测定酶活方法

Antioxidant responses to drought in sunflower and sorghum seeding

方法

1测定土壤及植物水状况

（1）按照Barrs和Weatherley（1962）的方发测定叶片RWC（相对含水量）。在DAP（开花后的天数）分别为22，24，26和28时，每日10：00-11：00之间取样，每次取两片新近成熟的叶片→称重→将样品浸入蒸馏水中，在室温下浸润4h→在80℃下烘干48小时并在植物材料焦化前称重。（2）计算叶片的WC（自然含水量），其分母为叶片的鲜重。

（3）土壤WC的测定用传统的重量分析方法。在DAP为22，24，26和28时16：00从花盆的中心取样→称湿重→80℃下烘干48小时。

Notice 1RWC计算：RWC=（W f－W d）／（W t－W d）×100%

2WC计算：WC=（W f－W d）／W f×100%

W f：叶片鲜重；

W d：叶片干重；

W t：叶片吸水饱和时的重量。

2酶粗提液的制备

为了测定CA T，POD和SOD，取叶片0.5g(f.wt)→于6ml，50mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0），冰浴研磨→匀浆用4层纱布过滤→以每分钟15000g，4℃，离心20min→取上清。上清液可用来测量酶活性（Zhang和Kirkham，1994）。

为了测定AP，DR，MR和GR，取叶片0.7g(f.wt)→于8ml，25mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.8），冰浴研磨→过滤匀浆→以每分钟18000g，4℃，离心15min→取上清。上清液可用来测量酶活性（Cakmak，Strbac和Marschner，1993）。

试剂：磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0）。

3酶活性的测定

所有的分光光度分析都使用Hitachi U-2000型分光光度计。

3.1SOD总活性的测定按照Giannopolitis和Ries（1977）的方法略作修改（Chowdhury和Choudhuri，1985；Zhang et al。，1995）。3ml反应混合液中含63μM的NTB，1.3μM的核黄素，13mM的蛋氨酸，0.1mM的EDTA，50mM的磷酸缓冲液（pH7.8）和20μL酶液。核黄素应最后添加。将盛有反应混合液的试管放置在两盏4000lux荧光灯下，打开荧光灯，反应开始，照光10min，关闭荧光灯，反应终止，马上测定它在560nm处的吸光度。不照光的反应体系在560nm 处的吸光度作为对照，并将之从A560中减去。不加酶液的反应体系颜色最深，说明NTB被还原量最大。NTB的光还原量与SOD的活性呈反比。SOD酶活性采用抑制NBT光还原50%为一个酶活单位。

Notice：不加酶液的反应体系，以缓冲液代替酶液，其560nm处的吸光度作空白。

试剂：63μM的NTB，1.3μM的核黄素，13mM的蛋氨酸，0.1mM的EDTA，50mM的磷酸缓冲液（pH7.8）

试剂：NTB，核黄素，蛋氨酸，EDTA，磷酸缓冲液（pH7.8）

3.2CA T与愈创木酚POD活性按照Chance和Machly的方法测定（1955）。对CA T来说，其活性可以根据反应混合液1min内在240nm处的吸光度随着H2O2的分解而降低程度来确定（ε=39.4M－1cm－1，Chance和Machly，1955）。反应混合液包含50mM磷酸缓冲液（pH7.0），15mMH2O2，0.1ml酶液。加入酶液反应即开始。对POD来说，其活性可以通过测定反应混合液在460nm处的吸光度在1min内因愈创木酚的氧化作用而增加来确定（ε=26.6M－1cm－1，Chance和Machly，1955）。反应混合液包含20mM愈创木酚50μl，10mM磷酸缓冲（pH7.0）2.83ml，0.1ml酶液。加入40mMH2O220μl后反应开始。

试剂：H2O2，愈创木酚

3.3AP的活性可以根据反应混合液在290nm处的吸光度在1min内降低程度来确定（ε=2.8mM －1cm－1，Nakano和Aasda，1981）。反应混合液包含0.5mMAsA,0.1mMH2O2,0.1mMEDTA,50mM 磷酸钠缓冲液（pH7.0），0.15ml酶液。加入H2O2后反应开始。该反应速率可以通过减去未加酶液反应体系的反应速率进行校正。

3.4GR活性可以通过检测反应混合液在340nm处的吸光度1min内因NADPH氧化而降低的程度来确定（ε=6.2mM－1cm－1，Cakmak et al.,1993）。反应混合液包含1mMEDTA，1mMGSSG，0.2mMNADPH，0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.8），0.15ml酶液。加入GSSG后反应开始。

