RPMI-1640RPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维.帕克纪念研究所。
RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。
其中含有10%胎牛血清。
）七、培养1、在培养瓶外做好标记（标明所培养细胞的名称和时间），2、置于CO2的孵箱中培养，3、72h后即可观察。
乳鼠传代培养实验报告
一、实验目的1. 掌握乳鼠细胞传代培养的基本方法；2. 观察乳鼠细胞在体外培养过程中的形态变化；3. 熟悉乳鼠细胞传代培养的注意事项。
二、实验原理乳鼠细胞传代培养是指在体外条件下，将培养的细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶的过程。
通过传代培养，可以扩大细胞数量，保持细胞的遗传稳定性，并研究细胞在不同条件下的生物学特性。
三、实验材料1. 乳鼠细胞；2. 75%乙醇；3. PBS（磷酸盐缓冲盐溶液）；4. 0.25%胰蛋白酶；5. 细胞培养基（DMEM/F12，含10%胎牛血清）；6. 细胞培养瓶；7. 移液器；8. 离心机；9. 显微镜。
四、实验方法1. 准备工作（1）将细胞培养瓶用75%乙醇消毒，然后用无菌PBS冲洗；（2）取适量乳鼠细胞，加入适量细胞培养基，调整细胞浓度为1×10^6个/mL；（3）将细胞培养瓶放入二氧化碳培养箱中，37℃、5%CO2培养。
2. 传代培养（1）取出一瓶培养好的乳鼠细胞，用移液器将细胞悬液转移至另一个培养瓶中；（2）加入适量细胞培养基，调整细胞浓度为1×10^6个/mL；（3）将细胞培养瓶放入二氧化碳培养箱中，37℃、5%CO2培养。
3. 观察细胞形态（1）取出一瓶培养好的乳鼠细胞，用移液器将细胞悬液转移至另一个培养瓶中；（2）加入适量细胞培养基，调整细胞浓度为1×10^6个/mL；（3）将细胞培养瓶放入二氧化碳培养箱中，37℃、5%CO2培养；（4）每隔一定时间观察细胞形态变化，记录实验结果。
五、实验结果1. 乳鼠细胞在体外培养过程中，细胞形态逐渐从圆形变为扁平状，细胞密度逐渐增加；2. 在传代培养过程中，细胞形态保持一致，细胞密度逐渐增加；3. 观察细胞形态变化，未发现细胞异常。
六、实验讨论1. 乳鼠细胞在体外培养过程中，细胞形态逐渐发生变化，可能与细胞生长、代谢等因素有关；2. 传代培养过程中，细胞形态保持一致，说明乳鼠细胞具有较强的遗传稳定性；3. 在实验过程中，应注意无菌操作，避免细胞污染。
动物细胞传代培养的步骤
动物细胞传代培养的步骤动物细胞传代培养，这事儿听起来好像很高大上，其实也没那么复杂。
咱们先聊聊，啥是传代培养呢？就是把细胞从一块地方转移到另一块地方，继续让它们生长，简直就像搬家，给它们换个新环境。
准备工作得做好。
这就像你出门前，得先检查钱包、钥匙、手机啥的。
细胞培养液、培养瓶、离心机、培养箱，缺一不可，得齐齐整整的，准备就绪。
然后，咱们得拿到这些细胞。
细胞可不是随便抓来的，它们需要从动物体内提取。
别担心，科学家们有一套方法，取样的过程就像是给小动物们做个健康检查。
提取完毕，把细胞放在培养液里，这时候，细胞们就开始在这个温暖的环境中茁壮成长了，简直像鱼得水。
细胞们就像孩子们，吃得好，长得快，咱们得定期去看看它们的“成长记录”。
到了细胞长得比较多的时候，咱们就得进行传代了。
这就像孩子们上学，得时不时换个班级，跟不同的小伙伴玩。
先把培养瓶里的细胞用离心机转一转，分离出细胞和培养液。
这里有个小细节，离心的时候别太用力，不然细胞就跟打了个旋儿，容易受伤。
分离完毕后，咱们得把细胞用消毒的方式处理一下，确保它们在新环境中能安全无忧。
把细胞重新放进新培养瓶里，加上新鲜的培养液。
这时候，细胞们就像到了新学校，得适应新的环境。
记得在培养箱里调好温度和二氧化碳浓度，给细胞们一个舒适的生活条件。
你想啊，细胞也有它们的小脾气，环境好，才能开心地成长。
每隔一段时间，咱们得去检查一下它们，看看它们的“心情”如何，有没有异常的情况。
细胞传代并不是一件简单的事情，偶尔也会遇到一些小麻烦。
细胞长得太快，空间不够用，就得考虑再传代一次。
这时候可别心急，要有耐心。
细胞就像小朋友，有时候也需要多一点时间去适应。
遇到不健康的细胞，咱们也得果断处理，像是给小朋友的坏习惯做个干脆的了断。
每次传代都是个新的开始，细胞们在新环境中继续生长繁殖，越来越壮大，真是让人感到欣慰。
随着时间的推移，细胞们就像一片森林，生机勃勃。
科研人员也会从中提取到许多有用的信息，就像从孩子们的成长中获取经验教训。
免疫磁珠法分离纯化乳鼠肾血管周细胞
免疫磁珠法分离纯化乳鼠肾血管周细胞王丽;马跃荣【期刊名称】《现代医药卫生》【年(卷),期】2016(032)016【摘要】目的：通过建立肾原代细胞培养，探讨免疫磁珠分离纯化乳鼠肾血管周细胞的方法。
方法选取健康BALB/c乳鼠肾脏，剪碎、消化和过滤制成细胞悬液，原代培养并传代（传3代）。
免疫磁珠法分离出神经胶质细胞2型硫酸软骨素糖蛋白（NG-2）；倒置相差显微镜观察细胞形态特点，免疫细胞化学检测NG-2、平滑肌肌动蛋白（SMA）和CD31表达，BrdU法检测细胞增殖活性，鉴定是否符合周细胞特征及纯化后的细胞是否具有增殖活性。
