流式细胞术培训PPT.ppt
合集下载
《流式细胞术的原理》PPT课件
光学系统
电子系统
流式细胞仪的工作原理
散射光信号
前向角散射光〔FSC，Forward Scatter〕： 细胞相对大小及其外表积 侧向角散射光〔SSC，Side Scatter〕： 细胞颗粒度及细胞核相对复杂性
散射光信号
荧光信号
特异荧光信号
背景信号
荧光素
•什么是荧光及荧光素？ •某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射 光波长长的光线-即荧光。而这些受激发后能产生荧光的物质称 为荧光素。 •什么是荧光发生机理？ •室温下的荧光素分子大局部处于稳定的“基态〞。当荧光素在 激发光的照射下吸收足够的光能后，跃迁到新的状态，即“激发 态〞。处于激发态的荧光分子极不稳定，它可以通过极短时间
•液流驱动系统
Fluorescence signals
Focused laser beam
鞘液三大作用： 防止堵塞喷孔 约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度 保持细胞活性
液流系统
对灵敏度要求不是很苛刻的实验，可调高样本进样速率，从而 提高采样分析速度。
光学系统
主要由激发光源、光束成形及收集系统组成
荧光染料的选择
1，首先，了解目标抗原 1〕细胞外表抗原 2〕细胞内或是核内抗原〔固定、透膜步骤〕 3〕以上两者兼备。先标记外表抗原，固定后，破膜标记 胞内抗原。 4〕细胞内细胞因子的测定。使用细胞内蛋白分泌抑制剂， 如monensin、BFA，使得细胞因子不能分泌到细胞外。 〔活化、固定、透膜〕
《流式细胞术的原理》 PPT课件
本课件PPT仅供大家学习使用 学习完请自行删除，谢谢！ 本课件PPT仅供大家学习使用 学习完请自行删除，谢谢！ 本课件PPT仅供大家学习使用 学习完请自行删除，谢谢！ 本课件PPT仅供大家学习使用 学习完请自行删除，谢谢！
流式细胞术原理及应用新课件PPT全
流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 HLA-B27: 强直性脊柱炎 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
Flow Sorting 直方图适用于：单参数分析
SORTING（细胞分选） CD16+56 NK细胞 可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
巨血小板
• 细胞凋亡与坏死的区别 一般只测一个参数、不能分选
5、DNA含量分析法（晚晚期）
2F时LO必W需C停Y用TO免M疫E抑TR制Y剂。虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但
凋亡检测
每一步都有检测它试剂盒们的过程与表现却有很大差别。
光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合
坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理 流式细胞分析在人类基因组计划中发挥了重要作用，流式细胞技术的应用也适用于植物，目前这个技术应用范围包括流式核型分析，
目前，该技术以广泛用于生物及医 学基础研究与临床检测，在分子生物学、 免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领 域内发挥着重要作用。
流式细胞仪
荧光显微镜
Flow Cytometry
控制 一般只测一个参数、不能分选
电脑
人脑
其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。
可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
• 空白对照：ALL 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。
随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展，随着人们创新意识的加强，结合计算机技术和其他技术，流式细胞仪的 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。
流式细胞术 ppt课件
制备(如染色)无关。
✓前向角散射(FS)反映被测细胞的大小，它由 正对着流动室的光电二极管装置，接收并 转变为电信号。
✓侧向角散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细 胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状， 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为 电信号，这些电信号存储在流式细胞仪的 计算机硬盘或软盘内。
➢荧光信号也有两种：
✓一种是细胞自发荧光，它一般很微弱。
✓一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克 隆抗体染色后，经激光激发发出的荧光， 它是我们要测定的荧光，荧光信号较强。
✓这两种荧光信号的同时存在是我们测定时 需要设定阴性对照的理由，以便从测出的 荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特 异结合产生的荧光。
(1)单参数数据显示和分析
➢ 细胞的每一个单参数测 量数据用直方图来显示
➢ 横坐标表示散射光或荧 光信号相对强度值，其 单位是道数，可以是线 性的，也可以是对数的
➢ 纵坐标表示细胞数。
(2)双参数数据显示和分析：
➢细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系 用一维直方图、二维点阵图、假三维地形 图、等高线图和密度图显示和分析。
✓流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、 250μm等多种，供检测者选择。小型仪器一 般固定装置了一定孔径的流动室。
➢流动室里的鞘液流一般是稳定流动，控制鞘 液流的装置是在流体力学理论的指导下由一 系列压力系统、压力感受器组成。
