可溶性蛋白的测定——李合生
可溶性蛋白质含量的测定
植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种酶的作用时常以比活(酶活力单位／毫克蛋白质，unIT／Mg ProTeIn)表示酶活力大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。
常用的测定方法有LoWry法和考马斯亮蓝G－250染色法，本实验将分别介绍这两种方法。
方法一：LoWry法(劳里法)【原理】LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(ＦolIn－酚)的结合与发展。
其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。
再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe ＆PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。
这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。
LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3～15倍，约是双缩脲法的100倍。
由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。
LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。
但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。
1.双缩脲法的原理双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。
因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。
双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。
且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10Mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约05Mg以上。
植物生理学实验课件9植物组织中可溶性蛋白的测定
可溶性蛋白质含量的计算
可溶性蛋白含量 (μg/g.FW)=标准曲线上查得的 蛋白质量（ μg ） × 提取液体积5/0.1
示意如下：
0.35
Y=-0.00381+0.032029*X 0.30 r=0.9992
0.25
Absorbance
0.20
植物组织中可溶性蛋白的测定
植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶 色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）
课上笔记
三个指标
– 蛋白质含量
考马斯亮蓝
– 新叶2份 – 老叶2份，一次次加 – 转移到1.5毫升 – 显色反应做2次，合计4次（调零磷酸+考马斯亮蓝
– MDA含量
沉重，磨好， 反求诸己
实验原理
in darkness at 30
No 3: 10ppm ABA 20 ml 提取
称叶龄差异明显的叶片各1.00g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol， pH值为7.8）及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，匀浆液以10 000g 离心力作用下（4度）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。
显色反应
可溶性蛋白测定：缓冲液提取后可溶性蛋白溶于 上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反 应呈蓝色。在595nm处有最大吸收峰。
实验步骤
制备匀浆
48小时前预处理:称取叶片三份,每份1g（最好打圆孔），30度恒 温箱放置。
No 1: water 20ml (control);
No 2: 10ppm BA 20 ml; ℃ 2d.
0.15
0.10
0.05
0.00 0
2 4 6 8 10
植物体内可溶性糖和可溶性蛋白含量的测定
植物体内可溶性糖和可溶性蛋白含量的测定摘要：目的通过标准曲线的绘制，测定白菜、芹菜、菠菜中可溶性蛋白和可溶性糖的含量，了解可溶性糖和可溶性蛋白的测定方法。
方法分别用蒽酮法和考马斯亮蓝染色法来测定植物体内可溶性糖和可溶性蛋白的含量。
结论关键词：白菜；芹菜；菠菜；可溶性蛋白含量；可溶性糖含量；蒽酮法；考马斯亮蓝染色法1 引言植物体内的可溶性糖和可溶性蛋白含量是重要的生理生化指标。