结果纯化后获取的细胞宽大扁平，形态呈梭形、三角形或多边形并有突起。
细胞核椭圆居中，多为单核，偶为双核，细胞质丰富，无接触性抑制生长，符合周细胞形态及生长特征。
NG-2和SMA免疫细胞化学染色阳性表达，CD31免疫细胞化学染色阴性表达，符合周细胞特点。
分离纯化后的细胞48、72 h细胞增殖率分别为（0.37±0.11）%、（0.42±0.10）%。
结论免疫磁珠法可使周细胞从细胞成分复杂的肾组织中分离出来，并具有生物活性，可继续体外培养，为后续研究提供参考依据。
%Objective To establish the primary culture by renal cells and to investigate the isolation and purification method of sucking mice renal vessel pericytes by the imunomagnetic bead technique. Methods The kidney of healthy BALB/c sucking mice was selected,cut into pieces,digested and filtered for preparing the cellular suspension. The primary culture and passage(3 generations)were performed;the mimunomagnetic bead techniqueisolated neurogliocytes(NG-2);the inverted phase contrast microscope was adopted to observe the cellular morphological characteristics ,the immunohistochemistry was used to detect NG-2,SMA and CD31 expression by joint judgement,the cellular proliferation activity was detected by using the BrdU method. Whether meeting pericytes characteristics and whether purified cells having the proliferation activity were identified. Results The cells obtained by purification were wide and flat,the morphologies were fusiform, triangle or polygon with prominence. The cellular nucleus was ellipse and in the middle,the majority were mononucleus,occasionally bi-neucleus,with plentiful cytoplas-ma,without contacting inhibition growth,which conformed to the pericytes morphology and growth characteristics. NG-2 and SMA were positively expressed by immunocytochemical staining,CD31 was negatively expressed,which conformed to the pericytes characteristics. The 48,72 h proliferation activities of isolated and purified cells were (0.37±0.11)%and (0.42±0.10)%respec-tively. Conclusion The imunomagnetic bead method can make the pericytes to be isolated from the kidney with complex cellular compositions,which have biological activity,can continuously culture in vitro and provide the reference basis for subsequent study.【总页数】3页(P2453-2455)【作者】王丽;马跃荣【作者单位】成都中医药大学附属医院病理科，四川成都610036;成都中医药大学附属医院病理科，四川成都610036【正文语种】中文【相关文献】1.免疫磁珠法原代分离培养大鼠视网膜微血管周细胞 [J], 王应利;郭斌;惠延年;张晓光;陈立军;马吉献2.免疫磁珠法分离纯化人肾癌CD133+细胞实验研究 [J], 吴恭瑾;卢建忠;杨宁强;杨发英;岳中瑾3.免疫磁珠法在分离纯化外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群中的应用 [J], 莫雪安;周礼圆;秦超;张德敏;赵伟金4.免疫磁珠法分离纯化胚胎大鼠脊髓源运动神经元的方法探讨 [J], 王菲; 王春芳; 李鹏飞; 蔚洪恩; 韩树峰; 李承罡5.免疫磁珠法分离纯化胚胎大鼠脊髓源运动神经元的方法探讨 [J], 王菲; 王春芳; 李鹏飞; 蔚洪恩; 韩树峰; 李承罡因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠肾脏原代细胞的分离和计数
