《生物工程下游技术实验》项目一
生物工程下游技术
⽣物⼯程下游技术⽣物⼯程下游技术⽣物⼯程下游技术的定义指从动植物与微⽣物的有机体或器官、⽣物⼯程产物（发酵液、培养液）及其⽣物化学产品中提取、分离、纯化有⽤物质的技术过程。
实质：是研究如何从混合物中把⼀种或⼏种物质分离出来的科学技术。
1.⽣化⼯程分离技术预处理结晶⼲燥离⼼法：离⼼过滤、离⼼沉降、超离⼼萃取法：有机溶剂、双⽔相、液膜、反胶团、超临界层析法：凝胶过滤层析、反相层析、亲和、疏⽔相互作⽤、聚焦、离⼦交换膜分离：微滤、超滤、反渗透、透析、电渗透2.⽣物物质常⽤的分离技术氨基酸：结晶和离⼦交换法蛋⽩质和多肽：离⼦交换层析、电泳糖类：吸附层析脂质：有机溶剂萃取、超临界流体萃取和层析抗⽣素：有机溶剂萃取、离⼦交换、结晶和吸附层析3. ⽣物分离⽅法的选择与评价原则：步聚少，次序合理，产品规格（注射，⾮注射），⽣产规模，物料组成，产品形式，产品稳定性，危害性，物性：溶解度、电荷、分⼦⼤⼩、功能团、稳定性、挥发性，废⽔处理4.浓缩率：浓缩程度⼀般⽤浓缩率(concentration factor)表达，是⼀个以浓缩为⽬的的分离过程的最重要指标。
浓缩率为m，mt=mx则⽬标产物未得到任何程度的分离纯化。
5.分离因⼦：分离因⼦⼜称分离系数。
产品中⽬标产物浓度越⾼，杂质浓度越低，则分离因⼦越⼤，分离效率越⾼。
6. 回收率：⽆论是以浓缩还是以分离为⽬的操作过程，⽬标产物均应以较⼤的⽐例回收, 回收率R：⽣物分离操作多为间歇过程（分批操作），若原料液和产品溶液的体积分别为VC和VP。
1 ⽣物产品与普通化⼯产品分离过程有何不同？2 设计⽣物产品的分离⼯艺应考虑哪些因素？3 分离纯化的回收率与浓缩率如何计算？4 现代⽣物分离⼯程研究⽅向有哪些特点？5 分离纯化指标有哪些?简述pH对发酵液过滤特性的影响，并举例说明。
答：（1） pH直接影响发酵液中某些物质的电离程度和电荷性质，因此适当调节pH值可以改善发酵液的过滤特性。
《生物工程下游技术》课程教学大纲
《生物工程下游技术》课程教学大纲（Downstream Technology of Biology Engineering ）课程编号：1923030（1913030）课程类别：专业课适用专业：生物技术、生物工程先修课程：无机化学、分析和有机化学、物理化学、生物化学、发酵工程等总学分：2.5 其中实验学分：1总学时：56 （其中理论24学时、实验32学时）教学目的与要求：通过对本课程学习，要求学生从生物工业下游技术的角度，归纳、阐述现有发酵工业和新兴的正在发展中的生物技术产品的提取、分离、纯化、精制加工等技术的科学本质、原理、方法、规律及发展趋势，以及这些技术和环境保护之间的关系。
通过本课程的学习，使学生掌握生物工业产品下游制造技术的科学本质，理解、掌握传统技术基础，接受新概念、新知识、新技术，为今后的科学研究、技术开发和工程应用作好理论准备。
本课程主要介绍发酵液的预处理、微生物细胞破碎、溶剂萃取法、双水相萃取法、反胶团萃取法、膜的分离过程、离子交换法、超临界萃取、结晶技术、蒸发与干燥等内容。
教学内容与学时安排第一节生物工程下游技术的工作领域一、技术范畴二、生物工业下游技术的发展历史古代酿造业；第一代生物技术；第二代生物技术；第三代生物技术。
第二节生物工业下游技术的一般工艺过程一、原料及产品特性以粗原料发酵为主，如酒精等；待处理物料中产品浓度很低；产品具有活性和热敏性；基因工程产品一般为包涵体；发酵液为分批培养，容易出现差异。
二、下游技术的一般工艺过程预处理和固液分离；提取；精制；成品制作。
第三节生物工业下游技术的发展动态一、传统分离技术的提高和完善二、新技术的研究和开发新型分离介质的研发：膜、树脂和凝胶；子代分离技术；其他新兴下游技术。
三、清洁生产清洁生产工艺（技术）；清洁产品；清洁能源。
本章重点：生物工业下游技术的一般工艺过程。
教学基本要求：了解。
第二章发酵液的预处理（3学时）第一节发酵液过滤特性的改变一、降低液体粘度加水稀释法和加热法。
生物下游技术实验!!!!
