姜四倍体离体诱导及其形态学分析
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保卫细胞叶绿体数测定 : 取二倍体和四倍体植株的全展叶片下表皮 , 加一小滴 1 % I - K I溶 液染色 , 加盖玻片 , 叶绿体呈黑色 , 在油镜 ( ×1 000 ) 下观察气孔保卫细胞 (两个 ) 内的叶绿
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
关键词 : 姜 ; 离体培养 ; 多倍体 ; 形态学 中图分类号 : S63215 文献标识码 : A 文章编号 : 1000 26346 ( 2010) 04 20041 206
Tetraplo id of Z in g ibe r off ic ina le Roscoe1 in V itro Inducem en t and Its M or2 phology Ana lysis
© 1994-2010 China Academic Journal ElectroBaidu Nhomakorabeaic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
42
中 国 蔬 菜 CH INA VEGETABLES
2010年 2月 (下 )
一些研究者认为染色体的易位和倒位可能是姜表现高度不育的原因 , 提出能否采用诱导基因 突变和 染 色 体 加 倍 等 育 种 方 法 , 以 获 得 一 些 种 性 较 好 的 新 品 种 ( R am achand ran, 19 69 , 1 982; A dan iya & Shoda, 199 8 ) 。其中多倍 体 育 种 是 蔬 菜 优 质 高 产 育 种 的 重 要 途 径 之 一 。对 于姜多倍体诱导的研究报道较 少 , 最 早 是 R am achand ran ( 1982 ) 报 道 用 0125 %秋 水 仙 素 活 体诱导出了姜四倍体 , 但诱导率极低 , 仅为 414 % 。A dan iya和 Sh ira i ( 200 1 ) 利用秋水 仙素 处理初生芽的方法 , 进行了姜四倍体的离体诱导 , 并对诱导出的姜四倍体花粉的可育性和萌 发力进行了初步研究 。郭启高等 ( 200 0 ) 对姜四倍体诱导方法进行了 初步 研究 。但 对于 离体 诱导的姜四倍体在形态学 、细胞学等方面的系 统研 究鲜 有 报 道 。本 试 验 通 过 组 织 培 养 及 秋 水 仙素诱导技术进行姜多倍体诱导的系统研究 , 以期获得稳定的四倍体株系 , 从而为良种选育 提供可行的方法和理论依据 。
2010 (4)
王志敏等 : 姜四倍体离体诱导及其形态学分析
43
体 , 随机统计 30个保卫细胞的叶绿体数 , 求其平均值 。 11214 数据分析 试验数据采用 D PS统计软件以 D uncanπs新复极差法进行多重比较 。
2 结果与分析
211 四倍体的诱导 浸泡处理是秋水仙素对外植体作用最为直接的一种方法 , 丛生芽浸泡在不同浓度的秋水仙
中国蔬菜 2010 (4) : 41 - 46 CH INA VEGETABLES
姜四倍体离体诱导及其形态学分析
王志敏 牛 义 宋 明 3 汤青林
(西南大学园艺园林学院 , 重庆市蔬菜学重点实验室 , 重庆 400716)
摘 要 : 以丛生芽为材料 , 在离体培养条件下比较了秋水仙素不同浓度 、不同处理时间诱导姜体细胞染 色体加倍的效果 。结果表明 : 以 0120 %秋水仙素液体培养基处理 8 d的诱导效果最好 , 诱变率和成活率分别 达到了 42186 %和 70100 % 。根尖染色体压片检查发现 , 四倍体染色体数为 2n = 4x = 44, 二倍体对照为 2n = 2x = 22。四倍体与二倍体相比表现出植株高大 , 茎秆变粗 , 叶片长 、宽 、厚均增大 , 叶片下表皮气孔密度减 小 , 气孔和保卫细胞增大 , 保卫细胞内叶绿体数增加等特征 , 其中气孔密度及保卫细胞内的叶绿体数可作为 鉴别四倍体与二倍体的重要性状 。
收稿日期 : 2009 209 218; 接受日期 : 2009 210 221 基金项目 : 西南大学博士基金项目 (20710904) 作者简介 : 王志敏 , 博士 , 副教授 , 专业方向 : 蔬菜遗传育种与生物技术 , E2mail: m inzniwang_ 555@1631com
3 通讯作者 (Corresponding author) : 宋明 , 教授 , 硕士生导师 , 专业方向 : 蔬菜遗传育种与生物技术 , E2mail: swauso2 ngm @ yahoo1com1cn