一小鼠肾脏原代细胞的分离及细胞计数(一)原理细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。
由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。
原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。
一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
(二)操作1．取材用颈椎脱位法使小鼠迅速死亡。
然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
用消过毒的剪刀剪开用乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肾脏。
置于无菌平皿中。
2．切割用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1 mm左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。
移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
3．消化吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1 ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化30分钟，每隔5分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清。
4．制备单细胞悬液向含有经消化的肾组织的离心管中加入2-3 ml PBS，用吸管吸打数次，直到看不到块状组织。
5．细胞计数1 盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2 将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
3 统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数目。
4 计算原细胞悬液的细胞数（按照下面公式计算细胞密度）：（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
小鼠胚胎细胞的原代与传代培养及观察
小鼠胚胎细胞的原代与传代培养及观察南京师范大学生命科学学院09070150 唐嘉艺摘要：细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可以分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。
由于细胞刚从活体组织中分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后的传代培养创造条件。
传代培养是组织培养常规保种方法之一。
当细胞在培养在培养瓶中长满之后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。
这一过程就叫传代。
传代培养可获得大量细胞供实验所需。
传代培养要在严格的无菌条件下进行。
本次实验主要是为了培养能独立进行细胞的原代和传代培养的能力，熟练掌握进行细胞原代与传代培养的条件、实验材料、方法等。
关键词：小鼠胚胎原代培养传代培养无菌前言：在体外培养中，有三个培养层次，即细胞培养、组织培养和器官培养。
细胞培养是指从体内取出组织，经消化酶消化成单细胞或细胞群，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下使细胞生存和生长并维持其结构和功能的方法。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外生长，必须满足一下的基本要求：一、供给细胞存活所必需的营养条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气等。
二、要有适合各种细胞生长的适宜温度，并注意细胞生长环境的酸碱度与渗透压的调节。
三、细胞培养必需严格控制在无菌条件下。