生物下有技术期末大实验一、实验目的：1、熟练酵母扩大培养的技术。
2、学习酵母蔗糖酶的提取方法以及原理。
3、了解双缩脲法测蛋白质含量。
二、酵母的扩大培养:●一级培养：取新鲜苹果汁液，分装在两只经过杀菌的试管中，每只装量10~20毫升，加绵塞。
在0.06~0.10兆帕压力下杀菌30分钟，冷却至常温，接入纯酵母菌1~2针，摇动分散，在25~28摄氏度下培养24~48小时，使发酵旺盛。
●二级培养：用杀过菌的三角瓶（1000毫升），装鲜果汁500毫升，如上法杀菌，接入培养旺盛的试管酵母液两支，在25~28 摄氏度下培养24~28小时，待发酵旺盛期过后使用。
三、酵母蔗糖酶的提取（一）、部分纯化试剂：1 ．啤酒酵母2 ．一氧化硅3 ．甲苯（使用前预冷到0 ℃以下）4 ．去离子水（使用前冷至4 ℃左右）5 ．冰块、食盐6 . 1N 乙酸7 . 95 ％乙醉（二）、仪器：1 ．研钵1 个2 ．离心管3 个3 ．滴管3 个4 ．量筒50ml 1个5 ．水浴锅1 个6 ．恒温水浴7 ．烧杯1000ml 2个8 ．广泛pH 试纸9 ．高速冷冻离心机（三）、操作步骤：1 ．提取（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。
（2）称取5g 干啤酒酵母和20g 湿啤酒酵母，称20mg 蜗牛酶及适最（约10g）一几氧化硅，放入研钵中．二氧化硅要预先研细。
（3）量取预冷的甲苯3Oml 缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60 分钟．研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。
（4）缓慢加入预冷的40ml 去离了水，每次加2ml 左右，边加边研磨，至少用30 分钟。
以便将蔗糖酶充分转入水相。
（5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4 ℃, 4000rpn ，30min 。
如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。
用滴管吸出上层有机相．（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，4000rpn，离心30min 。
基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术创建人：时间：2013-04-17 【点击数： 482】实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术1．实验目的（1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。
（2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。
2．实验原理重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。
重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。
发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。
工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。
目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。
另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。
当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。
补料的流加方式直接影响着发酵的效果。
分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。
但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。
过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。
生物工程下游技术实验讲义
⽣物⼯程下游技术实验讲义⽣物⼯程下游技术实验讲义⽬录实验⼀层析柱装填及柱效测定实验⼆溶菌酶粗提取实验三溶菌酶分离纯化实验四酶活⼒及蛋⽩质浓度的测定实验五溶菌酶纯度鉴定与分⼦量测定实验⼀层析柱装填及柱效测定⼀、实验⽬的1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定⽅法；2. 熟悉凝胶层析的⼀般过程；⼆、实验原理凝胶过滤层析也称分⼦筛层析、排阻层析。
是利⽤具有⽹状结构的凝胶的分⼦筛作⽤，根据被分离物质的分⼦⼤⼩不同来进⾏分离。
