从鸡蛋清中提取溶菌酶 讲义PPT课件
鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定2012课件
一旦我单位在贵局承办的“海峡两岸 渔业资 源增殖 放流活 动”放 流苗种 招标中 中标， 我单位 将严格 按照招 标方案 的要求 和合同 的约定 执行
我国的食品工业、精细化工业、医药工业对溶菌酶 具有较大的需求。我国于上世纪70年代采用离子交 换法生产溶菌酶。 目前国内有大连生化、天津东原、烟台金梓等厂家 生产，初步满足了国内科研及医药工业的需求。 进口溶菌酶，存在着价格较高，进口环节复杂等诸 多方面的限制。 国产溶菌酶工业刚刚起步，生产规模小，工业水平 落后，产品的质量与国际标准差距较大。存在提取 率低，处理量小和产品比活低等缺点。
一旦我单位在贵局承办的“海峡两岸 渔业资 源增殖 放流活 动”放 流苗种 招标中 中标， 我单位 将严格 按照招 标方案 的要求 和合同 的约定 执行
4.1 直接结晶法
优点： 操作简单，原料便宜，设备投资小。最早应用于蛋清溶菌酶的工业生 产，使产品的成本大大降低，为其医药应用作出了贡献。 缺点： （1）生产周期长。 （2）由于蛋白质在其等电点不稳定，因此生产过程中溶菌酶易失活。 （3）由于存在溶解平衡，而使不少溶菌酶残留于母液。因此不能用 以分离微量的溶菌酶。 （4）收率低，活性低。 （5）处理后的蛋清难以再利用。此点导致溶菌酶成本大幅上升。
一旦我单位在贵局承办的“海峡两岸 渔业资 源增殖 放流活 动”放 流苗种 招标中 中标， 我单位 将严格 按照招 标方案 的要求 和合同 的约定 执行
2.2 酶工程上的应用 近年来，溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少 的工具酶，用以提取菌体内的活性物质如核酸、酶及 活性多肽等。
一旦我单位在贵局承办的“海峡两岸 渔业资 源增殖 放流活 动”放 流苗种 招标中 中标， 我单位 将严格 按照招 标方案 的要求 和合同 的约定 执行
溶菌酶PPT课件
.
9
1.3 植物溶菌酶：目前已从木瓜、无花果、芜菁、大麦等植物中分 离出溶菌酶，其分子量较大，约为24000～29100。植物溶菌酶对 溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但对胶体状甲壳 质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。 1.4 微生物产生的溶菌酶：人们从60年代开始，发现微生物也能产
丙酮
(6) 溶菌酶标准品；Sephadex G50 ⑺ N-乙酰葡萄糖胺；硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌； 氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸
⑻ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂；蛋白含量测定 （福林法）试剂
⑼ 聚乙二醇-20000、两性电解质
.
14
【实验操作】
1.蛋清的制备
将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清
生溶菌酶，并且进展很快。目前微生物产生的溶菌酶大体上分以下 5种：（1）内N-乙酰已糖胺酶，此酶同于鸡蛋清溶菌酶，破坏细菌 细胞壁肽聚糖中的β-1，4糖苷键。（2）酰胺酶，切断细菌细胞壁 肽聚糖中NAM与肽“尾”之间的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸键。（3） 内肽酶，使肽“尾”及肽“桥”内的肽键断裂。（4）β-1，3、β-1， 6葡聚糖酶和甘露聚糖酶，此酶分解酵母细胞的细胞壁。（5）壳多 糖酶，这是分解霉菌细胞壁一种溶菌酶。
流出（鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟，
使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带
溶菌酶
• 组员.刘英炜，甘文圣 ，牛根坡，石方.
.