细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
培养细胞所用器材及试剂：1、设备（1）超净工作台（2）滤器（3）C O2培养箱（4）电热干燥箱2、器械及器皿：培养瓶、培养皿、滴管、镊子、手术剪3、培养液：目前常用的基础培养基均已商品化，如RPM1640，MEM，M—199等，可根据培养需求合理选择。
血清：一般常用为小牛血清，人血清和其它动物血清。
平衡盐溶液：主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。
一种提取乳鼠肾原代细胞的方法[发明专利]
![一种提取乳鼠肾原代细胞的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/9c5b94c57375a417876f8f50.png)
专利名称：一种提取乳鼠肾原代细胞的方法专利类型：发明专利
发明人：刘立峰
申请号：CN202110212323.7
申请日：20210225
公开号：CN112725262A
公开日：
20210430
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种提取乳鼠肾原代细胞的方法，其包括如下步骤：(1)处理乳鼠获得乳鼠肾脏；(2)将肾脏剪成数块后再次用PBS溶液洗涤一次，吸除PBS溶液并将肾脏剪碎，先加入含胰酶的第一消化液，消化处理8‑12min,然后再加入含胶原酶的第二消化液，消化处理15‑20min,然后过滤得悬液；(3)将悬液进行离心处理，加入红细胞裂解液处理后终止消化，然后加入细胞完全培养基进行重悬，贴壁去除巨噬细胞；(4)细胞培养，长到需要的程度，即得。
优点为，依次使用低浓度的含胰酶的第一消化液和适宜浓度的含胶原酶的第二消化液对乳鼠的肾脏剪碎组织进行消化处理，综合二者优点，处理效率高且保证对细胞的损伤小，可获得纯度较高且活性较好的乳鼠肾原代细胞。
申请人：武汉博尔夫生物科技有限公司
地址：430000 湖北省武汉市武昌区民主路428号2栋4楼423号
国籍：CN
代理机构：武汉谦源知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：王力
更多信息请下载全文后查看。
乳鼠肾细胞的原代培养
消化结果
组织块法
将组织小块（约1mm³）均匀摆放在培养瓶壁上， 平均间隔0.5cm
翻转培养瓶，加入1mL 含血清DMEM细胞培养液 瓶口部稍向上倾斜，置于二氧化碳培养箱中
以酒精喷拭后置于超净台中。 试剂放回冰箱冷藏室中。 实验结束，将酒精灯中的酒精填至三分之二处。
加入0.5mL含血清DMEM培养基终止消化，反复“吹打”分 散细胞
去除大块组织后，1 000rpm离心10min；弃上清 加入PBS溶液重复洗涤、离心一次 加入1mL含血清DMEM细胞培养液重悬细胞；取少量细胞悬
液（20uL） ，以PBS溶液稀释后进行计数 将细胞悬液按比例稀释后，分装至10mL培养瓶中（每瓶1.5
（37℃、5% CO2 ） 2hr后，将培养瓶轻轻翻转，继续培养 72hr后可以观察到生长晕，继续培养3 ～ 5日，更
换部分或全部培养液
待生长晕相连后，去掉组织块，继续培养3 ～ 4日， 即可进行传代培养
生长晕
பைடு நூலகம்细胞的传代
吸弃原培养基，以PBS溶液洗细胞1 ～ 2次； 加入200uL消化液，37 ℃消化3 min； 加500uL含10％血清的DMEM培养基终止消化； 1 000rpm，离心5min； 加入1mL含血清DMEM细胞培养液重悬细胞； 按比例分盘， 37ºC、5％CO2培养； 观察记录细胞生长状况。
原代培养
细胞体外生存过程
原代培养期 传代期 衰退期
细胞分离技术
离心分离法 机械分离法 化学分散法 细胞表面抗原（电泳、流式细胞仪）等
培养细胞的纯化
细胞生物学： 实验三 乳鼠肾细胞原代培养
酚红在培养基中用作PH值的指示剂：中性时为红色， 酸性时为黄色，碱性是为紫色。
培养细胞的观察
衰老期：当细胞长满瓶壁后，如不及时换液和传 代培养，由于液内营养物缺乏和代谢物积累，细 胞进入衰老期。此时细胞胞浆内颗粒很多，细胞 透明度差。严重时细胞从瓶壁脱落。
原代培养细胞的生长曲线
结果记录和分析
实验三 乳鼠肾细胞原代培养
动物细胞的原代培养
细胞原代培养是指直接从有机体获取 组织，用一定的方法（机械分离、酶 消化）将其分散成单个细胞后所进行 的体外无菌培养。
步骤
动物消毒
剪肾
取肾 D-Hank’s液清洗1次 37OC，25min/次
胰酶消化
取上清夜，加入1毫升培养液 （终止胰酶）
2000rpm，10min
记录一周内培养细胞的观察结果 如细胞贴壁情况，细胞的形态，细胞的数量，培养基
的颜色变化等； 完成实验报告； 还可以自己补充实验报告内容； 阅读文献资料。
实验报告
流程图简洁明了，突出关键步骤，用于指导实验进程或 总结实验过程；
数据计算结果还要用文字表述说明，提高书面表达能力； 总结实验中的注意事项，便于今后实验做参考；离心收集细胞用培养基制备细胞悬液4ml
计数,测成活率 分装培养 （每瓶4ml细胞悬液）
培养细胞的观察