在作物的碳素营养中，作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。
它们在营养中的作用主要有：合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等；分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为NH 3 的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。
由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。
可溶性蛋白是植物体内氮素存在的主要形式，其含量的多少与植物的代谢和衰老有密切的关系，同时它与植物体维持渗透压抗脱水也有很大关系。
白菜是十字花科芸薹属叶用蔬菜，味道鲜美可口，营养丰富，素有“菜中之王”的美称，为广大群众所喜爱。
芹菜属伞形科植物，富含蛋白质、碳水化合物、胡萝卜素、B族维生素、钙、磷、铁、钠等，同时，具有有平肝清热，祛风利湿，清肠利便、润肺止咳、降低血压、健脑镇静的功效。
菠菜藜科一年生草本植物，菠菜含有丰富的维他命A、维他命C及矿物质，它对各种贫血症和糖尿病、肺结核、高血压、风火赤眼等诸多疾病可起辅助治疗作用。
2 材料与方法2.1 植物体内可溶性糖含量的测定2.1.1材料新鲜的白菜、芹菜、菠菜叶片（剪碎后各取0.5—1.0g）2.1.2试剂葡萄糖标准溶液（200ug/ml)、蒽酮试剂2.1.3仪器设备分光光度计；分析天平；恒温水浴；试管；三角瓶；移液管；剪刀；玻璃棒；滤纸；研钵2.1.4测定方法样品中可溶性糖的提取：称取剪碎混匀的新鲜样品0.5 ～1.0 g （或干样粉5～100 mg ），放入大试管中，加入15 ml 蒸馏水，在沸水浴中煮沸20 min，取出冷却，过滤入100 ml 容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。
可溶性蛋白质含量的测定
植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种酶的作用时常以比活(酶活力单位／毫克蛋白质，unIT／Mg ProTeIn)表示酶活力大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。
常用的测定方法有LoWry法和考马斯亮蓝G－250染色法，本实验将分别介绍这两种方法。
方法一：LoWry法(劳里法)【原理】LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(ＦolIn－酚)的结合与发展。
其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。
再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe ＆PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。
这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。
LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3～15倍，约是双缩脲法的100倍。
由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。
LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。
但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。
1.双缩脲法的原理双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。
因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。
双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。
且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10Mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约05Mg以上。
各种生化指标测定方法
2.3 各项指标的测定方法2.3.1 生物学指标的测定于芥蓝菜薹采收期，每处理随机抽取6株，测定芥蓝生物学性状指标，包括株高，薹粗，节数，单株产量和叶面积。
2.3.1.1 株高测定菜薹长度为第一片真叶基部至生长点的距离，取平均值。
2.3.1.2 薹粗测定用游标卡尺测量第5与第6片叶之间的粗度，取平均值。
2.3.1.3节数和节间长度测定节数为第一片真叶基部起至生长点的节数，节间长度=株高/节数2.3.1.4 单株产量测定取第4节位以上植株进行测定，求单株鲜重。
2.3.1.5 蜡粉含量的测定参照Kumar.S方法测定（Kumar S，1987）。