相对分⼦质量⼤的⽣物分⼦由于不能进⼊或不能完全进⼊凝胶内部的⽹孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或⼤的⽹状孔通过，⼤分⼦相对于⼩分⼦迁移的路径短，保留值⼩，所以在层析过程中迁移速度最快，先从柱中流出；反之，分⼦量⼩的⽣物分⼦保留值⼤，后从柱中流出。
凝胶层析常⽤于分离纯化蛋⽩质（包括酶类）、核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗⽣素等⽣物⼤分⼦, 也可⽤于样品的浓缩和脱盐及测定⽣物⼤分⼦的分⼦质量等⽅⾯。
三、实验试剂与器材层析柱（ 1.6×30 cm ），砝码天平，玻璃棒，烧杯，刻度试管及试管架，滴头吸管，Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂），⽔浴锅，蓝⾊葡聚糖四、实验内容与步骤（⼀）测量层析柱的内径、⾼度，计算所需凝胶量⼲胶⽤量（g）=柱床体积（ml）/凝胶的溶胀体积(ml/g)由上式计算出的⼲胶⽤量再增加10%-20%（⼆）Sephadex G-50凝胶预处理称取相应质量的⼲凝胶，加⼊适量的0.02 mol/L PBS 在100℃⽔浴中加热溶胀1⼩时以上，溶胀之后将极细的⼩颗粒倾泻出去。
⽤真空⼲燥器抽尽凝胶中空⽓，并将凝胶上⾯过多的溶液倾出。
（三）层析柱的装填1 清洗：每组取⼀⽀层析柱，⽤清⽔冲洗⼲净。
2 安装与检查：检查柱下部烧结滤板是否完好⼲净。
安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。
对准出⼝处，放⼀只250mL烧杯。
090210生物工程下游技术
《生物工程下游技术》课程（）教学大纲一、课程基本信息课程中文名称：生物工程下游技术课程代码：学分与学时：72学时，4学分课程性质：专业必修授课对象：生物技术及应用专业二、课程教学目标与任务《生物分离工程》是为生物工程本科专业学生开设的一门专业必修课，是培养学生今后从事生物技术产业领域应该具备的思考、分析和解决问题能力的主干课程。
通过本课程的学习：1、使学生掌握生物产品的提取、分离、纯化、精制加工等技术的科学本质、原理、方法、规律。
2、使学生了解生物工程下游技术的科学前沿及其发展趋势。
3、培养学生应用所学理论知识、分析和解决生产及科研中的实际问题的基本能力。
三、学时安排四、课程教学内容与基本要求第一章绪论（4学时）教学目的：了解生物工业下游技术的发展历史。
基本要求：对生物工程下游分离技术的流程和发展趋势大致了解重点与难点：下游技术的一般工艺过程教学方法：多媒体教学主要内容：1、生物工程下游技术的工作领域2、生物工业下游技术的一般工艺过程3、生物工业下游技术的发展动态第二章下游技术的理论基础（4学时）教学目的：使学生了解下游技术的理论基础，为学习具体有技术奠定基础基本要求：了解下游技术的基本理论基础，了解下游技术常见的分离手段，掌握分离效率的评价标准。
重点与难点：分离机理、分离效价的评价标准教学方法：多媒体讲授主要内容：1、分离机理2、分离操作3、分离效价的评价第三章发酵液的预处理（4学时）教学目的：学习并掌握发酵液预处理的一般方法基本要求：掌握发酵液的过滤特性，掌握改善发酵过滤特性的方法，掌握高价无机离子与杂蛋白质去除的方法，掌握常见的固液分离技术（离心、过滤）的原理重点与难点：改善发酵液过滤特性的方法，无机离子的去除方法，澄清过滤和滤饼过滤的差别。
教学方法：多媒体课件教学与课堂讨论相结合主要内容：1、发酵液过滤特性的改变2、发酵液的相对纯化3、固液分离工程及设备第四章微生物细胞的破碎（4学时）教学目的：学习并掌握细胞破碎的基本方法基本要求：掌握细胞破碎的阻力来源于细胞壁，掌握常用的细胞破碎的方法及原理，了解包含体的概念及其分离、复性。
生物工程下游技术创新综合实验教学体系的建立
的专业人才。２ 世纪生物技术产业飞速发展 ， 生物技 ｌ 对
术 专业 人才 的培养 提 出 了更 高 的 要 求 。生 物 工程 下 游技 术 的应用性 很强 ， 同传 统 的 生物 专 业 课 程 相 比 ， 物 工程 生
下 游技术课 程 的教 学 面临 更 大 的 挑 战 。创 新 教 育 是 新世
容 ， 对贯 穿在 下游 技术 一般工 艺流 程 中所 有环 节 的实 只有 验 内容 ， 从头 至尾 的认 真思 考 和 操作 ， 能 够得 到最 终 的 才
（ 尔滨 师范大学 生命科 学与技术 学院 ， 尔滨 １０２ ） 哈 哈 ５ ０ ５ 摘 要： 生物工程 下游技术是 生物技 术 专业的核 心专业课 之一 ， 针对新 世 纪高等教 育发展 对创新 性教 育的要
求， 我们建立 了由综合性大 实验教 学模 块、 开放性 实验教 学模块和演示性 实验教 学模 块组成的生物工程下游技术创
起来， 系统化集成 ， 建立综合性大实验教学模块 ， 培养学生 综合运用知识的实践能力， 提高就业竞争力
我 们 以大 肠 杆 菌碱 性 磷 酸酯 酶 的分 离 、 化 为核心 ， 纯 建 立综合 性大 实验 教学模 块 ， 穿整个 下游 技术 一般工 艺 贯
教学模式的改革。《 生物工程下游技术》 作为生物技术专
新综合 实验教 学体 系， 旨在教 学中全面推 进对学生创新能力的培养与实践 ， 适应新世 纪高等教 育对生物技 术专业人