➢调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕 样品流并使样品流保持在液流的轴线方向， 能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相 等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。Fra bibliotek等高线图
分别是测定细胞的两种荧光双参数数据，横坐标 和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定 “十字门”就可得到两种荧光的各种测定值，密 度图和等高线图较点阵图更直观。
✓前向角散射(FS)反映被测细胞的大小，它由 正对着流动室的光电二极管装置，接收并 转变为电信号。
✓侧向角散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细 胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状， 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为 电信号，这些电信号存储在流式细胞仪的 计算机硬盘或软盘内。
➢荧光信号也有两种：
✓一种是细胞自发荧光，它一般很微弱。
✓一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克 隆抗体染色后，经激光激发发出的荧光， 它是我们要测定的荧光，荧光信号较强。
✓这两种荧光信号的同时存在是我们测定时 需要设定阴性对照的理由，以便从测出的 荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特 异结合产生的荧光。
(1)单参数数据显示和分析
➢ 细胞的每一个单参数测 量数据用直方图来显示
➢ 横坐标表示散射光或荧 光信号相对强度值，其 单位是道数，可以是线 性的，也可以是对数的
➢ 纵坐标表示细胞数。
(2)双参数数据显示和分析：
➢细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系 用一维直方图、二维点阵图、假三维地形 图、等高线图和密度图显示和分析。
✓流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、 250μm等多种，供检测者选择。小型仪器一 般固定装置了一定孔径的流动室。
➢流动室里的鞘液流一般是稳定流动，控制鞘 液流的装置是在流体力学理论的指导下由一 系列压力系统、压力感受器组成。
➢调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕 样品流并使样品流保持在液流的轴线方向， 能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相 等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。Fra bibliotek等高线图
分别是测定细胞的两种荧光双参数数据，横坐标 和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定 “十字门”就可得到两种荧光的各种测定值，密 度图和等高线图较点阵图更直观。
《流式细胞技术》PPT课件
完整版ppt
34
CBA(Cytometric Bead Array)
完整版ppt
35
Traditional Analysis -- Percent positive
Po s i t i v e Ce l l
Ne g a ti v e Ce l l
CDX PE
TraditionalAnalysis— PercentPositives
43
3）DNA倍体：主要比较G0/G1期细胞DNA含量 的变化。用DNA指数（DI）表示。
DNA指数=测量样本G0/G1期DNA含量/正常人 淋巴细胞G0/G1期DNA含量
以正常人淋巴细胞作为对照。
正常细胞DNA指数为1.00，DNA指数＞1，为超 2倍体，＜1为亚2倍体，两者可统称为非整倍 体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体 肿瘤中出现频率较高。
完整版ppt
42
2）利用DNA的荧光染料，如PI （Propidium iodide碘化丙啶），与细胞 内的DNA结合，可反映细胞内DNA含量。 采用DNA直方图显示。具有2C DNA含量 细胞为G0/G1期细胞，4C DNA含量细胞 为G2/M期细胞，DNA含量介于两者之间 的细胞为S期细胞。
完整版ppt
完整版ppt
作者：笛风
1
基本概念
1、流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物 理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗 技术为一体的高科技细胞分析仪。
2、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞 仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参 数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分 析和分选（纯度可达99%以上）的技术。
140
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
29
四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
33
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
流式细胞术基本原理(完整)PPT参考幻灯片
流式细胞术的基本原理
1
流式细胞术（flow cytometer，FCM）：
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态 中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参 数、快速的定性、定量分析或分选的技术。
2
流式细胞仪：是集现代物理电子技术、激光
技术、光电测量技术、计算机技术以及细 胞荧光化学技术、单克隆抗体技术于一体 的先进科学技术设备
34Leabharlann 流式细胞仪分为四部分：1）流动室与液流系统 2）光源与光学系统 3）信号收集、转换与分析系统 4）细胞分选系统