1
一·溶菌酶定义：溶菌酶（lysozyme） 又称 胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚 糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏 多糖的碱性酶。
实验3 溶菌酶分离提纯
（一）分离提纯
【目的和要求】 目的和要求】
1.了解并掌握从鸡蛋清中粗制备溶菌酶的原理及方法。 了解并掌握从鸡蛋清中粗制备溶菌酶的原理及方法。 了解并掌握从鸡蛋清中粗制备溶菌酶的原理及方法 2.了解并掌握离子交换层析法分离提纯蛋白质的一般 了解并掌握离子交换层析法分离提纯蛋白质的一般 原理和操作方法。 原理和操作方法。
【实验方法】 实验方法】
1．取20ml ddH2O，用醋酸调pH值为 ，水浴加热 ℃。 ． 值为3.5，水浴加热85℃ ，用醋酸调 值为 加入10ml新鲜蛋清，在搅拌条件下加热 分钟。 新鲜蛋清， 分钟。 加入 新鲜蛋清 在搅拌条件下加热5分钟 2．将所得液体10000g 离心 ．将所得液体 离心10min，收集上清液，由此得到 ，收集上清液， 溶菌酶粗提液。 溶菌酶粗提液。 3．装柱：取聚丙烯层析柱（1ml），关闭层析柱出口。自 ．装柱：取聚丙烯层析柱（ ），关闭层析柱出口 ），关闭层析柱出口。 顶部徐徐加入2ml CM Sepharose FF悬浮液，待凝胶颗粒沉降 悬浮液， 顶部徐徐加入 悬浮液 放出过量的溶液。 倍柱床体积） 柱床， 后，放出过量的溶液。用ddH2O（5-8倍柱床体积）冲洗柱床， （ 倍柱床体积 冲洗柱床 去除乙醇。冲洗完毕，关闭柱子出口， 去除乙醇。冲洗完毕，关闭柱子出口，保持液面高出凝胶表面 1cm。 。
【实验原理】 实验原理】
【实验原理】 实验原理】
1. 溶菌酶的粗提 鸡蛋清液
酸性条件， 酸性条件，85℃
溶菌酶带正电荷，与酸根负离子生成可溶性盐 溶菌酶带正电荷，与酸根负离子生成可溶性盐 溶菌酶耐热性较高 溶菌酶耐热性较高，而其它杂蛋白在高温下变性沉淀 耐热性较高，
离心
使溶菌酶与其他蛋白质分开， 使溶菌酶与其他蛋白质分开，得到溶菌酶的粗提液
鸡蛋清中溶菌酶的提取与抑菌作用4
4
2
3
10 0
5
3
4
10 5
6
1 3 4 溶菌酶提取率测定 用万分之一电子天平称取冷冻干燥后溶菌酶
晶体质量, 减去作为晶种加入的溶菌酶质量, 除 以蛋清液体积。 1 3 5 溶菌酶对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的抑 制作用 [ 7 - 8 ]
采用滤纸片法。用打孔器打出直径 5mm 滤纸 圆片, 高压灭菌。分别吸取 0 1mL 大肠杆菌与金 黄色葡萄球菌菌悬液加在已倒好的牛肉膏蛋白胨 平板培养基表面, 涂布均匀。用无菌镊子夹取已 在溶菌酶溶液中浸渍 30m in滤纸片, 放到上述含 菌平皿上, 每皿三片, 于 37 恒温培养 24h 后取 出, 量取 抑菌圈 直径, 取其 平均 值作 为实 验结 果。
固定蒸馏水添加量为蛋清体积的 2倍, 氯化 钠加入量为蛋清溶液的 5% , 在 4 下静置 1w 结 晶, 分 别 调 节 酶 液 pH 为 8 5、 9、 9 5、 10、 10 5, 测得溶菌酶粗提取率的结果见图 2。由图 2 可见, 酶液 pH 可选 9 5、 10 0、 10 5 作为正 交 试验的条件。
过滤并混匀, 按蛋清体积加入蒸馏水, 轻轻搅拌 5m in, 使蛋清溶液的稠度均匀。之后向蛋清溶液 中缓慢加入氯化钠细粉并轻轻搅拌。加完氯化钠 后, 再用氢氧化钠溶液调节 pH, 加入定量标准溶 菌酶结晶作为晶种。 4 下静置。待结晶完全后, 用布氏漏斗 滤出结 晶, 即得到 粗制 的溶 菌酶 晶 体。
在单因子试验的基础上, 选用 L9 ( 33 ) 正交 表, 进行正交试验, 优化溶菌酶粗提取的工艺参 数表。因素水平见表。
表 1 盐析法提取蛋清酶溶菌酶的因素水平表 L9 ( 33 )
水平
蒸馏水添加量 (倍 ) ( 因素 A )
溶菌酶提取
溶菌酶提取第一篇：溶菌酶提取方法对比讲稿用 2.1 结晶法溶菌酶具有耐热、耐酸的特性，并且易溶解在盐溶液，稳定性好，通过改变盐溶液的条件，可使溶菌酶以晶体形式析出而得以分离，结晶法也因此成为制备溶菌酶晶体最为传统的方法之一。
该方法的主要过程可简述如下，向富含溶菌酶的蛋清中加入(NH4)2SO4等中性盐，依据溶菌酶的等电点区，用氢氧化钠调节蛋清溶液的 pH，再加入溶菌酶晶体进行诱导，4℃放置大概 2 周，即可析出大部分的溶菌酶晶体，而与其它杂蛋白质得以分离。