才 的培 养 需要 。 关键词 ： 物工程下游技术 ； 新 ； 生 创 实验 教 学 体 系 中 图分 类 号 ： ６ ２ ０ Ｇ ４ ． 文 献 标 志码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ８— ７ ４ ２ ０ ）０—０ １ ０ １０ ６ １ （０ ９ １ ０ ７— ２
生物工程下游技术实验(整理版)
生物工程下游技术实验实验一酵母RNA的提取及含量测定（紫外吸收法）实验二黑曲霉β-D甘露聚糖酶的纯化盐析实验三盐析β-D甘露聚糖酶活力测定实验四柠檬酸摇瓶发酵及结晶提取实验一酵母RNA的提取及含量测定一、实验目的与要求1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。
2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法，3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。
二、实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。
一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。
其中苯酚法又是实验是最常用的。
组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。
向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。
上述方法提取的RNA具有生物活性。
工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。
浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。
稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。
酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。
核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。
核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。
遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。
在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。
所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。
核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。
基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术创建人：时间：2013-04-17 【点击数：482】实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术1．实验目的（1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。
（2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。
2．实验原理重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。
重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。
发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。
工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。
目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。
另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。
当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。
补料的流加方式直接影响着发酵的效果。
分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。
但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。
过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。
生物工程下游技术课程简介
