如何自制核酸探针
核酸探针的制备
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标记探针制备
标记探针制备
标记探针制备方法是一种用于生物学和医学研究的重要技术，它使用标记探针（例如核酸、碳水化合物或蛋白质）来克隆、检测和定位特定的DNA序列或蛋白质。
该技术在遗传学、分子生物学、转基因研究、微生物学和药物发现等领域有着广泛的应用。
标记探针制备的过程主要包括几个步骤：
1. 选择目标序列：首先，研究者需要选择他们想要克隆或检测的特定DNA序列或蛋白质序列作为标记探针的目标序列。
这可以通过搜索数据库或通过任何其他方法实现。
2. 合成标记探针：接下来，研究者可以使用任何一种合成技术（例如PCR、合成DNA或全基因组合成）来合成标记探针，以实现对特定序列的克隆和检测。
3. 加入标记物：研究者可以使用任何一种方法将标记物（如核酸、荧光素或放射性同位素）加入到已经合成的标记探针中，以便将其与特定序列区分开来。
4. 纯化探针：最后，研究者可以使用纯化技术将标记探针从其他成分中纯化出来，以便用于实验。
标记探针制备技术的使用有助于研究者更好地深入理解和研究人类基因组的结构和功能，也有助于研究者更
快、更准确地确定他们感兴趣的物种的基因组结构，从而为药物发现和基因治疗等应用提供更多有用的信息。
5.06 核酸的分子杂交-探针制备
缺口平移法的原理
• 将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的聚合酶活性和5` 的外切酶活性相结合。 的5`→3`的聚合酶活性和 →3`的外切酶活性相结合。 的聚合酶活性和 的外切酶活性相结合 • 首先用 首先用DNAase I 在探针 在探针DNA双链上造成缺口，然后再 双链上造成缺口， 双链上造成缺口 借助于E.coli的DNA pol I的5`→3`外切酶活性，切去带有 外切酶活性， 借助于 的 的 外切酶活性 5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶 磷酸的核苷酸； 聚合酶活性， 磷酸的核苷酸 同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生 聚合酶活性 物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 • 这两种活性同时作用，缺口不断向 方向移动，DNA链 这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动 方向移动， 链 上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代， 上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的 DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记 探针。 ，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。 探针
（二）DNA芯片的类别 DNA芯片的类别
• 据芯片的性能与用途分： 据芯片的性能与用途分： 1）毛细管型微芯片 2）基因探针型微芯片 • 据DNA芯片上微排列的DNA不同分： DNA芯片上微排列的DNA不同分 芯片上微排列的DNA不同分： 1）寡核苷酸芯片 cDNA芯片 2）cDNA芯片
（三）DNA芯片技术流程 DNA芯片技术流程
合成寡核苷酸探针注意原则： 合成寡核苷酸探针注意原则：
1）长度（10-50 bp); 长度（10G:C对含量40%-60%； 对含量40% 2) G:C对含量40%-60%； 3）探针内避免互补； 探针内避免互补； 4）避免同一碱基连续出现； 避免同一碱基连续出现； 5）与非靶序列有70%以上同源性或连续8 与非靶序列有70%以上同源性或连续8 70%以上同源性或连续 个以上碱基序列相同，最好不用。 个以上碱基序列相同，最好不用。
【学前教育】探针的制备
探针的制备1️⃣ 探针制备的基本原理探针制备是分子生物学和生物技术领域中的一项关键技术，它涉及合成具有特定序列的DNA或RNA分子，这些分子能够与目标核酸序列特异性结合。
探针的制备基于碱基互补配对原则，即AT（腺嘌呤胸腺嘧啶）和GC（鸟嘌呤胞嘧啶）之间的氢键相互作用。
通过精确设计探针的序列，可以实现对特定基因、mRNA或其他核酸分子的检测和定量分析。
2️⃣ 探针制备的关键步骤2.1 序列设计与合成探针的序列设计是制备过程的第一步，它决定了探针的特异性和灵敏度。
设计时需要考虑目标序列的保守性、探针的长度（通常为1530个碱基）、熔解温度（Tm值）以及潜在的二级结构等因素。
一旦序列确定，就可以通过化学合成方法（如固相亚磷酰胺三酯法）在DNA合成仪上合成探针。