游离期：细胞为圆形，折光率高。 吸附期（贴壁）：细胞悬液静置培养数小时后细
胞可贴壁，呈多边形或梭形。 生长期：细胞快速生长和分裂，直至长满瓶壁，
形成细胞单层。细胞透明，颗粒少，细胞界限明 显，可隐约看到细胞核。 维持期：当达到一定密度时，细胞便停止分裂。 此期细胞界限逐渐模糊，胞浆内颗粒增多，培养 液逐渐变酸（变黄）。
细胞的原代与传代培养-PPT
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
原代细胞培养结果:
细胞接种后一般几小时内就能贴壁,并开 始生长
如接种得细胞密度适宜,5天到一周即可 形成单层
细胞原代贴块培养法 贴块培养步骤图解
VSMCs原代培养第4天和第9天(×100)
二、传代细胞培养
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养得一 段期间,与细胞世代或倍增不同。在一代中,细 胞倍增3～6次
(3)消化及分散组织块:将上述清洗过得组织放入无菌 三角烧瓶内,加入5～6倍量得0、1％胰蛋白酶液 (pH7、4 ～ 7、6),置37℃恒温磁力搅拌器上分次 消化:每次消化8-10分钟。在超净台中吸出胰蛋白 酶液于带盖离心管中,加入2滴血清终止消化。直到 组织块基本消化完全。
各管配平后离心,收集细胞,无血清培养液洗2-3 次后,将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一烧杯中。
用酶学解离细胞法解离细胞就是体外培养动 物细胞时分散组织得基本方法,最常用得消化 酶就是胰蛋白酶和胶原酶两种。
动物细胞原代培 养流程得示意图
器材和液体得准备
细胞培养用得玻璃器材 培养瓶、吸管等在清洗干净以后,装在铝盒 和铁筒中,干热或湿热灭菌后备用
手术器材、瓶塞等 15磅,121℃,20分钟蒸气灭菌
原代培养
消化法 贴块法
冷消化 温消化
一次性消化 分次消化
消化法:这种培养过程主要就是采用无菌操作 得方法,把组织(或器官)从动物体内取出,经酶消 化处理,使分散成单个细胞,然后在人工条件下 培养,使其不断地生长和繁殖。
消化法
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ贴块法
原代培养方法分类
93
分次消化
消化法得分类
解离释放细胞得方法
小鼠肾脏原代细胞的分离和计数[整理版]
![小鼠肾脏原代细胞的分离和计数[整理版]](https://img.taocdn.com/s3/m/e3dd7ac0c0c708a1284ac850ad02de80d4d80683.png)
一小鼠肾脏原代细胞的分离及细胞计数(一)原理细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。
由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。
原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。
一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
(二)操作1．取材用颈椎脱位法使小鼠迅速死亡。
然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
用消过毒的剪刀剪开用乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肾脏。
置于无菌平皿中。
2．切割用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1 mm左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。
移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
3．消化吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1 ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化30分钟，每隔5分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清。
4．制备单细胞悬液向含有经消化的肾组织的离心管中加入2-3 ml PBS，用吸管吸打数次，直到看不到块状组织。
5．细胞计数1 盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2 将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
3 统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数目。
4 计算原细胞悬液的细胞数（按照下面公式计算细胞密度）：（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