《生物工程下游技术》课程简介Downstream Technique of Biotechnology一、课程编号：060343二、课程类型：限选课总学时/学分数：32学时/2 学分适用专业：生物技术、中药学（四年级）先修课程：基因工程、细胞工程、现代生物技术大实验三、内容简介：生物工程下游技术是实现生物工程产业化的关键问题。
通过本课程的学习，对当前生物工程下游技术领域的大分子物质提取、分离及纯化技术、沉淀技术、浓缩技术、膜分离技术、生物反应器技术、各种色谱技术、各种电泳技术等有较全面、较详细的了解，并掌握一些主要技术的方案设计和实际操作。
通过案例教学等方法培养学生科学而实际的思想方法，提高分析实际技术问题和因地制宜处理这些问题的能力，使之更加容易胜任生物技术产业中新产品和新工艺的开发，生产工艺过程技术管理和高技术生产岗位的实际技术工作。
四、选用教材：《生物工程下游技术》，刘国诠主编，化学工业出版社《生物工程下游技术》课程教学大纲一、课程编号：060343二、课程类型：限选课总学时/学分数：32学时/2学分适用专业：生物技术、中药学（四年级）先修课程：基因工程、细胞工程、现代生物技术大实验三、课程的性质与任务：生物工程下游技术是实现生物工程产业化的关键问题。
通过本课程的学习，使学生对当前生物工程下游技术领域的大分子物质提取、分离及纯化技术、沉淀技术、浓缩技术、膜分离技术、生物反应器技术、各种色谱技术、各种电泳技术等有较全面、较详细的了解，并掌握一些主要技术的方案设计和实际操作。
通过案例教学等方法培养学生科学而实际的思想方法，提高他们分析实际技术问题和因地制宜处理这些问题的能力，使之更加容易胜任生物技术产业中新产品和新工艺的开发，生产工艺过程技术管理和高技术生产岗位的实际技术工作。
四、教学主要内容及学时分配：本课程讲授按每周2学时，16周共32学时安排。
六、课程内容的重点和深广度要求：重点掌握当前生物工程下游技术的原理和方法，能够上网了解各种技术最新研究及应用进展。
生物工程下游技术纳豆激酶提取实验
《生物工程下游技术》综合实验——纳豆激酶的分离纯化摘要从纳豆发酵液中提取纳豆激酶，采用30~70%饱和度的硫酸铵盐析，Sephadex G-75凝胶过滤层析对活性组分进行分离提纯。
然后检测各个步骤的样品的蛋白质含量，绘制凝胶层析图，得出峰值，最后对整个纯化方案进行评价。
结果表明，本次实验纯化回收率较低。
凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、试验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，被广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化。
凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的，透明质酸(hyaluronicacid，简称HA)，是一种国际上公认的生物大分子保湿剂，分子量达几十万到几百万，而蛋白质的分子量仅为几万，所以选择合适的凝胶可以起到分离纯化的效果。
关键词：纳豆激酶硫酸铵盐析凝胶层析目录1 前言 (4)2 材料和仪器 (4)2.1 仪器 (4)2.2 材料 (4)2.3 试剂及溶液配制 (4)3 实验方法 (5)3.1 纳豆的制作 (5)3.2 纳豆激酶的粗提 (5)3.2.1 浸提 (5)3.2.2 硫酸铵盐析 (5)3.3 Sephadex G-75凝胶层析进行纯化 (6)3.4 蛋白质含量的测定 (7)4 结果与分析 (7)4.1 蛋白质含量测定结果 (7)4.2 层析收集液测定结果 (7)4.2.2 绘制纳豆激酶的层析图 (8)4.2.3 纯化方案进行评价 (9)5 讨论 (9)5.1方法分析 (9)5.2 问题及其猜想 (10)参考文献 (12)1 前言心脑血管疾病是危害人类健康的严重疾病，其死亡率已超过了癌症。
而血栓又是心脑血管疾病中致死率最高的疾病之一，虽然现在临床上有许多用于治疗血栓的药物,如链激酶、尿激酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂以及蛇毒栓溶剂等,但是它们大多为注射用药,使用不便,且副作用大、半衰期短,很难满足血栓治疗的需要。
6705 生物工程下游技术
湖北省高等教育自学考试大纲课程名称：生物工程下游技术课程代码：6705第一部分课程性质与目标一、课程性质与特点生物工程下游技术这门课程适合于理工科专业生物工程专业进行学习。
本课程的内容更多的涉及到工业应用。
下游技术是对于由生物界自然产生的生物体或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应、微生物转化等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术，也称为下游工程或下游加工过程，是生物技术产品产业化的必经之路。
目前所指的下游技术大多数属于“物质分离”范畴。
主要研究的是物质分离的方法原理及相关的仪器设备。
生物工程下游技术这门课程涉及到物理，化学，生物化学，发酵工程，生物工程与设备等多门学科。