如要得到到更高纯度的溶菌酶，可将析出的溶菌酶晶体过滤，重新溶解，再利用上述同样的方法进行重结晶即可。
结晶法操作简单、成本低，是目前从蛋清中提取分离溶菌酶的首选方法，但它要求溶菌酶的含量要相对高，因此不适宜溶液中微量溶菌酶的分离。
此外，晶体的形成，蛋白质结晶既受到自身分子结构的影响，又受到结晶条件的影响，结晶过程中只要有细微的差别，晶体的产量和质量都将受到很大影响（结晶过程不好控制），所以蛋白质结晶是一个宏观看似简单而实际微观极为复杂的物理化学过程。
为进一步完善结晶法分离纯化溶菌酶，研发人员越来越重视膜结晶法的研究与应用。
相比于常规结晶方法，膜结晶法对蛋白质初始浓度要求低、结晶诱导时间较短、尤其是结晶过程可控，因而具有明显优势。
2.2 离子交换法离子交换法是借助溶液中各种蛋白质等粒子的带电差异，而与离子交换剂之间具有强弱不一的结合力，达到分离纯化物质的操作技术。
依据原料及分离纯化的不同要求，可分别选择羧甲基琼脂糖、羧酸纤维素和羧甲基纤维素等离子交换剂。
离子交换法操作简单，成本较低，可实现自动化连续操作，适用于大规模生产，是目前溶菌酶生产的常用方法。
（联用层析法因分离速度快、处理量大等优势而受到研发人员的广泛关注，包括膜亲和层析法、离子交换层析法等。
尤其是离子交换层析法 20 世纪 80 年代便开始广泛应用于溶菌酶地分离纯化。
此方法操作简便、成本低、高效、可实现自动化操作，是溶菌酶生产中的常用方法之一。
南师大蛋清中提取溶菌酶实验
蛋清中提取溶菌酶南京师范大学生命科学学院姓名：穆旭学号：09130333摘要：本实验通过离子交换层析提取蛋清中的溶菌酶，掌握静态和动态离子交换的方法；和从生物材料中提取活性蛋白质方法，并用超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶，掌握超滤分离技术的原理和操作。
并且用SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量，从而掌握SDS－PAGE的原理和操作。
关键词：溶菌酶，柱层析，离子交换树脂，超滤，盐析，SDS-PAGE研究材料与实验方法1.柱层析前的准备工作实验材料：树脂：724型阳离子交换树脂、层析柱：φ1.6cm×30cm、溶液：0.1M NaOH，0.1M HCl、其他材料：布氏漏斗，抽滤瓶，铁架台，恒流泵，核酸蛋白检测仪等。
1.1预处理724型阳离子交换树脂碱－酸－碱的方法（Na型），每次用0.1N NaOH或者0.1N HCl溶液（体积约为树脂的2—3倍）浸泡树脂10—15min后，都要用蒸馏水将碱液、酸液冲洗掉。
1.2装填离子交换层析柱（重力沉降法）固定层析柱，保持层析柱垂直；将蒸馏水倒入层析柱中，以排出管道中的空气，当蒸馏水高度约为层析柱高的一半时，将层析柱下端的塑料管夹紧；用玻璃棒将树脂搅拌均匀，倒入层析柱内，松开下端的塑料管，树脂自然沉降，最后保持蒸馏水面高于树脂表面约2cm。
1.3配制0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0先配制 1M Na2HPO4 57.7mL，1M NaH2PO4 42.3mL将两者混合后稀释至1000mL，装于试剂瓶中。
1.4平衡离子交换树脂0.1M磷酸钠缓冲液恒速缓慢流经树脂，直至流出液的pH值与缓冲液相同，平衡结束。
2.柱层析法提取溶菌酶实验材料：起始缓冲液：0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0）洗脱液：50mM NaCl溶液200mL（溶剂：起始缓冲液）、500mM NaCl溶液150mL （溶剂：起始缓冲液）再生溶液：0.5M NaOH溶液仪器：磁力搅拌器等其他材料：新鲜鸡蛋2.1样品的预处理取2个新鲜鸡蛋，在其一端敲一个小洞，收集蛋清，加入约其体积1.5倍的起始缓冲液，搅拌均匀，用4层纱布过滤除去不溶性物质，检查其pH值是否为7.0，否则用0.5M酸、碱调节。
鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化
四、实验材料和方法
四、实验材料和方法
1、实验材料：新鲜鸡蛋、磷酸缓冲液（PBS）、乙酸乙酯、正丁醇、蛋白酶 抑制剂、透析袋。
四、实验材料和方法
2、实验设备：高速离心机、真空泵、氮气仪、色谱柱。 3、实验方法： （1）鸡蛋卵清的收集：将新鲜鸡蛋打破，分离出卵黄和卵清， 收集卵清备用。 （2）粗提：将收集的卵清加入磷酸缓冲液（PBS），搅拌均匀 后进行高速离心，取上清液即为粗提液。 （3）沉淀：向粗提液中加入等体积的 乙酸乙酯，充分混合后静置分层，取下层沉淀。 （4）
鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与 纯化
目录
01 一、背景介绍
03 三、实验原理
02 二、研究目的 04 四、实验分析
07 参考内容
06 六、结论与展望
一、背景介绍
一、背景介绍
溶菌酶是一种广泛存在于生物体内的天然抗菌酶，具有抗菌、抗炎、抗病毒 等多种生物活性。近年来，随着人们对食品安全和药物研发的度不断提高，从天 然生物资源中提取和纯化溶菌酶成为了一个热门领域。鸡蛋卵清作为一种丰富的 天然资源，具有较高的溶菌酶含量，因此成为了提取和纯化溶菌酶的重要来源。 本次演示旨在探讨鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化方法，以期为相关领域的研究 提供参考。
四、实验材料和方法
复溶：将沉淀物真空干燥后，加入适量正丁醇溶解，再加入透析袋中透析去 除小分子杂质。 （5）色谱分离：将透析后的溶液通过色谱柱进行分离，收集流 出液，检测其中溶菌酶的纯度和含量。 （6）鉴定：采用光谱分析、分子量测定 等方法对纯化的溶菌酶进行鉴定。
五、实验结果及分析
五、实验结果及分析
二、研究方法与技术
1、材料与设备
1、材料与设备
本研究采用新鲜鸡蛋作为原料，使用离心机、分光光度计、电泳仪等设备进 行实验。
鸡蛋中溶菌酶的提取
鸡蛋中溶菌酶的提取This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020鸡蛋中溶菌酶的提取，纯化及纯度鉴定李莹姝蒋华云*（南京师范大学生命科学学院，南京 210046）摘要：从蛋清中用724弱酸性阳离子交换树脂提取溶菌酶，然后用硫酸铵溶液洗脱，盐析得到溶菌酶。
用葡聚糖凝胶层析（SephadexG-75）纯化溶菌酶，收集峰值处样品。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳鉴定个步骤留样及所得溶菌酶样品的纯度。
溶菌酶得率为100ml（kg）；葡聚糖凝胶层析过程纯化样品得到了洗脱峰曲线，但未能收集到峰值处样品；电泳结果显示在纯化过程中溶菌酶纯度不断升高。
本实验溶菌酶得率较低，提取工艺有待改进，需进一步减少样品损失；层析过程需进一步熟练掌握，以更好达到纯化效果。
关键词：溶菌酶；离子交换树脂，凝胶层析；SDS-PAGEExtraction, purification and purity of Egg lysozymeYings LiHuay Jiang*(College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China) Abstract:From egg white, with 724 weak acid cation exchange resin extraction of lysozyme, and then eluted with ammonium sulfate, salting to be lysozyme. With dextran gel chromatography (SephadexG-75) purified lysozyme, the peak of the sample collection. By SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) electrophoresis and identified steps to stay kind of purity of the samples from lysozyme. Lysozyme yield 100ml kg); dextran gel chromatography purified samples obtained during elution peak curve, but failed to collect samples at the peak; electrophoresis showed that the purification process of lysozyme enzyme purity rising. In this study, lysozyme was the low rate of extraction process could be improved, the need to further