将芥蓝叶片剪成条状，称取1.0g，放于培养皿中，用10ml氯仿浸泡30秒，取出叶片立即烘干。
将培养皿在室温下蒸发干燥，蜡粉含量为培养皿增重（mg/g）。
重复三次。
2.3.2 光和系统指标的测定2.3.2.1 叶面积的测定取第5片及以上共6片叶进行测定，求单株总叶面积。
采用Li-COR 公司生产的Li-3000A 型叶面积仪测量叶面积。
用直尺测量芥蓝叶片的长度（L，叶柄基部到叶尖的距离）和宽度（W，与主脉垂直的最大宽度），用Li- COR公司的Li- 3000A型叶面积仪测量实际叶面积（LA）。
用回归的方法建立实际叶面积与芥蓝叶片长乘以宽面积之间的回归方程，找出最佳回归系数。
2.3.2.2 比叶重测定于各处理中随机取10片叶子，用0.8mm打孔器，在叶片最宽处离主脉两侧的中心位置打孔，将10个小圆片放在烘样盒后在105℃杀青10min，再80℃烘至恒重。
比叶重=总叶干重/总叶面积(g/m2)2.3.2.3 叶绿素含量测定采用95%乙醇浸泡法（李合生，2000），称取剪碎的新鲜样品0.1g放入试管，用95%的乙醇15ml，在黑暗条件下浸泡24h，至叶片表皮变白，取上清夜在波长665nm、649nm、470nm下测定吸光度。
计算公式：叶绿素a（mg/L）=13.95A665－6.88A649 （1）叶绿素b（mg/L）=24.96 A649－7.32A665 （2）类胡萝卜素（mg/L）=（1000A470-2.05C a－114.8C b）/245(1)、(2)相加即得叶绿素总浓度，在按照下式计算叶绿素和类胡萝卜素的含量。
植物可溶性蛋白的测定
植物组织可溶性蛋白质的测定-考马斯亮蓝G-250法更新时间2015-5-191、目的：测定植物组织的可溶性蛋白含量，测定范围为100-1000ug/ml，高浓度需要稀释后测定。
小分子蛋白和肽的测定需要用福林酚试剂。
2、提取：用测定SOD （0.05M pH7.8磷酸缓冲液）或者POD （0.1 mol / L 磷酸缓冲液 （pH6.0）的提取液或者用水提取均可，但混匀后要放置0.5-1小时再离心，以充分提取。
单独测定时，取样品5g，加水50ml，破碎，冷藏存储，测前10000rpm离心10分钟备用，取样0.1-0.2ml测定（如果加水比较少，计算时应考虑材料水分）。
3、测定：以提取液为对照，以牛血清标准蛋白为标准，以考马斯亮蓝G-250为显色剂，显色2-30分钟内，在595nm 比色。
4、计算：可溶性蛋白含量（ug/g鲜重）=测定含量（ug）*总提取体积ml/取样体积ml/鲜重g。
5、试剂配制：5.1、牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取0.100g牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg／mL的原液，此液不用时应冷藏保存，可用15天。
将1000μg／mL牛血清白蛋白用提取液稀释10倍，作为工作液，浓度为100μg／mL。
5.2、考马斯亮蓝G-250蛋白显色剂：称取0.050g考马斯亮蓝G-250，溶于25mL95％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸50mL，最后用蒸馏水定容到500mL。
此溶液在常温下可放置1个月。
标准曲线及样品配制表 蛋白含量（μg） 100μg/ml标准蛋白（μl） 提取液 （μl） 考马斯亮蓝G-250显色剂 （ml）0 0 10002.5 20 200 80040 400 600 60 600 400 80 800 200100 1000 0样品* X（一般叶片为1000） 1000-x*注1：样品量依据显色调整，生长旺盛期小麦叶片可溶性蛋白含量一般为1mg/g数量级。
(完整word版)可溶性蛋白质含量的测定
植物体内可溶性蛋白质含量的测定方法:考马斯亮蓝G－250染色法1.原理：考马斯亮蓝G－250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G－250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm,后者在595nm。
在一定蛋白质浓度范围内（1～100μg)，蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定.蛋白质与考马斯亮蓝G－250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。
该反应快速灵敏、易于操作、干扰物质少（考马斯亮蓝G－250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小,除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大)，可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。
但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。