二、课程目标与基本要求通过学习生物工程下游技术这门课程应掌握以下基本知识点：1.生物工程下游技术的研究对象和发展历程2.下游技术的理论基础3.发酵液预处理，微生物细胞破碎方法和设备4.溶剂萃取和浸取，超临界流体萃取，双水相萃取，反胶团萃取，膜分离过程，液膜分离，离子交换法，色谱法等主要分离单元操作技术及分离过程的特点，工艺设计与设备选型通过学习了解各种分离方法的原理，适用范围，熟悉常用分离设备的操作，在实际应用中可以选择合适的分离方法对仪器进行操作达到分离的目的。
通过学习，具备对生物产品的分离、纯化技术的应用能力，及对生物物质提纯最佳方案的设计能力。
三、与本专业其他课程的关系本课程的内容更多的涉及到工业应用。
下游技术对各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。
在生物工程专业课程的学习中，是一门将生物工程上游技术应用到实际生产中所需要借助的手段。
《物理学》，《无机化学》，《有机化学》，《物理化学》等基础课是这门课程的基础，《微生物学》，《生物化学》，《酶工程》，《发酵工程》，《生物工程与设备》等专业课的知识也会运用到这门课程中，其后继课程有《发酵工厂设计》等。
生物工程下游技术实验指导
生物工程下游技术实验指导何伟 编南京师范大学生命科学院2006-06南京师范大学生物学实验教学中心课程说明根据教学计划，对理科基地、生物技术、生物教育各专业方向的本科学生开设生物工程下游技术实验36学时。
现编列11个实验项目，供实验教学时选用。
生物工程下游技术实验单独设课，1个学分。
平时实验操作成绩占30％，主要考核学生的预习情况、实验态度、动手能力及操作的规范性、实验结果、实验报告、课堂纪律等情况。
期末实验理论考试成绩占70％。
南京师范大学生物学实验教学中心实验注意事项1．自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退。
2．实验前必须认真预习，熟悉每次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。
3．实验过程中要听从教员的指导，严肃认真地接操作规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，文字要简练、准确。
完成实验后经教员检查同意，方可离开实验室。
4．实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐。
公用试剂用毕，应立即盖严放回原处。
勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。
实验完毕．仪器须洗净放好，将实验台面抹拭干净，才能离开实验室。
5．使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约。
洗涤和使用仪器时，应小心仔细，防止损坏仪器。
使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障须立即报告教员，不得擅自动手检修。
6．实验室内严禁吸烟！电炉应随用随关，严格做到：人在火在，人走火灭。
乙醇、丙酮、乙醇等易燃品不能直接加热，并要远离火源操作和放置。
实验完毕，应立即关好仪器开关和水龙头，拉下电闸。
离开实验室以前应认真、负责地进行检查，严防发生安全事故。
7．废液体可倒入水槽内，同时放水冲走。
强酸、强碱溶液必须先用水稀释。
废纸、火柴头及其他固体废物和带渣滓的废物倒入废品缸内，不能倒入水槽或到处乱扔。
8．仪器损坏时，应如实向教员报告，并填写损坏仪器登记表,然后补领。
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《生物工程下游技术实验》讲义实验项目一：“超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术”实验一：植物超氧化物歧化酶（SOD）活性测量(6学时)过程1.每组30g绿豆,洗涤，蒸馏水浸泡过夜，倒去浸泡的水，加入300 ml蒸馏水液，匀浆机匀浆，二层纱布过滤，离心（3000 rpm）得清液，取少量清液进行SOD活性及蛋白质含量测量，计算材料中SOD总活性单位及比活性单位（units/mg Pr）。
2.所得清液测量其总体积，缓慢加入硫酸铵至35%饱和度（查一般实验手册,约19.4g/100ml清液），5℃冰箱中静置备用下一实验。
SOD活性的测定：（二种方法取一种，本次实验用前者，要求理解后者的原理）●邻苯三酚自氧化法：这是最简单的一种检测方法，但干扰因素较多。
●NBT光化还原法：比较稳定，但受酚类物质干扰。
一、利用连苯三酚自氧化测SOD活性的方法溶液配制：1，连苯三酚：630 mg------→100 ml 10 mmol/L HCl (0.085 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成100 ml)。