reduce sample losses; chromatography process needs further proficiency in order to better achieve purification.Key words:lysozyme, Ion exchange resin, Gel chromatography, SDS-PAGE 溶菌酶( Lysozyme , 1,4－β－N－溶菌酶) 是一种专门作用于革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4- 糖苷键的水解酶, 因而又称为胞壁质酶或者N- 胞壁质聚糖水解酶。
鸡蛋溶菌酶提取
鸡蛋溶菌酶提取溶菌酶（又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶）是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
性质：白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。
稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃， pH值为3条件下，15min后活力保持87%。
抑制剂有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。
1%水溶液在281.5nm 处的吸光系数为26.4。
通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌作用：溶菌酶的用途极为广泛，在医药上，可与血液中的病毒结合，阻止流感、腺病毒等的繁殖；能分解粘多糖，有利于脓汁、痰液的排出；能清除坏死组织、增进抗生素的药效以及促进肠道有益细菌如乳酸菌的繁殖等作用；另外，它与抗生素联合应用还可治疗支气管炎、肺炎、白喉、小儿急性肾炎等多种疾病。
在食品上，卵清溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解，而对其他物质无反应，人们利用它来代替有害健康的化学防腐剂（如苯甲酸及其钠盐），以达到保存食物的目的，是一种天然防腐剂；溶菌酶添加于牛乳，可使牛乳人乳化，提高了牛乳的营养价值。
提取工艺：（一）鸡蛋清中提取溶菌酶方法一——食盐盐析一．材料：原料：鸡蛋、NaOH、NaCl、丙酮、（市售溶菌酶粉剂）仪器与设备：搅拌器（200-300r/min）,离心机（4000r/min），抽滤机二．工艺流程：原料→ 清洗→ 去蛋壳→ 分离蛋清→ 搅拌→ 过滤→ 加盐→ 调节pH值→ 结晶→ 干燥→ 成品→ 包装三．实验步骤：1选择新鲜鸡蛋，蛋清的pH值不能低于8.0，否则不能用。
从蛋清蛋壳中提取溶菌酶的关键技术
从蛋清蛋壳中提取溶菌酶的关键技术2010-03-01 点击数：327华南理工大学食品学院郑建仙鸡蛋清中溶菌酶的含量约为3.5％，是提取溶菌酶的方便来源。
但不同产地的鸡蛋，其蛋清中溶菌酶的含量有所不同。
工业上多采用直接结晶法、亲和色谱法、离子交换法、超滤和亲和色谱联合使用法等方法生产溶菌酶。
●直接结晶法在鸡蛋清中加入5%的NaCl，调节pH到10左右，加入溶菌酶晶种，在0℃—5℃静置结晶，分离蛋清，得到结晶物，经纯化后再进行重结晶。
●离子交换法溶菌酶是一种阳离子型蛋白质。
它由阴离子交换树脂吸附，使其从蛋清中分离出来，然后用0.3mol/L以上食盐水洗脱树脂，洗脱液经透析、超滤、冷冻干燥便得粉状产品。
●亲和色谱法利用酶与底物专一性结合形成复合物的特点，以羧甲基甲壳素（CM-CH）为底物专一性结合溶菌酶，然后用水和稀醋酸洗脱，洗脱液经透析、超滤、喷雾干燥或真空干燥便得粉状产品。
利用亲和沉淀从蛋清中分离溶菌酶也是溶菌酶制备研究的一个热点。
Stermberg等1974年报道了应用聚丙烯酸（PAA）形成PAA-溶菌酶聚电解质复合物。
Chern等于1996年应用pH敏感的亚微粒丙烯酸胶浆以及Eudragit L100作为溶菌酶的沉淀剂。
最近Vaigya等报道采用N-异聚丙烯酰胺与酸性单体的共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶，得到90％的收率。
他们认为使用共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶比使用pH敏感聚合物具有更多的优点，因为后者通常只有较低的得率。