2.2 标记与修饰为了提高探针的检测效率和准确性，通常需要对探针进行标记或修饰。
常见的标记方法包括放射性同位素标记、荧光标记和化学发光标记等。
其中，荧光标记因其高灵敏度和易于操作而广受欢迎。
此外，还可以通过引入锁核酸（LNA）、肽核酸（PNA）等修饰来提高探针的稳定性和特异性。
2.3 纯化与鉴定合成后的探针需要经过纯化步骤以去除未反应的原料和杂质。
常用的纯化方法包括凝胶电泳、高效液相色谱（HPLC）和磁珠分离等。
纯化后的探针需要进行质量鉴定，包括浓度测定、纯度分析和序列验证等，以确保其符合实验要求。
3️⃣ 探针制备的应用与挑战探针制备技术在生物医学研究、临床诊断、药物开发和环境监测等领域具有广泛应用。
例如，在基因表达分析中，荧光原位杂交（FISH）技术利用标记的DNA探针来检测细胞或组织中的特定基因表达；在病原体检测中，基于探针的PCR技术可以实现对病毒、细菌等病原体的快速、准确检测。
然而，探针制备也面临一些挑战。
例如，探针的特异性和灵敏度可能受到目标序列复杂性、探针设计不合理或实验条件变化等因素的影响。
此外，探针的制备成本较高，且需要专业的实验室设备和操作技能。
核酸探针的制备方法
核酸探针的制备方法嘿，咱今儿就来聊聊核酸探针的制备方法。
这核酸探针啊，就像是一把专门寻找特定核酸序列的小钥匙。
先来说说化学合成法吧。
这就好比是个精细的裁缝活儿，一点一点地把那些核苷酸分子按照咱想要的顺序给拼接起来。
通过特定的化学反应，让它们乖乖地排好队，形成咱需要的核酸探针。
这可是个技术活，得特别仔细，不能出一点差错呢！还有一种方法叫 PCR 扩增法。
你可以把它想象成是复制粘贴的魔法。
从一个小小的模板开始，利用 PCR 技术不断地扩增，就像变魔术一样，变出好多好多和模板一样的核酸序列，这些可就成了咱的核酸探针啦。
再说说克隆载体法。
这就好像是给核酸找个安稳的家。
把目标核酸插入到克隆载体中，然后让它在里面好好地生长、繁殖，等数量够了，再把它们提取出来，这不就得到核酸探针了嘛。
还有一种方法呢，是体外转录法。
这就像是一场音乐会，各种核苷酸分子在特定的条件下，演奏出美妙的核酸探针“乐章”。
通过特定的酶和模板，让它们合成出我们需要的核酸探针。
每种方法都有它的特点和适用情况呀。
就像不同的工具，在不同的场合能发挥出它们最大的作用。
比如说化学合成法比较适合制备短的核酸探针，而PCR 扩增法则在需要大量相同核酸探针的时候特别好用。
在实际操作中，咱可得根据具体的需求和条件来选择合适的制备方法。
这就跟咱出门穿衣服一样，得看天气、场合来决定穿啥。
要是选错了方法，那可就像大冬天穿个短袖出门，不得冻得够呛呀！总之呢，核酸探针的制备方法有很多种，每一种都有它独特的魅力和用处。
咱得好好了解它们，才能在需要的时候选出最合适的那一个，让核酸探针这把小钥匙发挥出最大的作用，去打开我们想要探索的核酸世界的大门！这就是关于核酸探针制备方法的那些事儿啦！。
探针的制备
核酸杂交探针制备的方法及原理核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。
它的基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。
这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。
因此，当用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。
探针广义上是指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子，例如抗原-抗体、生物素-亲和素等均可看成是探针与靶分子的相互作用。
核酸探针是指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链。
根据来源与性质不同已分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA 探针、cRNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等5类。
根据标记物不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类。
用于杂交的基因探针必须先进行标记，最常用的是同位素标记和非同位素标记两大类。
⑴非放射击性核酸探针的标记的方法：①酶促标记，酶促标记的方法有缺口平移、随机引物、末端加尾、末端标记、逆转录掺入、体外转录、PCR。
②光促标记，光促标记的方法有光敏生物素、光敏地高辛、生物素、补骨脂素光DNP（2,4-二硝基苯）。
③化学修饰合成法，化学修饰合成法的方法有基(NH2) 、硫基(SH)、5'-OH基5'-磷酸基、化学合成⑵非同位素标记法①半抗原标记法：在核酸分子上用半抗原标记制备成免疫核酸探针，使之能用免疫学方法去检测。