乳鼠肾细胞的培养个人体会
乳鼠肾细胞的培养个人体会乳鼠肾细胞培养是一种常用的细胞培养技术，用于研究和理解生物学过程以及药物筛选等应用。
通过培养乳鼠肾细胞，可以获取大量的细胞，进行进一步的实验和分析。
在进行乳鼠肾细胞培养时，首先需要选择合适的培养基。
一般常用的培养基是含有营养物质和生长因子的DMEM/F12。
培养基的选择对于细胞的生长和增殖具有重要影响。
接下来，需要将乳鼠肾细胞取出并进行传代。
传代是将细胞从一个培养瓶转移到新的培养瓶中，以保证细胞的生长和增殖。
传代时，需要使用胰蛋白酶等消化酶将细胞与培养瓶表面分离，并进行离心洗涤。
在培养过程中，细胞需要在适当的温度、湿度和气体环境下生长。
一般来说，细胞培养室保持在37℃、5% CO2和95%湿度的条件下。
这样的环境可以提供最适合细胞生长的条件。
细胞的培养还需要定期更换培养基，并观察细胞的形态和数量。
细胞形态的变化可以反映其生长状态和健康程度。
当细胞达到一定的密度时，可以进行细胞的分离和传代，以保持细胞的正常生长。
我个人在进行乳鼠肾细胞培养的过程中，发现了几个关键点和注意事项。
首先，确保细胞的无菌条件是非常重要的。
任何细菌、真菌或病毒的污染都会影响细胞的生长和实验结果。
因此，在培养过程中，我始终保持消毒操作，并注意细胞培养器具的清洁和无菌处理。
其次，培养基的配制和使用要精确。
每种细胞株对培养基的要求可能有所不同，因此要根据具体情况调整培养基的成分。
同时，要注意避免培养基的过度或不足，以免影响细胞的生长和增殖。
此外，培养过程中的细胞密度和传代的次数也需要控制。
细胞密度过高或传代频繁可能会导致细胞的老化和凋亡。
因此，要根据具体需要和细胞的生长状态灵活调整细胞密度和传代的时间。
最后，细胞培养的成功还需要耐心和细心的观察和记录。
通过不断观察细胞的形态和数量的变化，可以及时发现细胞的异常和问题，并采取相应的措施进行调整和修复。
总的来说，乳鼠肾细胞的培养是一个需要细心和耐心的过程。
通过合理的培养条件和操作方法，可以成功地培养出大量健康的细胞，并进行进一步的实验和分析。
乳鼠肾细胞的原代培养
乳鼠肾细胞的原代培养及传代培养生64班范泓洋30060300031. 实验目的a)掌握原代细胞培养的原理与操作方法，了解无菌操作的条件和注意事项；b)了解并通过实践学习处死与解剖乳鼠和识别、取出乳鼠肾脏的方法；2. 实验原理新生约3天的乳鼠体内的组织与器官均没有发育成熟，处于旺盛的分裂生长时期，因此是用作细胞培养的良好材料，适当的培养就可以观察到贴壁和分裂增殖现象。
由于肾脏的细胞类型较为单一并且肾脏本身易于从乳鼠体内取出，将肾作为实验材料是较好的选择。
在进行细胞培养之前，首先要从组织中提取出大量的分散的单细胞并制备成细胞悬液。
这就需要首先破坏细胞外基质以及细胞连接对组织细胞的“束缚”。
胚胎或新生动物的组织中细胞外基质和细胞连接并没有充分形成，这也是将新生动物作为实验材料的原因之一。
具体的方法是用蛋白酶例如胰蛋白酶（trypsin）或胶原酶（collagenase）和乙二胺四乙酸（EDTA）处理组织，使之成为单细胞。
胰蛋白酶作用于肽链的Lys或Arg残基的羧基末端，将肽链水解为长短不同的几段；在胎儿发育过程中活性很强的脊椎动物胶原酶（vertebrate collagenase）能够催化胶原蛋白在Gly-Leu和Gly-Ile键处水解，将其裂解为一个较大的N端片断（75%）和一个较小的C端片断（25%）。
这两种酶可以达到有效降解细胞间质蛋白的目的。
EDTA是钙离子螯合剂，而Ca2+在细胞粘连中起到了关键性的作用，去掉有助于肾细胞脱落。
用酶解的方法能够使细胞从原有组织中脱落并保持生命力，本实验正是采用了这样的方法。
3. 实验材料、用品和仪器超净工作台、倒臵显微镜、二氧化碳培养箱、水浴锅、高压灭菌锅、离心机、滤器酒精灯、酒精棉、镊子、器械缸、废液缸、记号笔，蜡盘、大头针、眼科剪、眼科镊，移液器架、移液器、吸头，试剂瓶、试剂瓶架，平皿、细胞培养瓶、离心管等PBS溶液，0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA溶液，DMEM培养基（含10%小牛血清及双抗）4. 实验步骤4.1 将乳鼠（3天左右）断头放血致死。
小鼠肾脏足细胞的原代培养和鉴定
小鼠肾脏足细胞的原代培养和鉴定高霞;雷晓燕;刘姝娆;索艳红;曹晓锋;高明东【摘要】目的:建立可操作性好、简单易行且效率较高的小鼠肾脏足细胞分离及原代培养模式,为其进一步研究奠定基础.方法:取C57/BL6J小鼠肾脏,通过差异过筛法获取300目筛的肾小球,用制备好的KI-3T3培养基重悬肾小球后静置于铺被鼠尾胶原的培养皿中,4d后开始换液,7d后开始胰蛋白酶消化肾小球,并开始足细胞传代培养.5～7 d传代1次,传代2～3次后收集细胞鉴定.采用倒置扭转显微镜观察小鼠肾脏足细胞形态表现,采用PCR法检测小鼠肾脏足细胞中nephrin,podocin和P-cadherin的表达.结果:肾小球种植3d后可见足细胞从组织中爬出,足细胞传代培养7d后在倒置相差显微镜下可观察到细胞胞体有突起生长.PCR法检测,分离培养的足细胞表达nephrin、podocin和P-cadherin.