●其他方法用水或稀酸将鸡蛋清稀释2.5—10倍，调整液体pH至2.5—7.0，在此弱酸性水溶液中加入少量钙并加热，使溶菌酶以外的蛋白质大部分凝固，从分离出的上清液和凝固物的洗净液中提取溶菌酶。
Owen等1997年报道，使用连续逆流、膨胀床吸附系统分离溶菌酶，该技术克服了一般填充床柱层析的一些存在问题，诸如填充材料的压实、沟槽的形成和由于上样溶液微粒引起的柱阻塞等。
Ghosh等报道，采用小型的中空纤维超率系统从蛋清干粉中分离溶菌酶。
鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤
从鸡蛋中提取溶菌酶的步骤1.鸡蛋清样品制备及粗分离将4～5 个（为一个小组，同时两个小组共同进行试验）新鲜鸡蛋打入烧杯然后用矿泉水瓶子吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH 值不得小于8.0），量其体积（量筒50ml），加入两倍蛋清体积的（可用双蒸水替代）去离子水，边加边缓慢搅拌，拌匀后用两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，然后用1 mol ／L 的HCl 溶液调pH 值至7.0 左右，再用脱脂棉过滤收集滤液。
2. 724 弱酸性阳离子交换树脂的再生及层析1.吸附：将处理好的蛋清约200 mL，加入32 g再生的724 树脂中，缓慢搅拌吸附6 h。
2.洗涤、洗脱：待分层后，将蛋清液倒去，用去离子水反复冲洗，以去除杂蛋白，滤干树脂，用等体积的0.15mol ／L pH 值为6．5 的磷酸缓冲液洗涤，加入等量的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min，使溶菌酶从树脂上洗脱下来，收集洗脱液，4℃冰箱静置过夜。
第二天，有白色沉淀析出，离心（15 min，10 000r ／min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品浓缩1·透析除盐、去碱性蛋白：4℃条件下，用去离子水透析24 h 左右（1天）直到透析完全（用BaCl2与透析液发生反应直到没有浑浊产生为止）。
离心去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加入1 mol ／L 氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH 值上升至8．0～9．0，如有白色沉淀，即离心去除；（碱性蛋白在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀）2·聚乙二醇浓缩：盐析物用1 倍去离子水溶解成稀糊状，装入透析袋，在装有聚乙二醇的试管中吸水浓缩，收集浓缩液；3·冷冻干燥：用3 mol ／L 盐酸调pH值至5．0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。
溶菌酶纯度检测SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法①凝胶板的制备：用30％分离胶贮液、pH 值为8.9 分离胶缓冲液、10％浓缩胶贮液、pH 值为6.7浓缩胶缓冲液、10％SDS、1％TEMED、重蒸馏水、10％APS 溶液配制而成；②溶菌酶的处理：用磷酸缓冲液制成50 μg ／mL 的溶液，取10~80 μL 点样于凝胶板上③电泳：电流为10 mA，时间4 h；④固定、染色和脱色：电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，分别在固定液与染色液中浸泡10～30 min，用水漂洗干净，再用脱色液脱色。
蛋清提取溶菌酶技术
（+）加入氯化钠 按每 $,, (- 蛋清溶液加入 +. 氯 化 钠 的 比 例 ，白 蛋 清 溶 液 中 慢 慢 加 入 氯 化 钠 细 粉 ， 边 加 边 搅 拌 ，促 使 氯 化 钠 细 粉 及 时 溶 解 ，以 避 免 局 部 浓度过高或沉淀于容器底部，否则会引起蛋白质的 变性而产生大量的白色沉 !—乙酰胞壁质聚糖 水 解 酶 ，是 一 种 国 内 外 很 紧 销 的 生 化 物 质 ，广 泛 应 用 于 医 学 临 床 。具 有 多 种 药 理 作 用 ，能 抗 感 染 、消 炎 、消 肿 、增 强 体 内 免 疫 反 应 等 ，有 抗 菌 的 作 用 ，常 用 于 五 官 科 多 种 粘 膜 炎 症 ，皮 肤 带 状 疮 疹 等 疾 病 。是 优 良 的 天 然 防 腐 剂 ，可 用 于 食 品 的 防 腐 保 鲜 。尤 其 重 要 的 是 近年来溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少 的 工 具 酶 。随 着 生 物 工 程 的 发 展 ，提 取 溶 菌 酶 具 有 重 要的战略意义。