Abstract: Tak ing clu ste ring ginge r ( Z ing iber officina le Ro scoe1 ) shoo t as m aterials, we comp ared the doub ling effects of its som a tic cell ch romo som e unde r in vitro cu ltivation cond ition and w ith d ifferen t co lch ic ine s concen tra tion and d iffe ren t treating tim e p eriod. The resu lts showed that the inducem en t effec t was the be st, when shoo ts were trea ted in liqu id cu ltu re m ed ium of 012 % co lch ic ine s concen tra2 tion fo r 8 days. The inducem en t and su rvival rate were 42186 % and 70100 % , resp ective ly. The ch romo som e num ber of tetrap lo id was 2 n = 4 x = 44 , wh ile that of the con tro l d ip lo id was 2 n = 2 x = 22. Comp ared w ith d ip lo id, tetrap lo id showed characteristic s of ta ller p lan t he igh t, th icker stem , la rge r, b roader and th icker leaf b lade, fewer stom ata p er un it area, larger stom ata, and mo re ch lo rop lasts in stom a ta gua rd cell. The stom ata den sity and ch lo rop last num ber in gua rd cells cou ld be impo rtan t charac2 te ristics d istingu ish ing tetrap lo id from d ip lo id.
染色体计数方法 : 在无菌条件下切取生长旺盛的根尖 015 ～110 cm 长 →对二氯苯饱和溶液预 处理 315～410 h→蒸馏水清洗 →卡诺氏固定液 (无水乙醇 ∶冰醋酸 = 3 ∶1) 在 4 ℃条件下固定 24 h→蒸馏水清洗 →1 mol·L - 1盐酸溶液 60 ℃水浴条件下解离 15 ～20 m in→蒸馏水清洗 →在载玻片 上切取根尖分生组织 (前端乳白色部位 ) →改良卡宝品红染色 →用尖头镊子夹碎根尖 →压片后用 铅笔敲散细胞团 →镜检 →摄像 。 11213 四倍体与二倍体植株形态与气孔特征比较 对组培苗期 (移出试管 7 ～15 d) 、旺盛生长 时期 (从三股杈至收获 ) 的姜四倍体及二倍体植株的株高 、茎粗 、叶片长和宽以及叶片厚等形态 指标进行测定比较 , 其中叶片的长 、宽和株高用直尺或盒尺测量 , 叶片厚和茎粗用游标卡尺测量 , 每个样品测量 10株 。
Key words: Z ing iber officina le Ro scoe1; In vitro; Po lyp lo id; Mo rp ho logy
姜 ( Z ing iber off icina le Ro scoe1 ) 古名薑 , 别名生姜 、黄姜 , 为姜科姜 属 多 年 生 草 本 植 物 , 因长期无性繁殖 , 导致种 质 退 化 、产 量 降 低 , 严 重 制 约 了 姜 的 生 产 和 发 展 (金 波 , 1997 ) 。
素液体培养基中的处理情况见表 1。随着秋水仙素浓度升高和处理时间延长 , 丛生芽成活率和 增殖率呈下降趋势 。从诱变效果看 , 0101 % ～0120 %的秋水仙素对姜丛生芽生长点的诱导均 有效果 , 当秋水仙素浓度为 0101 % 、 0105 % 、 0110 %时 , 随着处理时间的延长 , 丛生芽诱变 率增高 ; 浓度为 0120 %时 , 随着处理时间的延长 , 诱变率呈现先增后减的趋势 , 在处理 8、 12 d时诱变率都极显著高于其他处理 , 且两处理在成活率上表现出极显著差异 。综合考虑 24 个处 理组合 , 以 0120 %秋仙水素液体培养基处理 8 d的效果最好 , 诱变率和成活率分别达到了 42186 %和 7010 % 。