2.仪器：721分光光度计;10ml量筒1个；研钵；烧杯；量瓶;移液管；1ml3支;5ml3支；10ml 具塞刻度试管14支。
3.试剂:90乙醇％(无水乙醇20瓶以下8元1瓶,每瓶500ml)；85%磷酸（500ml磷酸标准溶液0。
1mol/ml，16元钱1瓶)；考马斯亮蓝G－250（80元钱1瓶，1瓶10g）；牛血清白蛋白。
考马斯亮蓝G－250溶液：称取100μg考马斯亮蓝G－250,溶50ml90％乙醇，85%的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。
4。
标准曲线的绘制4.1、0～100μg/ml标准曲线的制作:取6支试管，按表1数据配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml.准确吸取所配各管溶液0。
1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G—250试剂，盖塞,反转混合数次，放置2min后,在595nm下比色，绘制标准曲线。
李合生. 植物生理生化实验原理和技术
李合生. 植物生理生化实验原理和技术李合生（1921～2012），中国植物生理生化学家，被誉为我国植物生理学的奠基人之一。
他的研究成果及其对中国植物生理学发展的贡献不仅在学术界享有盛誉，而且对农业生产的实际应用产生了重大影响。
李合生对植物生理生化实验的原理和技术进行了大量的研究和实践，为植物生理学研究方法的创新和发展作出了重要贡献。
以下是关于李合生. 植物生理生化实验原理和技术的一些介绍。
一、植物生理生化实验原理1. 实验的目的和问题：在进行植物生理生化实验时，首先需要明确实验的目的和解决的问题。
研究植物光合作用的效率提高的方法，研究植物对环境胁迫的响应机制等。
2. 实验的设计和控制：植物生理生化实验需要精确的实验设计和严格的实验控制，以确保实验结果的可靠性和准确性。
实验因素的选取和处理、实验材料的选择和处理、实验条件的控制等。
3. 实验的方案和方法：根据实验的目的和问题，确定合适的实验方案和方法。
测定植物光合作用的速率可以选择光合速率仪、测定植物叶片的光谱特性可以使用光谱仪等。
二、植物生理生化实验技术1. 光合作用的测定：光合作用是植物生命活动的基础，测定植物的光合作用对于研究植物生理生化过程至关重要。
李合生在光合作用的测定方面进行了大量的研究，并开发了一系列的测定技术和仪器。
2. 植物代谢产物的测定：植物代谢产物的测定可以揭示植物的生物化学过程和物质代谢机制。
李合生研究了植物合成蛋白质的方法和代谢产物，提出了一系列的测定技术和方法。
3. 植物生长调控的实验技术：植物生长调控是植物生理生化过程的核心之一，实验技术的发展为植物生长调控的研究提供了有力的支持。
李合生在植物生长调控的实验技术方面做出了重要的贡献。
三、植物生理生化实验的应用李合生的植物生理生化实验原理和技术的应用不仅限于学术研究领域，还广泛应用于农业生产、食品工业等实际生产领域。
1. 农业生产：通过植物生理生化实验原理和技术，可以揭示植物在不同环境条件下的生长规律和适应机制，为农业生产中的种植技术、育种方法等提供科学依据。
可溶性蛋白质含量
植物体内可溶性蛋白质含量的测定P127—130植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种酶的作用时常以比活（酶活力单位/毫克蛋白质，unit/mg protein）表示酶活力大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。
考马斯亮蓝G—250染色法原理：考马斯亮蓝G—250（Coomassie btilliant blue G—250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G—250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水微区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。
在一定蛋白质浓度范围内（1—100ug），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G—250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。
该反应快速灵敏、易于操作、干扰物质少（考马斯亮蓝G—250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大），可测微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。
但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。