溶菌酶PPT幻灯片
（7）在功能性食品中的应用
溶菌酶是一种无毒、无害的高盐基蛋白质， 且具有一定的保健作用，有抗感染和增强抗 生素作用效力，促进血液凝固及止血作用， 有组织再生作用。因此，可以在保健食品中 添加一定量以提高保健效果。
36
注意
酶的专一性：对于 酵母、霉菌、G-引 起的腐败变质效果 不理想。
酶的稳定性与有效 期。
37
医学上应用
一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。 有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加
快组织恢复功能等作用。 临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口
腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。 也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病
毒感染。 口服和肌注均有效。
38
口服，3～5片/次(肠溶片含10mg)，3次/ 日。口含，1片/次(口含片含20mg)，4～ 6次/日。
外用：以1%～2%溶液滴注、涂擦或直 接喷粉。
肌注，50mg～100mg/次，1～2次/日。 滴眼：用2%溶液。
39
副作用
偶有较轻的过敏反应。 氯化溶菌酶医疗效果更广，有浓痰分散、
出血抑制、组织修复、消炎镇痛、抗过 滤性病毒等作用； 用氯化溶菌酶的制药有消炎消痔、治感 冒、皮肤病及眼、鼻、喉等用药.
8
溶菌酶的功能图示
LZM
肽链中Glu35和Asp52所构成的活性中心
9
专一地作用于细菌细胞壁肽多糖分子中NAM与 NAG之间的β-1,4键，从而催化细菌细胞壁中的 肽多糖水解，破坏细菌的细胞壁，使细菌溶解死 亡
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与
DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失
24
四、溶菌酶的应用过程中体现的 优点
（1）溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性。 蛋清溶菌酶是已知的最耐热的酶；
实验3 溶菌酶分离提纯
（一）分离提纯
【目的和要求】 目的和要求】
1.了解并掌握从鸡蛋清中粗制备溶菌酶的原理及方法。 了解并掌握从鸡蛋清中粗制备溶菌酶的原理及方法。 了解并掌握从鸡蛋清中粗制备溶菌酶的原理及方法 2.了解并掌握离子交换层析法分离提纯蛋白质的一般 了解并掌握离子交换层析法分离提纯蛋白质的一般 原理和操作方法。 原理和操作方法。
【实验方法】 实验方法】
4．加样：将5-10ml蛋白粗提液沿管壁缓缓加入 ．加样： 蛋白粗提液沿管壁缓缓加入CM Sepharose 蛋白粗提液沿管壁缓缓加入 FF层析柱中，注意不要冲乱凝胶表层。 层析柱中， 层析柱中 注意不要冲乱凝胶表层。 5．洗脱： ．洗脱： 冲洗层析柱（ 倍柱床体积）， 用ddH2O冲洗层析柱（约10倍柱床体积），以除去杂蛋白。 冲洗层析柱 倍柱床体积），以除去杂蛋白。 在白凹瓷板上，用考马斯亮蓝G-250检测杂蛋白的洗脱情况， 检测杂蛋白的洗脱情况， 在白凹瓷板上，用考马斯亮蓝 检测杂蛋白的洗脱情况 至颜色不再变蓝。之后， 洗脱溶菌酶， 至颜色不再变蓝。之后，用0.5 M NaCl洗脱溶菌酶，用Ep管收 洗脱溶菌酶 管收 集洗脱液, 至少接3tube。用考马斯亮蓝 检查洗脱情况。 集洗脱液 至少接 。用考马斯亮蓝G-250检查洗脱情况。 检查洗脱情况 6. 保存 将收集得到的溶菌酶样品放 ℃冰箱保存备用。 保存: 将收集得到的溶菌酶样品放-80℃冰箱保存备用。
【思考题】 思考题】
1. 离子交换层析法分离纯化蛋白质具有哪些优缺点？ 离子交换层析法分离纯化蛋白质具有哪些优缺点？ 2. 概述蛋白质分离提纯的基本原理和一般流程。 概述蛋白质分离提纯的基本原理和一般流程。
【实验原理】 实验原理】
2. 溶菌酶的纯Βιβλιοθήκη ——离子交换层析法 离子交换层析法