结论:差异过筛结合消化酶技术能够成功分离培养C57/BL6J小鼠肾脏足细胞.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2017(043)001【总页数】5页(P186-189,后插4)【关键词】肾脏;足细胞;原代培养【作者】高霞;雷晓燕;刘姝娆;索艳红;曹晓锋;高明东【作者单位】甘肃省人民医院儿科,甘肃兰州730000;甘肃省人民医院儿科,甘肃兰州730000;甘肃省中医药大学研究生处,甘肃兰州730000;宁夏医科大学研究生学院,宁夏银川750000;甘肃省人民医院儿科,甘肃兰州730000;甘肃省人民医院儿科,甘肃兰州730000【正文语种】中文【中图分类】Q813.11研究[1-2]表明：足细胞损伤是导致大量蛋白尿发生的关键环节。
有关足细胞的研究是肾脏病领域的热点内容，但目前足细胞的原代技术仍十分有限，已有的报道主要局限在大鼠足细胞的分离及培养方法，有关小鼠足细胞原代培养技术少见报道。
C57/BL6J小鼠是建立基因敲除模型的主要模式动物[3]，是实现基因敲除或基因敲入动物成模的关键动物品系。
小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养2013
细胞工程综合实验报告小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养班级 xxxx姓名 xxxx学号 xxxxxxxxxx指导教师 xxxx实验时间 xxxx成绩小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养姓名学号班级一、实验目的1.了解细胞原代培养培养的基本方法和操作过程。
2.初步掌握培养过程中的无菌技术。
3.了解在相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。
二、实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。
巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。
巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。
目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。
培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
乳鼠肾细胞的原代培养、传代培养
目的要求
一、了解细胞原代培养、传代（继代）培养的基本方法和操作过程。
二、初步掌握培养过程中的无菌技术。
三、掌握在例置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。
用品
超净工作台
恒温培养箱
普通显微镜
例置相差显微镜
水浴箱、离心机
解剖剪、眼科剪
镊子（尖头、平头和有钩镊）
烧杯
培养瓶
离心管
吸管
血球记数板
酒精灯
单个仪器逐个弹出在屏幕上，小器械逐个弹出在超净台上
培养用品
RPM1 1640培养液（含小牛血清及青、链霉素）
试剂库弹出具体内容酒精冻存培养液胰蛋白霉---⎪⎪⎭
⎪⎪⎬⎫75%PBS 0.25% RPM1 1640、0.25%胰蛋白霉、PBS ，冻存培养液微热字显示
动物细胞及细胞系
新生乳鼠（小鼠）
中国仓鼠卵巢细胞（CHO ）
人宫颈癌细胞（HELA ）
以上三个也为热字显示
乳鼠肾细胞原代培养
方法1—单层细胞培养法
所有组织中都有一定量的细胞间质（纤维和基质等），对细胞生长有妨碍作用，
用胰酶消化能出去间质，使组织松散成单个细胞或小的细胞团，细胞易于生长。
步骤
1．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
2．点燃酒精灯，用品按布局放置，安装吸管等
3．取材
取新生乳鼠一只，采用颈椎脱臼法处死，然后把这个小鼠进入盛有75%酒
精的烧杯中2-3秒，随即携入超净工作台内。
在超净工作台内取出小鼠，置于消毒培养皿中
打开消毒器械包
用镊子掀起乳鼠腹部皮肤，用解剖剪剪开腹腔，充分暴露腹腔，
用另一镊子轻轻夹起肠管，翻置一侧，充分暴露位于腹腔背壁脊柱两侧的肾脏
取下双侧肾脏，放入消毒培养皿中
用吸管吸取PBS加入培养皿中，清洗肾脏3次，尽量去掉血污
再将肾组织用解剖剪剪成几块
再用PBS漂洗，去净血液为止
4．消化
将洗净的组织块移入消毒小瓶中（如毒霉素瓶）用眼科剪深入瓶内反复剪切组织直至0.5mm大小的组织块
加入5-8倍量（体积）的0.25%胰蛋白酶，盖好放入37︒C水浴中消化20-30分钟，注意应每隔5分钟振摇一次。
当组织块变得疏松，颜色略白时，取出置于超净工作台内
用吸管反复吹打组织块，使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态加入1-2ml培养液终止消化
净置片刻，让未消化完的组织块自然下沉，将上部的组织悬液移入消毒离心管中离心