仪器与用具分光光度计；10ml量筒；研钵；烧杯；量瓶；移液管；刻度试管试剂：标准蛋白质溶液：用牛血清蛋白配成蛋白质100ug/ml（0.1mg/ml）的标准蛋白溶液；90%乙醇；85%磷酸（W/V）考马斯亮蓝G—250溶液：称取100ug考马斯亮蓝G—250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放1个月。
方法：1. 标准曲线（蛋白质含量为0—100ug/ml）的绘制取6支具塞试管，按表30—1数据配制含0—100ug/ml的牛血清蛋白质液各1ml。
可溶性蛋白含量测定法
可溶性蛋白含量测定（考马斯亮蓝染色法）1. 试剂配制（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）磷酸，再用蒸馏水定容到1L。
在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。
90% 乙醇配制：95%乙醇和75%乙醇按3:1体积比混合配制，即95%乙醇，75%乙醇或取45ml 无水乙醇直接定容至50ml。
（2） 100 g/ml 牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取10mg BSA定容至100 ml即为100 g/ml。
或称取25 mg BSA加蒸馏水水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40 ml蒸馏水定容至100ml。
（3） mol/L，磷酸配制：A母液， mol/L磷酸氢二钠溶液：取Na2HPO412H2O (分子量 g，用蒸馏水定容至500 ml。
B母液， mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO42H2O (分子量 g，用蒸馏水定容到50 ml。
磷酸：分别取A母液，B母液，用蒸馏水定容至1000ml。
2. 标准曲线绘制取6支具塞试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂，5min 左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度，以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
试剂0号1号2号3号4号5号标准蛋白体积/ml蒸馏水体积/ml蛋白质含量/g020*********3. 样品测定（1）样品提取：取鲜样—，用蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min—4000r/min离心10min，上清液备用。
（2）吸取样品提取液（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复两次），加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min带反应完成，在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查蛋白质含量。
4. 蛋白质含量计算可溶性蛋白含量（mg/g）=(C VT)/1000VS（mg/g）C—查标准曲线值，g；VT—提取液总体积，ml；WF—样品鲜重，g；VS—测定时加样量，ml。
抗盐、抗寒试验测定方法
试验方法1.电解质外渗率(REC)测定参照电导率法[1]，将低温冷冻处理后的枝条剪成2mm的小段，然后称取2g 试样投入三角瓶，并加入50ml蒸馏水，浸泡24h后，测定浸出液的电导率(重复三次)。
然后放在水浴锅中煮沸1h，静止冷却后测定其电导度。
相对电解质渗出率Y(%)=初电导值/终电导值×100。
2.可溶性蛋白测定参照考马斯亮蓝G-250染色法[2]，称取0.1g枝条，加5ml蒸馏水研磨，洗液并入5ml离心管中，加盖。
在4000r.min-1离心10min，然后吸取上清液放入10ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。
取提取液1ml，加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，混合，放置2min。
以空白作参比，在595nm下比色，测定吸光度。
计算公式为：样品蛋白质的含量（mg.g-1）=C×VT/VS×FW×1000。
式中C为查标准曲线（µl）；VT为提取液总体积(ml)；VS为测定时加样量的体积（ml）FW为样品重量（g）。
3.可溶性糖测定参照蒽酮比色法[2]，称取0.1g枝条，加5ml蒸馏水，洗液并入25ml具塞试管中，加盖，于沸水中提取30min，提取液过滤入25ml容量瓶中，反复冲洗，定容至刻度。
吸取样品提取液0.5ml，加3ml蒸馏水，0.5ml蒽酮乙酸乙酯和5ml 浓硫酸充分振荡，放入沸水浴保温1min，自然冷却后，以空白作参比，在630nm 波长下比色，测定吸光度。
计算公式为：可溶性糖含量（%）=(C×V/a×n)/(W×106)×100。
式中C为标准方程求得糖量（µg）；a为吸取样品液体积（ml）；n为稀释倍数；V为提取液体积（ml）；Ｗ为样品重量（g）。