②直接标记法：将特定酶或蛋白质直接标记在DNA分子上,然后以酶促显色反应或特异性蛋白质染色何等检测系统,现多用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。
⑶生物素标记法将生物素（Biotin）连接在核酸探针上，利用亲和素对生物素有极高亲和力的原理，分子杂交后用亲和素（Avidin）或链霉亲和素（Streptavidin）进行检测。
一种球形核酸探针及其制备方法和应用[发明专利]
![一种球形核酸探针及其制备方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/88868641f524ccbff0218483.png)
专利名称：一种球形核酸探针及其制备方法和应用专利类型：发明专利
发明人：张卉,杨国庆,乔斌,郭群群,姜居倩
申请号：CN201810676597.X
申请日：20180627
公开号：CN108866161A
公开日：
20181123
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种球形核酸探针及其制备方法和应用，该球形核酸探针由纳米金作为球形核酸的核心，由三链杂交形成的双链的DNA与适配体装到纳米金的表面作为球形核酸探针的外壳。
本发明的载药球形核酸探针不仅能够检测端粒酶的活性而且探针表面的DNA复合物中富含CG核苷酸可以携带抗癌药物阿霉素，因此该探针对癌细胞进行治疗，并且探针表面修饰的适配体使该探针能在复杂的生物环境中具有靶向性。
本发明的载药球形核酸探针具备良好的稳定性，同时，该探针具备良好生物相容性且对细胞无毒副作用，具备检测范围宽，灵敏度高等优点，同时，该探针检测速度快，并且制备步骤简单。
申请人：南京师范大学
地址：210023 江苏省南京市仙林大学城文苑路1号
国籍：CN
代理机构：南京苏高专利商标事务所(普通合伙)
代理人：孙斌
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放射性核酸探针的制备及应用
…….
•三、放射性核酸探针在分子生物学研究中旳应用
•（1）筛选载体 外源DNA需要与某种工具重组，然后才干导入 宿主细胞中进行克隆和保存或体现外源DNA中旳遗传信息，这种 将外源DNA携带进入宿主细胞旳工具称为载体。根据核酸序列旳 同源性，利用放射性核酸探针与转化后宿主细胞中旳质粒或噬菌 体进行杂交，能够筛选出重组旳质粒或噬菌体。从而实现重重组子，一般都采用杂交进行筛选，以便在较短旳时间内取得阳 性克隆。用DNA片段作为探针进行杂交旳溶液主要有：甲酰胺； 水溶液。这两种溶液都能得到良好旳成果。
•（4）鉴定作物品种 因为不同品种旳作物，其DNA和mRNA存在 着差别，所以用特定旳核酸探针进行不同品种间旳分子杂交，可 得到不同品种在遗传物质上旳差别。
•（2）检测基因体现 细胞核内旳DNA片段经过转录形成mRNA并 释放到细胞质中。被检测基因在细胞中旳转录情况能够进行如下 分析：
•① Northern杂交 检验细胞中是否具有特定旳mRNA，测定特定 mRNA在总RNA中旳百分比，由此取得目旳mRNA旳转录情况。
•② 斑点杂交 应特异性探针ห้องสมุดไป่ตู้测mRNA，并估计体现过程中mRNA 旳转录程度。
第一节 放射性核酸探针旳基本类型与制备措施
•一、双链DNA探针
• 1、切口平移法(Nick translation) • 2、随机引物合成法 •二、单链DNA探针 • 1、从M13载体衍生序列合成DNA探针 • 2、从RNA合成单链cDNA探针 •三、末端标识DNA探针 • 1、3，末端标识 • 2、5，末端标识 • (1) 前向反应(Forward reaction) • (2) 互换反应(Exchange reaction) •四、寡按苷酸探针 • 1、 T4多核苷酸激酶标识 • 2 、末端转移酶标识(Altar等，1989) • 3、 Klenow片段标识 •五、RNA探针
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如何自制核酸探针？
什么是核酸探针？
核酸探针是能与特定的靶分子发生特异性结合的一段核苷酸分子。
通过在核酸探针上连接一些小分子化合物，如生物素、荧光素、地高辛等，或者放射性同位素标记核苷酸，可以达到检测靶基因序列和纯化的目的。
这一过程被称为核酸杂交。
其原理是碱基互补的两条核酸分子退火形成双链。
探针应用
核酸探针技术作为分子生物学中最常见的技术之一，是印记杂交，原位杂交，实时荧光PCR，microarray（微阵列）等技术不可或缺的组成部分。
探针技术能定性或者检测特异性DNA/RNA序列，还可用于病原微生物和寄生虫的检测，疾病诊断等领域。
探针制备
探针标记主要分为放射性和非放射性标记法。
探针制备流程如图1所示。