1 材料与方法
试验于 2007年 3月 ～2009年 2月在西南大学进行 。 111 试验材料
以重庆本地红爪姜 (由重庆市蔬菜学重点实验室提供 ) 离体诱导的丛生芽的茎尖为试材 。 112 试验方法 11211 四倍体的诱导 采用液体培养方式 , 将在固体培养基上生长旺盛的姜丛生芽块 (含 5 ～ 6 个芽 ) 转接到 M S + 6 - BA 310 m g·L - 1 + NAA 011 m g·L - 1 +蔗 糖 30 g·L - 1 、 pH 值 518 ～ 610, 且分别添加不同浓度 ( 0101 %、0105 %、0110 %、0120 % ) 秋水仙素的液体增殖培养 基 (每瓶 35 ～40 mL ) 中 , 黑暗 培 养 , 每 天 早 晚 各 轻 轻 摇 动 培 养 基 1 次 。分 别 处 理 2、 4、 6、 8、 12、 16 d后取出 , 在无菌条件下用无菌水冲洗 3 ～4 次 , 然后用无菌滤纸吸干表面水分 , 接 种到不含秋水仙素的 M S + 6 - BA 310 m g·L - 1 + NAA 011 m g·L - 1 +蔗糖 30 g·L - 1 +卡拉胶 7 g·L - 1 、 pH 值 518 ～610 的固体增殖培养基上 , 培养 1 个月后统计丛生芽块的成活率 、增殖等 情况 。 11212 四倍体的鉴定 采用观察诱导处理后再生植株的形态特征及根尖细胞染色体计数相结合的 方法 , 判断植株的倍性 。
气孔特征观察 : 分别取姜四倍体和二倍体组培苗及定植苗的全展叶片 , 用尖嘴镊子撕下表皮 , 置于载玻片上 , 加一小滴 1 % I - K I溶液染色 , 盖上盖玻片 , 在目镜带测微尺的普通显微镜下随 机测量 10个气孔以及保卫细胞的长度与宽度 ( ×400 ) , 取 3 个视野测定气孔密度 ( ×150 ) , 并 在 O lympus显微镜下摄像 , 每个样品测定 3片叶 , 每片叶 3次重复 。
WAN G Zhi2m in, N IU Yi, SON G M ing3 , TAN G Q ing2lin
( College of Horticu ltu re and L andscape A rch itectu re, S ou thw est U n iversity, Key L ab in O lericu ltu re of Chongqing, Chongqing 400716, Ch ina)
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
关键词 : 姜 ; 离体培养 ; 多倍体 ; 形态学 中图分类号 : S63215 文献标识码 : A 文章编号 : 1000 26346 ( 2010) 04 20041 206
Tetraplo id of Z in g ibe r off ic ina le Roscoe1 in V itro Inducem en t and Its M or2 phology Ana lysis
© 1994-2010 China Academic Journal ElectroBaidu Nhomakorabeaic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
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中 国 蔬 菜 CH INA VEGETABLES
2010年 2月 (下 )
一些研究者认为染色体的易位和倒位可能是姜表现高度不育的原因 , 提出能否采用诱导基因 突变和 染 色 体 加 倍 等 育 种 方 法 , 以 获 得 一 些 种 性 较 好 的 新 品 种 ( R am achand ran, 19 69 , 1 982; A dan iya & Shoda, 199 8 ) 。其中多倍 体 育 种 是 蔬 菜 优 质 高 产 育 种 的 重 要 途 径 之 一 。对 于姜多倍体诱导的研究报道较 少 , 最 早 是 R am achand ran ( 1982 ) 报 道 用 0125 %秋 水 仙 素 活 体诱导出了姜四倍体 , 但诱导率极低 , 仅为 414 % 。A dan iya和 Sh ira i ( 200 1 ) 利用秋水 仙素 处理初生芽的方法 , 进行了姜四倍体的离体诱导 , 并对诱导出的姜四倍体花粉的可育性和萌 发力进行了初步研究 。郭启高等 ( 200 0 ) 对姜四倍体诱导方法进行了 初步 研究 。但 对于 离体 诱导的姜四倍体在形态学 、细胞学等方面的系 统研 究鲜 有 报 道 。本 试 验 通 过 组 织 培 养 及 秋 水 仙素诱导技术进行姜多倍体诱导的系统研究 , 以期获得稳定的四倍体株系 , 从而为良种选育 提供可行的方法和理论依据 。