3.5DR活性可以通过检测反应混合液在265nm处的吸光度因AsA形成而引起的变化来确定（ε=14mM－1cm－1）。反应混合液体包含2.5mMGSH，0.1mMEDTA，0.2mMDAsA，50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0），0.2ml酶液（Nakano和Asada，1981；Cakmak et al.，1993）。反应时间为1min。加入DAsA后反应开始。通过减去未加酶液的反应体系吸光度进行校正。

试剂：GSSG，NADPH，磷酸钠，GSH，DAsA

3.6MR活性可以通过检测反应混合液在340nm处的吸光度在30s内的改变来确定（ε=6.2mM－1cm－1）。反应混合液体积为3ml，包含0.1mMNADH，2.5mMAsA，50mM磷酸钠缓冲液（pH7.6），4单位AsA氧化酶，0.15ml酶液（Hossain，Nakano和Asada，1984；Cakmak et al.，1993）。加入AsA后反应开始。通过减去未加AsA氧化酶反应体系的吸光度进行校正。

3.7酶的粗提液中蛋白质含量按Bradford的方法的测定，以BSA作标准。

试剂：AsA氧化酶，BSA

4抗坏血酸和谷胱甘肽的提取与分析

取1g叶片材料置于10ml5%冷的偏磷酸中匀浆，以备测量AsA，DAsA，GSH和GSSG时使用。匀浆液在4℃，22000g／min，离心15min。取上清，并用之分析抗坏血酸和谷胱甘肽。

4.1AsA，DAsA和总的抗坏血酸（AsA+DAsA）含量按Law，Charles和Halliwell（1983）的方法测定。在测定总抗坏血酸含量时，一般先用DTT将DAsA还原为AsA。DAsA含量通过总抗坏血酸含量与AsA之差来计算。测定总抗坏血酸含量的反应混合液包括上清液0.3ml，150mm 磷酸缓冲液0.78ml（含5mMEDTA，pH7.4）和10mMDTT0.15ml。将反应液在室温下放置10min，然后加入0.5%N-乙基马来酰亚胺0.15ml除去过剩的DTT。检测AsA的反应体系与上述混合液相似，只是多加0.3mlH2O，不加DTT和N-乙基马来酰亚胺。接着在以上两反应体系分别加入以下试剂：6%TCA0.6ml，44%正磷酸0.6ml，4%α,α′-双吡啶（溶剂为70%乙醇）0.6ml，0.3%α,α′-双吡啶（w/v）。加入以上试剂以后。反应混合液后，颜色都有所增加。将反应混合液涡漩混匀，40℃下温育40min，然后测量其在525nm处的吸光度。绘制0-100μgAsAml－1的标准曲线。

试剂：偏磷酸，DTT，N-乙基马来酰亚胺，正磷酸，α,α′-双吡啶，α,α′-双吡啶

4.2GSH和GSSG含量根据Griffith（1985）Smith（1985）的方法测定。1ml上清液加入0.5M磷酸缓冲液 1.5ml中和（pH7.5），随后加入50μl的H2O。上述溶液用来测定总谷胱甘肽（GSH+GSSG）的含量。另取1ml上清液，加入0.5M磷酸缓冲液1.5ml中和（pH7.5），并加入2-乙烯吡啶50μl，以掩盖GSH，然后将试管中的溶液混匀，直到形成乳浊液。将试管于室温下温育60min。上述溶液用来测定GSSG的含量。GSH含量即是总谷胱甘肽含量与GSSG之差。测定GSH含量的反应混合液含0.2mMNADPH，100ml磷酸缓冲液(pH7.5)，5mMEDTA,0.6mMDTNB，3单位的GR。加入0.1ml上清液后反应开始。其反应速率可以通过测量反应混合液在412nm处的吸光度1min内的变化来进行检测。绘制0-100μgGSHml－1的标准曲线。

试剂：2-乙烯吡啶，GR

5测定脂质过氧化作用

一般通过硫代巴比妥酸反应测定的MDA量来确定脂质过氧化作用的程度。MDA含量按照Dhindsa，Plumb-Dhindsa和Thorpe（1981）方法测定。取0.4g叶片（f.wt）加6ml的1%TCA 搅匀。匀浆以10000g/min离心10min。取1ml上清液加入20%TCA4ml，其中包括0.5%硫代巴比妥酸。混合液在此95℃加热30min，在一冰盒中迅速冷却。试管以10000g/min离心10min，然后测定上清液在532nm处的吸光度，并从中减去其在600nm非特异性吸光度。MDA含量的计算是通过其消光系数为155mM－1cm－1来计算的（Heath和Packer,1968）。

试剂：TCA，硫代巴比妥酸

6测定色素含量