Southern印迹、Northern印迹等需要较长的DNA探针，常使用缺口平移法和随机引物法进行标记。
而这些方法对于较短的DNA（200 bp以下）来说，效率很低，常使用末端标记法。
除了这三种方法，常见的还有PCR标记法。
图1. 探针制备流程。
随机引物法
随机引物法的原理是利用随机引物（random primer，即DNA 水解、分离得到的六聚脱氧核苷酸作）与单链DNA随机互补结合，在Klenow大片段酶的作用下，合成互补链，直至下一个引物。
如果模板是RNA，则使用反转录酶。
随机引物法可以使标记均匀跨越探针全长。
相比于缺口平移法，探针的活性更高，但是产量相对较低。
图2. 随机引物法的原理。
Protocol
试剂：
[α-32P]dCTP (3000Ci/mmol), dATP,dTTP,dGTP (5 mmol/L),Klenow大片段（2U/uL），模板，随机引物，
NA终止/贮存缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.5% (m/V) SDS）
5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L 二琉苏糖醇（DTT)，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至 pH 6.6），1 mol/L DTT 贮存于 -20℃，临用前用水稀释，使用后弃去稀释的 DTT。
）
实验步骤：
1、在一个 0.5 mL 的微量离心管中加入溶于 30 uL 水的模板 DNA ( 25 ng ) 及 1 uL 随机脱氧核苷酸引物（约 125 ng）。
2、使用PCR或者预热的水浴锅95℃热变性10min，迅速放冰上1min。
3、4℃离心混合物10s，重新置于冰上。
4、引物和模板的混合物中加入：
dATP, dTTP, dGTP 各1 uL
5X 随机引物缓冲液 10 uL
[α-32P]dNTP 5 uL
水至 50 uL
然后加入5 uL的klenow片段。
5、轻弹混合均匀,轻甩使液体降至管底。
室温反应60min。
然后加入10 uL的NA终止/贮存缓冲液。
6、制备好的探针-20℃保存。
或者过柱后保存。
原位杂交需要过柱。
缺口平移法
缺口平移法标记探针的基本原理是：先用适当浓度的DNA酶I在DNA分子的一条链上打开缺口(nick)，缺口处形成3’羟基末端，再利用大肠杆菌DNA聚合酶I的 5’→3’方向外切酶活性，将缺口处5’端碱基依次切除。
与此同时，在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下，以另一条DNA链为模板，以带标记得dNTP为原料，顺序将dNTP连接到切口的3’羟基上，从5，端向3’端方向重新合成一条互补链。
图3. 缺口平移法制备探针原理。
末端标记法
末端标记法可用于标记较短的探针。
如图4所示，末端标记法又可以分为T4多核苷酸激酶、Klenow片段、T4 DNA聚合酶。
他们各自的原理如下图所示。
-T4多核苷酸激酶
图4. 利用T4 PNK和 [γ-32P]dATP进行末端标记。
-Klenow片段
图5. 利用Klenow片段进行末端标记。
-T4 DNA聚合酶
图6. 利用T4 DNA聚合酶进行末端标记。
寡聚核苷酸探针
寡聚核苷酸多由商家定制合成，可广泛用于测序、杂交和引物外延。
末端标记法适合标记合成的寡核苷酸探针。
其原理是：在大肠杆菌 T4 噬菌体多聚核苷酸激酶(T4 PNK)的催化下,将标记ATP的磷酸连接到带羟基的待标记寡核苷酸 5′末端上。
PCR标记法
PCR 标记法是将标记过的dNTP添加到DNA模板溶液中,在DNA聚合酶的催化作用下,经过多次变性、退火和延伸过程的重复性循环,合成掺入标记物的DNA 片段。
这种方法简便、快速、重复性好,对模板DNA的纯度要求低,可用于大量制备。
图7. PCR标记法。
探针纯化
乙醇可以出去部分未参与反应的核苷酸等物质，而Sephadex等凝胶过滤的方法可以除去几乎所有未参与反应的核苷酸。
根据探针分子质量选择Sephadex G50（100bp以上）或者Sephadex G25（100bp以下）。
Protocol
1.将Sephadex G50悬浮于TE，（G25需要悬浮在T50E）,高温高压灭菌，室温保存。
2.将poly-prep柱置于架子上。
将悬浮的Sephadex填充入柱子中。
并用5ml TE（G25选择T50E）平衡。
3.将标记好的探针放入柱中。
4.缓慢加入400 uL TE（G25选择T50E）.并回收TE（G25为T50E）。
每管200 ul，共回收6管。
5.测定各管的放射性强度。
选择放射性强的为探针，优先考虑。
参考资料：
《现代分子生物学实验原理与技术》
赵美萍,张新祥,常文保.生化探针技术.大学化学,2004,19:2.。