共配500ml.2，pH 8.30 50 mmol/L Tric-HCl：A) 0.1 mol/L Tris: 12.114g-----1000 ml (储备液)B) 0.1 mol/L HCL: 浓盐酸稀释得到（8.5 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成1000 ml）(储备液)●0.05mol/L pH 8.3: 500ml A+199ml B-------定容到1000ml..操作：25︒C，3 ml 50 mmol/L pH8.30 的Tric-HCL 缓冲液，加入10 μl 50 mmol/L 连苯三酚（具体加入量应每次测量前校正，加入的原则是使下面的A325变化控制在0.07 ／min左右），迅速摇匀，倒入光径1 cm的比色杯(应该用石英杯)中，每３０秒测一次Ａ３２５值，自氧化速率的变化（∆Ａ）控制在0.07 ／min左右，加入酶液后再测连苯三酚自氧化速率的变化（∆Ａ’），酶量的加入控制在使加样后的∆Ａ’在0.035/min左右。
（以上∆Ａ∆Ａ’的变化值不需特别严格，∆Ａ只要控制在0.1以下0.04以上，∆Ａ’变化在∆Ａ的约一半左右即可）一个SOD活性单位（连苯三酚单位）：在以上条件下，加入酶如果在一分钟时间能抑制连苯三酚自氧化速率的一半，此时所加的酶量就为一个SOD的酶活性单位（unit，U）。
加入酶量相当的酶活力单位（unit）＝(∆Ａ-∆Ａ’)/∆Ａ×２提取液的总活力（或材料总活力）（unit）=加入酶量相当的酶活力单位×(反应液总体积/取样液体积)×稀释倍数比活(units/mgPr)=总活力（units）/总蛋白量（mg）●思考并回答：1，控制不加SOD时的OD值变化在0.07/分钟左右。
2，加SOD酶量控制在加酶后使OD值的变化在0.035-0.04/分钟左右。
3，理解一个酶活性单位的定义。
4，提取过程应该在每一步骤测量总活力和比活力，为什么？（总酶活及比活在酶的分离提纯过程中的意义）二、NBT光化还原法测SOD活性（选做）试剂母液：A：甲硫氨酸( methionine): 215.6mg---100mlB: NBT（氮兰四唑Nitroblue Tetrazdinna）: 9.2 mg----5 ml (一定要现配)C: 核黄素：1.13 mg----50 mlD: EDTA：87.68 mg------50 ml ( 一般用EDTA-Na2)以上溶液全部用pH 7.8 0.05M的磷酸缓冲液配制.操作：每3ml 反应液中含有：A 2.7 ml(13 mmol), B 100 μl (63 μmol), C 100 μl (1.3 μmol), D 100 μl, 加酶液后于4000 lux 光照15分钟，以不加酶液的反应液为对照(空白A560)，以不照光不加酶液的反应液调节零点，测A560 （空白A560控制在0.5左右，加酶液量控制在使A560在0.25左右）酶活（unit/ml）= (空白A560-A560)/空白A560*2*3/ 加样体积ml三、Bradford法测定蛋白质的含量实验目的:●学习考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理和方法，包括：①熟练掌握分光光度法定量测量物质含量的技术，了解误差的来源及避免的原则；②熟悉分光光度计的操作；③熟悉标准曲线的绘制（电脑和手工绘制）；④从标准曲线求得求知物质含量的方法（直接读数和根据公式计算）⑤蛋白质含量/g样品的计算●一定浓度溶液的配制（计算、称量和定容）●天平的使用●离心机的使用●移液管、移液枪、的使用实验原理:●考马斯亮蓝具有红色和蓝色两种色调,在酸性溶液中其以游游离态存在时呈棕红色,当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色(在595 nm处有最大吸收值).该反应灵敏度很高,反应速度快,约在2 min左右达到平衡,在室温1小时内稳定.在0.001~1.0 mg蛋白质范围内,蛋白质浓度与A595值成正比,因此可用于蛋白质的定量测定.●一些阳离子(如K+,Na+, Mg2+), (NH4)2SO4, 乙醇等不干扰测定,而大量去污剂如TritonX-100, SDS等严重干扰测定,少量去污剂可通过用适当的对照而消除.实验器材:●分光光度计,试管及试管架,比色皿,移液管;移液枪实验材料与试剂:●考马斯亮蓝G-250 (0.01%, W/V): 100mg 考马斯亮蓝G250溶于50ml 95%的乙醇中,加入100ml 85% 的磷酸,将溶液用水定容到1000 ml,过滤得清液于棕色瓶中备用.●标准蛋白质溶液:牛血清蛋白(BSA)用蒸馏水配成0.1mg/ml●待测样品液:S1,S2 (3颗绿豆—10ml水---研磨---离心2500rpm得清液),S3,S4为原液稀释10倍（S1S2S3S4均为样品体积，S3和S4不一定做，在未知样品蛋白含量时可先设计一个浓度梯度以保证测量值在标准曲线的线性范围内）操作方法:1.牛血清蛋白标准曲线的制作:●按下表加入试剂,混匀静置2分钟,以1号管为空白调零点,测下各管的A595值,以吸光值取未知浓度的蛋白质(通过适当稀释使其浓度控制在测量有有效范围内),加到试管内,再加入G250染色液3ml混匀,测其595nm下的吸光度,对照标准曲线求出蛋白质含量,计算其浓度.（表示为mgPr/g材料）思考题:3.Bradford 法测定蛋白质测定蛋白质含量有什么优点?4.你觉得Bradford法测定蛋白质含量有什么缺点？如何避免？5.理解零点的调节实验二：植物材料破碎及硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩①植物材料的破碎；固液分离方法；②分级沉淀------硫酸铵或有机溶剂分级分离③粗提物的透析除盐和浓缩过程：1．准备透析袋：透析袋事先预处理，Na2CO3 10g/L, EDTA 1 mmol/L 煮沸30分钟，蒸馏水洗涤，并浸泡于5℃中备用。