4.游离脯氨酸测定参照酸性茚三酮染色法[3]，准确称取0.3g剪碎的枝条，加入5ml3%磺基水杨酸溶液，在沸水中提取10min（提取过程中要经常摇动）。
可溶性蛋白含量测定法
可溶性蛋白含量测定（考马斯亮蓝染色法）1. 试剂配制（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）磷酸，再用蒸馏水定容到1L。
在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。
90% 乙醇配制：95%乙醇和75%乙醇按3:1体积比混合配制，即95%乙醇，75%乙醇或取45ml 无水乙醇直接定容至50ml。
（2） 100 g/ml 牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取10mg BSA定容至100 ml即为100 g/ml。
或称取25 mg BSA加蒸馏水水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40 ml蒸馏水定容至100ml。
（3） mol/L，磷酸配制：A母液， mol/L磷酸氢二钠溶液：取Na2HPO412H2O (分子量 g，用蒸馏水定容至500 ml。
B母液， mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO42H2O (分子量 g，用蒸馏水定容到50 ml。
磷酸：分别取A母液，B母液，用蒸馏水定容至1000ml。
2. 标准曲线绘制取6支具塞试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂，5min 左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度，以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
试剂0号1号2号3号4号5号标准蛋白体积/ml蒸馏水体积/ml蛋白质含量/g020*********3. 样品测定（1）样品提取：取鲜样—，用蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min—4000r/min离心10min，上清液备用。
（2）吸取样品提取液（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复两次），加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min带反应完成，在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查蛋白质含量。
4. 蛋白质含量计算可溶性蛋白含量（mg/g）=(C VT)/1000VS（mg/g）C—查标准曲线值，g；VT—提取液总体积，ml；WF—样品鲜重，g；VS—测定时加样量，ml。
实验七 植物组织中可溶性蛋白质
实验七植物组织中可溶性蛋白质、可溶性糖含量的测定I、植物组织中可溶性蛋白质的测定一、原理由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm 波长处。
在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm 与其浓度呈正比关系，可作定量测定。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料植物叶片（二）仪器设备紫外分光光度计、分析天平、离心机、恒温水浴锅、研钵、移液管等（三）试剂0.1 mol/L pH7.0 磷酸液三、实验步骤1．样品中蛋白质的提取称取植物叶片0.5~1.0 g放入研钵中，加入2mL 0.1 mol/L的磷酸缓冲液，研磨成匀浆，转移至15mL 离心管中，再用6mL磷酸缓冲液分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，在室温（20~25℃）下放置05~1.0h,以充分提取，然后在4000 r/min离心10 min，将上清液转入25 mL容量瓶中，并以磷酸缓冲液定容至刻度，即得待测样品提取液。
2．样品中蛋白质含量的测定取适量稀释后的蛋白质提取液，在紫外分光光度计上，分别于280 nm和260 nm波长条件下（以磷酸缓冲液为空白对照），测定提取液的吸收值，代入公式即可计算出样品中蛋白质的含量。
四、结果计算样品中蛋白质的浓度（mg/mL）=（1.45A280—0.74A260）×稀释倍数式中：1.45 和0.74 ——校正值。
A 280 ——蛋白质溶液在280 nm 处的吸光度。
A 260 ——蛋白质溶液在260 nm 处的吸光度Ⅱ、植物组织中可溶性糖的测定--蒽酮法一、原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。