5．离心及计数
离心管平衡后，以800-1000转/分离心8-10分钟，超净工作台内开盖，吸取上清液
加入3-5ml培养液，盖盖，注意应有空隙，标明细胞名称，代数，日期。
在倒置相差显微镜下观察细胞分散情况后置37︒C孵箱中培养
新生乳鼠（活）→新生乳鼠（死）→放在70％酒精烧杯中→被平放解剖→
组织块在平器中→放入PBS清洗→组织块入小瓶中→被剪刀剪切→小瓶放
入水浴箱中消化→小瓶中液体转移至离心管→离心机→人面容显微镜（计数
细胞）→操作人向培养瓶中放液体→培养瓶被放入CO2孵箱。
这为一系列照片组成的动画效果显示。
原代培养细胞的观察
每天要对按种培养的细胞做常规性检查，观察的主要内容是：
污染与否
细胞生长状态
PH（通过培养液颜色变化）
如发现培养液变为黄色且又混浊，表明已被污染，这时细胞不易贴壁生长，逐渐死亡。
如培养液为桔红色，一般说明细胞生长状态良好
在没有发生污染的情况下，一般按规24h，可见到许多细胞贴壁，由圆形悬浮状态的细胞延展成短梭状。
培养3—4天时，细胞生长繁殖，数量增加，可见细胞形成孤立小片（细胞岛），逐渐扩展。
细胞透明，颗粒少，界线清楚，状态佳。
由于细胞生长旺盛，代谢产物堆积，CO2增多，培养液逐渐变酸呈黄色，但液体澄清，此时换液一次。
大约7—10天，原代培养细胞可基本辅满瓶壁，形成致密单层，这时可进行传代培养。
方法II——组织块培养法
组织切成0.5—1mm3的小块后，由于组织块体积很小，再不加任何粘着剂情
况下，它们也能直接贴付与瓶壁上，然后细胞从组织块边缘向外长出生长晕，最后连接成片而形成单层细胞。
此方法程序简化，是常用的原代细胞培养方法。
步骤
1．取材镊同单层细胞培养法
2．洗净的组织块移入消毒平皿中，也可用小瓶代替。
用眼科剪反复剪成
0.5-1mm3小块
用吸管滴加几滴培养液，轻轻吹打混匀
用吸管分次吸取小碎块悬液，注意吸在吸管前端部，以免吸德过高，组织小块粘附与管壁而丢失
将组织碎块在培养瓶低上散开摇匀
然后翻转培养瓶，加入2-3ml培养液(15mm2)盖好，标记好，置37 C孵箱中培养2-3hr
待组织小块略干燥，能牢固贴在瓶壁时，再慢慢翻转培养瓶，使培养液浸泡组织块，净置培养，动作一定要轻，减少振动，否则会使组织块脱落，影响贴壁培养。
观察
净置培养3天后开始观察，移动培养瓶时要尽量时培养液震荡撞击组织块。
注意检查有否污染处，应再显微镜下观察组织小块边缘有否细胞，一般最先出现的时形态不规则的游走细胞，接着是成纤维细胞或上皮细胞
当细胞分裂，细胞数量增多时，在组织块周围可见到生长晕
随后细胞生长分裂增快，呈放射状向外扩展逐渐连成一片
可根据培养液颜色，更换培养液
约10-15天后细胞可长成单层，即可传代培养
细胞传代（继代）培养
当原代培养细胞或已为细胞系细胞，增殖达到一定密度后（一般形成致密单层），则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以适当比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养。
传代培养的累积次数就是细胞的代数。
本实验以Hela细胞为例，显示传代培养过程
步骤
1．倒去细胞培养液（对于小口的培养瓶可采用顷倒方法，对于培养皿，必须用吸管吸出
2．吸取适量的PBS加入培养瓶中，轻轻振荡后弃去重复一次，以清于血清成分，利于胰酶消化
3．加入适量0.25%胰蛋白酶（一般100mm培养皿可加入1ml，15cm2培养瓶加入5-8滴）转动培养瓶，使其湿润整个细胞房，高温下消化2-3分钟。
翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜出现针孔大小空隙时即可顷去消化液，如消化程度不够可延长消化时间，或置于37︒C孵箱中加速胰酶作用如见大量细胞片装脱落，已消化过头，则不能顷倒消化液而直接进行下一步操作4．加入适量培养液终止消化
吸取瓶中培养液反复冲瓶壁上的细胞层，至全部冲下
轻轻吹打，混匀，成细胞悬液
取样计数，调整细胞浓度为5⨯105/ml
15cm2培养瓶培养时，吸取1ml细胞悬液加到新培养瓶中，加入4ml培养液，盖好，置37︒C孵箱中培养。
手持培养瓶顷倒培养液→向培养瓶中加入胰酶（滴加）→加入培养液→转移到另一培养瓶→放入培养箱。
为照片显示过程
传代培养细胞形态观察
细胞传代后，应每日对细胞进行观察，注意是否污染及细胞贴壁和生长情况。
在其生长过程中可认为分为5个时期：
游离期
细胞经消化分散后，由于愿生质收缩及细胞弹性，细胞成圆形，折光性强，呈悬浮状态。
吸附期
接种24小时后，由于细胞的附壁特性，开始贴壁，圆形细胞变成延展状态。
繁殖期
细胞快速生长、分裂，形成细胞岛直至细胞单层。
维持期
细胞形成单层后生长与分裂减缓、折光性减弱，细胞内颗粒增多，由于代谢物的积累，CO2增多，培养液变黄。
衰退期
如不及时换液和传代，由于营养缺乏、代谢物积累，细胞内颗粒进一步增多，立体感差，细胞皱缩、脱落、逐渐衰老死亡。
游离期镜下照片。
吸附期镜下照片。
繁殖期镜下照片。
维持期镜下照片。
衰退期镜下照片。
照相（显微镜下）图片显示。