2．实验一所得清液测量其部体积，缓慢加入硫酸铵至65%饱和度（18.4g/100ml）（过程充分搅拌），5℃静置至分层澄清，离心除去清液，得沉淀。
3．沉淀溶于水并定容到一定体积，装入透析袋，于蒸溜水中透析过夜。
4．透析后溶液用滤纸过滤得清液。
重新装入透析袋中用PEG6000包埋进行浓缩。
●要求：测量沉淀和清液、浓缩液的SOD活性、蛋白质含量以计算总酶活和比活性的变化，评价本提取步骤的效率。
实验三：葡聚糖凝胶层析分离纯化SOD分离效果及产品质量分析上述浓缩液过滤后得清液，用葡聚糖Sephadex G100进行层析分离，层析过程参见《基础生物化学实验》（第二版，高等教育出版社）P2361．实验目的:①.掌握层析分离的基本技术;②.理解凝胶排阻层析的原理,掌握葡聚糖凝胶色谱的装柱、上样、洗脱技术。
2．实验原理：利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的一种方法。
其基本原理是含有尺寸大小不同分子的样品进入层析柱后,较大的分子不能通过孔道扩散进入凝胶珠体内部.较小的分子可以通过部分孔道,更小的分子可通过任意孔道扩散进入珠体内部.从而使得小分子移动最慢,中等分子次之,不同分子尺寸的分子先后顺序不同流出层析柱,达到分离的目的.3．实验基本操作：①.葡聚糖的预处理：●水中膨化：根据其吸水率加入适量（略大于吸水率）蒸馏水，在20℃条件下需24h；如果加热煮沸，膨化时间会大大缩短，一般在4 h即可完成，而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。
应注意尽量避免在酸或碱中加热，以免凝胶被破坏。
吸水率较大的凝胶(即型号较大、排阻极限较大的凝胶)膨化时间则较长。
●排除凝胶中气泡：膨化处理后，通过抽气或加热煮沸的方法排除气泡②.装柱：●先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出液口，排出里面的气泡，特别是要排除床底支持物上的气泡。
关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占总柱体积的15％。
●调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度，适当稀释有利于装柱过程中气泡的排除。
但稀释度太高则一次装柱的高度不够。
●将一根直径稍小的玻璃棒插入层析柱底部，沿玻璃棒将胶浆徐徐注人柱内，一边灌胶，一边提起玻棒。
注意避免产生气泡。
柱要一次装完。
●柱装好后，停10min，然后打开出液口，排出过量洗脱剂。
●柱内胶面上部保留2～3cm洗脱剂。
再将恒压洗脱剂瓶与柱上端相连。
流过至少2倍住体积的洗脱剂之后，流速开始稳定下来（层析柱平衡过程,1ml/min,1.5h）。
●调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，得到理想流速。
（1ml/min）③.加样：上述浓缩液过滤后得清液加样，要尽量快速、均匀。
一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％～5％(质量分数)左右.（这里用5%）。
加样应加于柱中心，避免沿柱壁加入。
④.洗脱：（pH 7.0, 0.02mol/l磷酸缓冲液）洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。
保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。
洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。
但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长；（这里采用1ml/min,一般每一收集部份不大于2ml，本实验因为仪器的数量问题，每份收集4ml,收集液总体积为柱床总体积的1.2倍即完成收集）。
4．结果分析：①.每一组分测量其A280吸收做为蛋白质含量的相对值，绘出洗脱曲线；②.每一组份测量其SOD活性，绘出活性物质洗脱曲线；③.根据SOD活性分布决定收集洗脱液的部分；收集活性峰及其上下各1试管的洗脱液。
④.对SOD纯化率及得率进行分析并完成实验报告（请尽量按标准完成）。