该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。
联合测定法
酶—蛋白联合测定法1包括：(1)可溶性蛋白(soluble protein)，(2)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)，SOD(3)过氧化物酶(peroxidase)，POD(4)丙二醛(malondialdehyde)，MDA(5)过氧化氢酶(catalase)，CAT2 联合测定的原因：(1)节省人力，节省提取研磨过程(2)节省待测样品3 联合测定的可行性：（1）汪俏梅，郭得平（2004）对POD、SOD、CA T进行联合测定。
取1g西兰花样品，按1:5(W/V)加入0.05mol/L，pH7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆于4℃，13000g离心20min，上清液为酶提取液，分别测定POD、SOD、CA T活性。
（2）叶陈亮，柯玉琴，陈伟（1996），对可溶性蛋白、MDA、SOD、LOX进行联合测定。
称1g花蕾，用含1%聚乙烯吡咯烷酮的50mmol/L，pH7.0磷酸缓冲液4ml与冰浴中研磨匀浆，15000r/m冷冻离心10min，上清液备用。
①取上清液50μl，按Folin-酚法测定可溶性蛋白质含量；②取上清液1.25ml，加水1.25ml和0.5%硫代巴比妥酸三氯醋酸溶液2.5ml混匀，煮沸10min后离心比色测定，按陈贵推荐公式计算MDA含量；③取上清液10μl，按朱广廉法测定SOD活性，以SOD抑制NBT光化学还原50%所需酶量为一个酶活性单位；④取上清液0.5ml，按Surrey法比色测定LOX活性，以每分钟增加1个OD值为一个酶活单位。
4 联合测定的缺点（1）时间比较紧张，要求合理安排顺序，相互之间溶液干扰；（2）最好是同时做，人员比较多；（3）仪器，尤其是分光光度计要求要足够，不要相互之间抢；（4）需要标准曲线的最好一起做，它要求所有待测样尽量在同一条件下测定。
其它酶也是么？解决，减少实验次数，集中在1-2次内完成。
做大量的预备实验，熟练技能。
达到实验组每个成员倒背如流。
文心兰原球茎生长和分化过程中酶活性和可溶性蛋白的变化
从 事 寒 地 李 杏 育种 研 究 。 曾主 持 省 科 技 厅 “ 地 核 果 类 果 树 寒 种 质 资 源的 创 新 及 新 品 种 选 育 ” 目 ， 加 农 业 部 行 业 专 项 项 参
第 ３期
如 图 １ 图 ４所 示 ， 原 球 茎 分 化 芽 的 过 程 中 ， ～ 在
２ １ 文 心 兰 原 球 茎 不 同发 育 时 期 酶 活 性 变 化 ．
ＡＰ Ｐ Ｘ、 ＯＤ的 活 性 均 急 剧 下 降 ， 着 芽 的 继 续 生 长 ， 随 ＡＰ Ｘ和 Ｐ ＯＤ 的 活 性 继 续 降 低 ； 系 一 旦 被 诱 导 ， 呈 根 又 上 升 趋 势 ， 活性 均 低 于 类 原 ０ Ｏ 期 的 水 平 辩蜒专 但 球 茎 Ｏ 垂 ｎ， 而Ｏ Ｃ —｛ ）； ＡＴ ０ Ｏ Ｏ ０ Ｏ
壤葬天数
图 ３ 文心兰原球茎不同发育时期 Ｃ ＡＴ活 性 变 化
培养时闻
图 ６ 文 心 兰 原 球 茎 不 同生 长 阶段 可 溶 性 糖 含 量 的变 化
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图 ４ 文心 兰原 球 茎不 同 发 育 时期 Ｓ ＯＤ活 性 变 化
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图 ５ 文 心 兰 原 球 茎 不 同生 长 时期 Ｐ Ｏ 活 性 的 变 化 Ｐ
２ ３ 可 溶 性 糖 和 可 溶 性 蛋 白 质 含 量 变 化 ．
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可溶性蛋白的测定
可溶性蛋白的测定：
1实验仪器：分光光度计，电子天平，取样器，容量瓶，移液管。
2实验试剂：标准牛血清蛋白溶液（秤取牛血清蛋白10mg，溶于100ml蒸馏水中，是质量浓度为100 μg/ml），染料试剂【秤取考马斯蓝G-250（Coomassie blue G-250）60mg，溶于100ml 3% 过氯酸溶液中，滤去未溶解的染料，贮存于棕色瓶中】。
3试验步骤：
（1）绘制标准曲线以系列不同质量浓度（1~50 μg/ml）的标准牛血清蛋白溶液2ml，分别加入染料试剂，立即混匀，于分光光度计波长620nm出测定其OD值，以蒸馏水2ml 加染料试剂2ml 作为比色空白对照。
根据测定结果，绘制出OD值—蛋白质质量浓度标准曲线，最好配以线性方程。
每次测定样品是，都重做一次标准曲线。
（2）测定：用上述同样的方法，测定样品溶液的620nm处OD值，然后从标准曲线查得蛋白质质量浓度，或者根据线性方程计算。
注意事项：如遇比色杯（特别是塑料比色杯）吸附染料，可用乙醇清洗。
实验二 可溶性蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝g-250法).