5
1）流动室与液流系统
6
2）光源与光学系统
激光（单色性、单向性） 前向散射（FSC）
侧向散射（SSC）
7
激发波长 发射波长
8
3）信号收集、转换与分析系统
• 激发波长经过滤光片分离不同波长的光信 号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT 将光信号转换成电信号，电信号输入到放 大器放大。
11
流式细胞术的对照设置
阴性对照：调节荧光探测器合适的放大倍 数，将仪器归零，确定样本的基础荧光域 值
阳性对照：检测抗体是否有问题或确定实 验方法的稳定性、准确性
空白对照：不标记，自发荧光 PS：补偿对照：多色分析样本时为荧光光谱
重叠进行的的补偿调节
12
4）细胞分选系统
• 根据某参数决定细胞液滴是否被分选，然 后由充电电路对其充电，带电液滴通过静 电场发生偏转而分离
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
FALS Sensor Fluorescence detector
+
1
流式细胞术（flow cytometer，FCM）：
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态 中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参 数、快速的定性、定量分析或分选的技术。
2
流式细胞仪：是集现代物理电子技术、激光
技术、光电测量技术、计算机技术以及细 胞荧光化学技术、单克隆抗体技术于一体 的先进科学技术设备
34Leabharlann 流式细胞仪分为四部分：1）流动室与液流系统 2）光源与光学系统 3）信号收集、转换与分析系统 4）细胞分选系统
5
1）流动室与液流系统
6
2）光源与光学系统
激光（单色性、单向性） 前向散射（FSC）
侧向散射（SSC）
7
激发波长 发射波长
8
3）信号收集、转换与分析系统
• 激发波长经过滤光片分离不同波长的光信 号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT 将光信号转换成电信号，电信号输入到放 大器放大。
11
流式细胞术的对照设置
阴性对照：调节荧光探测器合适的放大倍 数，将仪器归零，确定样本的基础荧光域 值
阳性对照：检测抗体是否有问题或确定实 验方法的稳定性、准确性
空白对照：不标记，自发荧光 PS：补偿对照：多色分析样本时为荧光光谱
重叠进行的的补偿调节
12
4）细胞分选系统
• 根据某参数决定细胞液滴是否被分选，然 后由充电电路对其充电，带电液滴通过静 电场发生偏转而分离
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
FALS Sensor Fluorescence detector
+
流式细胞术原理及应用 ppt课件
• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
19
常用荧光素
ppt课件
20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
ppt课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
ppt课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
ppt课件
21
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
19
常用荧光素
ppt课件
20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
ppt课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
ppt课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
ppt课件
21
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
流式细胞术的基本原理及其应用ppt课件
4
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
13
流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
2
目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
13
流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
2
目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。
流式细胞术课件
抗体使用原则
Ø 根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光 抗体
Ø 低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素， 如PE、APC
Ø 使用双标以上抗体必做荧光补偿
几种常见的荧光染料
细 胞 悬 液
激光
FITC 异硫氰酸荧光素
Texas red 得州红
PE.PC.APC 藻胆蛋白类 PEcy5 能量传递复合染料
原理：细胞在有丝分裂的过程中 DNA 会加倍。 （n----2n）
以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。 首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞 （G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的 细胞又有 G1 期，S 期,G2 期和 M 期。
Flow cytometry of cell cycle
线粒体功能的变化
TMP会在凋亡中产生，可以通过一些标记用流 式细胞仪检测。使用有膜穿透性的亲脂性阳离 子荧光染料，如Rh123, DiOC6, JC-1,CMXRos 等，可作为流式检测的探针。
当细胞发生凋亡时，一个线粒体膜表面蛋白— —7A6抗原会出现
Bcl-2/bax family of proteins.