2010 (4)
王志敏等 : 姜四倍体离体诱导及其形态学分析
43
体 , 随机统计 30个保卫细胞的叶绿体数 , 求其平均值 。 11214 数据分析 试验数据采用 D PS统计软件以 D uncanπs新复极差法进行多重比较 。
2 结果与分析
211 四倍体的诱导 浸泡处理是秋水仙素对外植体作用最为直接的一种方法 , 丛生芽浸泡在不同浓度的秋水仙
中国蔬菜 2010 (4) : 41 - 46 CH INA VEGETABLES
姜四倍体离体诱导及其形态学分析
王志敏 牛 义 宋 明 3 汤青林
(西南大学园艺园林学院 , 重庆市蔬菜学重点实验室 , 重庆 400716)
摘 要 : 以丛生芽为材料 , 在离体培养条件下比较了秋水仙素不同浓度 、不同处理时间诱导姜体细胞染 色体加倍的效果 。结果表明 : 以 0120 %秋水仙素液体培养基处理 8 d的诱导效果最好 , 诱变率和成活率分别 达到了 42186 %和 70100 % 。根尖染色体压片检查发现 , 四倍体染色体数为 2n = 4x = 44, 二倍体对照为 2n = 2x = 22。四倍体与二倍体相比表现出植株高大 , 茎秆变粗 , 叶片长 、宽 、厚均增大 , 叶片下表皮气孔密度减 小 , 气孔和保卫细胞增大 , 保卫细胞内叶绿体数增加等特征 , 其中气孔密度及保卫细胞内的叶绿体数可作为 鉴别四倍体与二倍体的重要性状 。
收稿日期 : 2009 209 218; 接受日期 : 2009 210 221 基金项目 : 西南大学博士基金项目 (20710904) 作者简介 : 王志敏 , 博士 , 副教授 , 专业方向 : 蔬菜遗传育种与生物技术 , E2mail: m inzniwang_ 555@1631com
3 通讯作者 (Corresponding author) : 宋明 , 教授 , 硕士生导师 , 专业方向 : 蔬菜遗传育种与生物技术 , E2mail: swauso2 ngm @ yahoo1com1cn
Abstract: Tak ing clu ste ring ginge r ( Z ing iber officina le Ro scoe1 ) shoo t as m aterials, we comp ared the doub ling effects of its som a tic cell ch romo som e unde r in vitro cu ltivation cond ition and w ith d ifferen t co lch ic ine s concen tra tion and d iffe ren t treating tim e p eriod. The resu lts showed that the inducem en t effec t was the be st, when shoo ts were trea ted in liqu id cu ltu re m ed ium of 012 % co lch ic ine s concen tra2 tion fo r 8 days. The inducem en t and su rvival rate were 42186 % and 70100 % , resp ective ly. The ch romo som e num ber of tetrap lo id was 2 n = 4 x = 44 , wh ile that of the con tro l d ip lo id was 2 n = 2 x = 22. Comp ared w ith d ip lo id, tetrap lo id showed characteristic s of ta ller p lan t he igh t, th icker stem , la rge r, b roader and th icker leaf b lade, fewer stom ata p er un it area, larger stom ata, and mo re ch lo rop lasts in stom a ta gua rd cell. The stom ata den sity and ch lo rop last num ber in gua rd cells cou ld be impo rtan t charac2 te ristics d istingu ish ing tetrap lo id from d ip lo id.