Hale Waihona Puke 实验目的植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类， 测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每 一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表 示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性 蛋白质是研究酶活的一个重要项目。
实验原理
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的 一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与 蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在 465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内 （0～100μg/ml），蛋白质与色素结合物在595nm波 长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质 的定量测定。
实验试剂
标准牛血清蛋白 溶液
染料试剂G-250
试剂的配制
牛血清白蛋白 配成1000μg/ml和100μg/ml； 考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-
250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V） 磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此 溶液在常温下可放置一个月； 90%乙醇； 磷酸（85%，W/V）。
实验步骤
1.标准曲线的绘制 （1）0～100μg/ml标准曲线的制作 取6支试管，按表-1数
据配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配 各管溶液0.1ml，分别放入10ml试管中，加入3ml考马斯亮 蓝G-250试剂，盖塞，混合均匀，放置2min后，在595nm 下比色，绘制标准曲线。
Protein content ( g)
注意事项
1 由于取的组织不同，所以 OD值相 差较大。
2 研磨须充分，否则溶解后析光时所 得数据并不是1克植物量对应值。
试验分析方法
试验分析方法伊灵燕一、取样时期：齐口花时采样。
二、测定指标（每处理茎/叶各称：12个0.5g；4个1g；8个2g。
叶绿素另取）：（一）形态指标1、株高：用直尺测量2、茎粗（最粗处）：用游标卡尺测量3、节间长：株高/节数4、叶长、叶宽、叶柄长：用直尺测量5、植株鲜、干重：分为整株、根、地上部、菜薹重和叶重（包括叶片和叶柄）6、比叶重：用打孔器，每个重复打20个圆片，烘干，称干重（二）叶片色素：参照张宪政（1986）的方法，（三）品质指标：分为叶片和菜薹1、硝酸盐：比色法（李和生，2000）。
2、抗坏血酸（VC）含量：比色法，李合生（2000）3、可溶性糖：蒽酮比色法（李和生，2000）。
4、可溶性蛋白: 考马斯量兰比色法（李和生，2000）。
5、游离氨基酸：茚三酮显色法，李合生（2002）6、类黄酮、可溶性酚：比色法7、纤维素（薹干样0.2g）：四、指标测定方法：1. 叶绿素参照张宪政（1986）的方法，菜心叶片鲜样0.5g浸泡在25ml丙酮/无水乙醇（1:1，V:V）溶液中，至叶片发白。
测定OD645、OD663和OD440。
叶绿素a浓度（mg/L）＝12.7×OD663－2.69×OD645叶绿素b浓度（mg/L）＝22.9×OD645－4.86×OD663总叶绿素浓度（mg/L）＝8.02×OD663+20.20×OD645类胡萝卜素浓度（mg/L）＝4.7× OD440－0.27×总叶绿素浓度叶绿体色素的含量（mg/g）＝（色素浓度×提取液体积）/样品鲜重2. 硝酸盐比色法李和生（2000）（1）500μg/ml硝态氮（NO3-）标准液：精确称取烘干至恒重KNO3 0.7221 g （0.8145g）溶于去离子水中，定容至200ml（100ml）。
（2）5%水杨酸-硫酸溶液：称取5g水杨酸溶于100ml浓硫酸中，搅拌溶解后，贮于棕色瓶中，置冰箱中保存1周有效。
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植物组织中可溶性蛋白质含量的测定
考马斯亮蓝G-250染色法
一、原理
考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。
在一定蛋白质浓度范围内(1-1000ug)，蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。
其结合物在室温下1h内保持稳定。
此法灵敏度高(比斐林-酚法还高4倍)，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。
其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料
小麦叶片及其他植物材料
（二）仪器设备
722分光光度计，研钵，烧杯，两瓶，移液管，具塞刻度试管等。
（三）试剂
（1）标准蛋白质溶液：100ug/mL牛血清蛋白：称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL即可。
（2）考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90%乙醇中，加入100mL 85%（W/V）磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中。
常温下课保存一个月。
三、实验步骤
（一）标准曲线的绘制
取6支具塞试管，按表加入试剂（0—100ug/mL的标准蛋白）。
混合均匀后，向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，用1cm 光径比色皿在595nm下比色测定吸光度。
以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
绘制标准曲线的各试剂加入量
（二）样品测定
（1）样品提取：称取鲜样0.5g，用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，10000r/min离心10min，取上清液1.0mL（视蛋白质含量适当稀释）于试管中。
（2）吸取样品提取液1.0mL，放入具塞试管中（每个样品重复2次），加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2min后再595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得
蛋白质含量。
四、结果计算
()g mg W V V C F S T /1000
⨯⨯⨯=样品中蛋白质的含量 式中：C 为查标准曲线值，ug ；V T 为提取液总体积，mL ；W F 为样品鲜重，g ；V S 为测定时加样量，mL 。