酸化的检测同样可以用对pH敏感的荧光探针，如 DCH, BCECF, BCECF-AM, SNAFLs, SNARFs等进行检测
Flow cytometry of apoptotic cell death
Phospholipid redistribution
第七节 细胞周期的检测
Flow cytometry of cell cycle
光 强
Ø便于数据统计
度
Ø不同的细胞群可
以用不同的色标
记
Ø主要表达方式
绿色荧光强度
流式细胞术ppt课件
可区分高FL细胞与低FL细胞。 一般的流式细胞仪装有一个激光光源（488nm），可
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
《流式细胞仪》PPT教学培训模板
液柱与水平方向的入射激光束垂直相交，相交点称为测量 区。通过测量区的细胞受激光照射后发出荧光，同时产生 光散射。这些信号分别被成90℃角方向放置的光电倍增荧 光检测器和前向角放置的光电二极管检测器接收，经过转 换器转换为电子信号。
电子信号经模/数转换输入计算机。计算机通过相应的软件
储存、计算、分析，就可以得到细胞的大小和活性、核酸
流1
式4
I 流式细胞仪的基本原理
细
胞
仪
免疫荧光染色常用方法：
直接免疫荧光法：用一种（单色）或者多种（多色）荧 光素标记的McAb染色细胞后测量其荧光强度和阳性细胞 数。
间接免疫荧光法：用一种McAb与细胞作用后，洗去未结 合McAb，再加入荧光素标记的第二抗体（如羊抗鼠IgGFITC），染色细胞后测量其荧光强度及阳性细胞数。
法的增加，新的荧光染料和细胞标记物的出
现，使流式细胞仪的应用范围逐渐扩大。
20世纪90年代，与之配套的标本制备仪和自 动进样器的问世，以及适合临床应用的单克 隆抗体的增加，使流式细胞仪逐渐从科研单 位进入医院的中心实验室和检验科，成为现 代化的临床检验仪器的一部分。
流7
式
流 式 细 胞 仪--发展历史
生的荧光信号越强。
流2
式7
I I 流式细胞仪的基本结构（1）
细
胞
仪
激光（Laser）光源
激光的特性 良好的单色性 单向性 发散角小
流2
式8
I I 流式细胞仪的基本结构（２）
细
胞
仪
液流系统
液流系统是样品和鞘液（生理盐水或磷酸盐缓 冲液）进入、流动、排出的通道。由氮气加压 系统、鞘流瓶、样品管、流动室、喷嘴等组成。 在高压氮的压力下，样品液进入样品管，在流 动室与鞘液相混，以样品流居中、鞘液流包绕 的流束形式到达经特殊设计的喷嘴，并以稳流 的形式喷出，在喷嘴附近的测量区被测量后， 形成液滴，进入分选器，未被分选的细胞和鞘 液排入废液槽。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（2）DNA含量检测
高精确性—以及极小的 仪器误差（CV）！
BD FASCalibur
• 质量控制：
变异系数（CV）：流式细胞仪的“分辨率”。
Tip：获取高质量数据的关键在于获得小的CV值。
（3）用流式细胞仪发现的侧群细胞（SP Cell）
(4)染色体核型
Hoechst 33258 AT
2
1
细胞膜：表面糖分子、细 胞膜流动性和通透性、膜 融合和翻转、膜脂质构成、 细胞膜及线粒体膜电位 等。
、
细胞质：（1）Ca2+、 Na+、K+、H+ （2）信 号网络蛋白、各种抗 原、各类酶分子、细 胞骨架蛋白、荧光蛋 白（3）酶活、蛋白磷 酸化、乙酰化、甲基 化修饰等
无需染色：大小，颗粒度，自发荧光，色素，绝对计数等
（2）测量对象：颗粒尺度
（单细胞悬浮液）
当前流式细胞仪可测量颗粒大小 最小约0.2μm
电镜
光学 显微镜
人眼极限
0.1nm 1nm 10nm
100nm
1μm
10μm
100μm
1mm
原子氨基蛋白 病毒 支原体 细菌 酸质
红细胞 上皮细胞 植物细胞
（3）可测量的细胞参数
核酸分析： DNA、 RNA含量，DNA合 成、降解、断裂， 区分核酸单、双 链，测量端粒长 度、染色质结 构 、碱基构成。 染色单体分选。
• 经验性总结：细胞内几乎所有能够被荧 光染料标记的成分或某种变化都可以用 流式细胞仪进行检测。
流式细胞仪原理简要
一.流体动力学聚焦
流动室
流体动力学聚焦
流速：10m/s 最大40m/s——高通量 20,000—200,000 cell/S
激光聚焦
流体动力学聚焦的效果是，位于液流轴线上的细胞 被依次排列成一条单细胞的队列，沿着一条极为精 确而稳定的轨道运动。