染色体计数方法 : 在无菌条件下切取生长旺盛的根尖 015 ～110 cm 长 →对二氯苯饱和溶液预 处理 315～410 h→蒸馏水清洗 →卡诺氏固定液 (无水乙醇 ∶冰醋酸 = 3 ∶1) 在 4 ℃条件下固定 24 h→蒸馏水清洗 →1 mol·L - 1盐酸溶液 60 ℃水浴条件下解离 15 ～20 m in→蒸馏水清洗 →在载玻片 上切取根尖分生组织 (前端乳白色部位 ) →改良卡宝品红染色 →用尖头镊子夹碎根尖 →压片后用 铅笔敲散细胞团 →镜检 →摄像 。 11213 四倍体与二倍体植株形态与气孔特征比较 对组培苗期 (移出试管 7 ～15 d) 、旺盛生长 时期 (从三股杈至收获 ) 的姜四倍体及二倍体植株的株高 、茎粗 、叶片长和宽以及叶片厚等形态 指标进行测定比较 , 其中叶片的长 、宽和株高用直尺或盒尺测量 , 叶片厚和茎粗用游标卡尺测量 , 每个样品测量 10株 。
Key words: Z ing iber officina le Ro scoe1; In vitro; Po lyp lo id; Mo rp ho logy
姜 ( Z ing iber off icina le Ro scoe1 ) 古名薑 , 别名生姜 、黄姜 , 为姜科姜 属 多 年 生 草 本 植 物 , 因长期无性繁殖 , 导致种 质 退 化 、产 量 降 低 , 严 重 制 约 了 姜 的 生 产 和 发 展 (金 波 , 1997 ) 。
素液体培养基中的处理情况见表 1。随着秋水仙素浓度升高和处理时间延长 , 丛生芽成活率和 增殖率呈下降趋势 。从诱变效果看 , 0101 % ～0120 %的秋水仙素对姜丛生芽生长点的诱导均 有效果 , 当秋水仙素浓度为 0101 % 、 0105 % 、 0110 %时 , 随着处理时间的延长 , 丛生芽诱变 率增高 ; 浓度为 0120 %时 , 随着处理时间的延长 , 诱变率呈现先增后减的趋势 , 在处理 8、 12 d时诱变率都极显著高于其他处理 , 且两处理在成活率上表现出极显著差异 。综合考虑 24 个处 理组合 , 以 0120 %秋仙水素液体培养基处理 8 d的效果最好 , 诱变率和成活率分别达到了 42186 %和 7010 % 。
1 材料与方法
试验于 2007年 3月 ～2009年 2月在西南大学进行 。 111 试验材料
以重庆本地红爪姜 (由重庆市蔬菜学重点实验室提供 ) 离体诱导的丛生芽的茎尖为试材 。 112 试验方法 11211 四倍体的诱导 采用液体培养方式 , 将在固体培养基上生长旺盛的姜丛生芽块 (含 5 ～ 6 个芽 ) 转接到 M S + 6 - BA 310 m g·L - 1 + NAA 011 m g·L - 1 +蔗 糖 30 g·L - 1 、 pH 值 518 ～ 610, 且分别添加不同浓度 ( 0101 %、0105 %、0110 %、0120 % ) 秋水仙素的液体增殖培养 基 (每瓶 35 ～40 mL ) 中 , 黑暗 培 养 , 每 天 早 晚 各 轻 轻 摇 动 培 养 基 1 次 。分 别 处 理 2、 4、 6、 8、 12、 16 d后取出 , 在无菌条件下用无菌水冲洗 3 ～4 次 , 然后用无菌滤纸吸干表面水分 , 接 种到不含秋水仙素的 M S + 6 - BA 310 m g·L - 1 + NAA 011 m g·L - 1 +蔗糖 30 g·L - 1 +卡拉胶 7 g·L - 1 、 pH 值 518 ～610 的固体增殖培养基上 , 培养 1 个月后统计丛生芽块的成活率 、增殖等 情况 。 11212 四倍体的鉴定 采用观察诱导处理后再生植株的形态特征及根尖细胞染色体计数相结合的 方法 , 判断植株的倍性 。
气孔特征观察 : 分别取姜四倍体和二倍体组培苗及定植苗的全展叶片 , 用尖嘴镊子撕下表皮 , 置于载玻片上 , 加一小滴 1 % I - K I溶液染色 , 盖上盖玻片 , 在目镜带测微尺的普通显微镜下随 机测量 10个气孔以及保卫细胞的长度与宽度 ( ×400 ) , 取 3 个视野测定气孔密度 ( ×150 ) , 并 在 O lympus显微镜下摄像 , 每个样品测定 3片叶 , 每片叶 3次重复 。
WAN G Zhi2m in, N IU Yi, SON G M ing3 , TAN G Q ing2lin
( College of Horticu ltu re and L andscape A rch itectu re, S ou thw est U n iversity, Key L ab in O lericu ltu re of Chongqing, Chongqing 400716, Ch ina)