（5）各色荧光信号分离
激光束
侧向散射光， 荧光
细胞
二色反光镜
1
2
3
前向 散射 光
收集透镜
带通滤光片 光电倍增管
多通道（多参数）
另一个参数：时间—连续 过程的检测
多激光激发：多通道（多参数）—6杆激光，17个荧光通道
（6）更先进的光信号收集和分离方式
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ八角反射式 信号收集系统
提高的灵敏度— (二色反光镜)反射~透 射:95%~80%
流式细胞术的功能特点与应用
（3）流式细胞仪的功能特点
多通道（多参数） 高通量 高灵敏度 定量 高精确度 细胞分选
二.流式细胞术的应用
（1） 几个著名的实际应用： ◇ HIV感染与病程动态监测：辅助T淋巴细胞的绝对计数； ◇ 癌症动态及治疗方案：细胞DNA含量和增殖活性； ◇ 器官移植： ◇ 动物育种的性别选择：分选含x或y染色体的精子； ◇ 人类体外受精； ◇ 造血干细胞和其他一大类干细胞各个分化层次鉴别； ◇ 海洋、环境微生物研究，发现未知种属。
二.荧光检测
（1）空间立体激发结构
三轴垂直：高 精确度—2%的 荧光差别
探测光路聚焦
（2）散射光信号的产生
前向散射光：大小 侧向散射光：颗粒度
（3）PMT：光信号到电脉冲信号
高灵敏度 —50MESF
FL-H FL-A
FL-W
面积（A）：荧光总量 高度（H）：最大荧光强度 宽度（W）：细胞直径
（4）光学镜片
4
3
5 6 X 13 8
1/3
7 recip 9-22
Y 18 21 20
14 9-12
15 16 17
19 Ph 22
Chromomycin A3 GC
制备和设计流式样本
实验流程
制取单细胞悬浮液 荧光染色 上机检测
机械破碎，酶解消化，化 学解聚—去除碎步与团块
细胞吸收的荧光染料与其目 标分子含量成正比，荧光信 号强度与吸收的荧光染料分 子成正比
仪器校准和优化
数据分析
结合生理现象分析数 据
荧光染色设计的几个原则
• 了解仪器的激光/滤光片的组合 • 匹配荧光亮度与最低密度的目标分子 • 了解所用荧光染料的激发和发射谱 • 减小荧光光谱重叠 • 使用多杆激光，但需避免多重激发 • 小心使用组合染料（tandem dyes） • 设定合适的对照样本（调节荧光补偿
的样本）
（1）荧光补偿
发射光谱重叠带来干扰， 需要将其进行补偿
CD45 FITC (log)
R1=单核细胞 (CD14+ve) R2=淋巴细胞 (CD45>单核细胞) R3=粒细胞 (CD45<单核细胞)
前向散射光 (linear)
CD14 PE CD14 PE
一维图：直方图
对比：
双参数的二维图 能提供更多信息
细 胞
数
CD45 FITC CD45 FITC
细胞数
2）CD45以不同的密度存在于所有白细胞表面。 （淋巴细胞>单核细胞>粒细胞） 荧光染料：fluorescein isothiocyanate (FITC).
• 信号收集：FSC，SSC，PE/FITC双荧光信号。 • 细胞数：10，000。
二维图：散点图
CD14 PE (log) 侧向散射光(linear)
二.细胞分选原理
●高通量 ●高纯度：可达99.9% ●可分选极少含量的细胞 ●多种分选方式
FACSVantage Diva 的模拟四路分选。
四.实例与数据分析
（1）红细胞裂解后的外周血细胞检测
• 成分：样本中的细胞有单核细胞，淋巴细胞，粒细胞 • 染色：单克隆抗体标记
1）CD14存在于单核细胞表面。 荧光染料： Phycoerythrin（PE）
目录
• （一）.流式细胞术的功能特点与应用 一.流式细胞仪的功能特点 二.流式细胞术的应用
• （二）.流式细胞仪原理简要 一.流体动力学聚焦 二.荧光光信号检测 三.细胞分选 四.实例及数据分析
• （三）.制备和设计流式样本 一.样本制备和实验流程 二.设计荧光染料组合的几个注意事项
• （四）.流式细胞术的新发展
流式细胞术培训
科技文献数量增长的一个简单统计
美国国立生物技术信息中心 / PUBMED 查询：检索关键词： flow cytometry 结果：
1980.1以前： 142 1980.1—1990.1: 9450 1990.1—2000.1: 33459. 2000.1—2005.1: 28850 2005.1—2009.4.15: 29495