吴茱萸挥发油抑菌活性及其化学成分研究

吴茱萸挥发油抑菌活性及其化学成分研究

作者：李雯婧李国军王智魏宝阳

来源：《湖南农业科学》2014年第10期

摘要：以吴茱萸挥发油为研究对象，进行空气抑菌、平板抑菌、液体培养等试验，并通过气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术对吴茱萸挥发油进行化学成分分析。结果表明：吴茱萸挥发油对空气中的细菌和真菌的抑菌率分别为97.86%和99.50%；对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有抑制效果，但对革兰氏阴性菌的抑制效果较弱，而对革兰氏阳性菌的抑制效果较强；经4.5%的挥发油作用24 h后，金黄色葡萄球菌细胞与细胞间界限模糊，菌体结成团块，并且有不规则凸起或凹陷，结构破坏严重，菌内物质外漏，最后裂解成碎片。GC-MS检测的色谱峰超过100个，经鉴定吴茱萸挥发油主要成分为月桂烯、β-蒎烯、柠檬烯及罗勒烯，占总成分的78.66%。

关键词：吴茱萸；挥发油；气相色谱-质谱；抑菌

中图分类号：R183 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2014）10-0016-03

吴茱萸[Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth]为芸香科吴茱萸属植物，别名吴萸、茶辣、漆辣子、臭辣子树、米辣子等；其果实含挥发油[1-2]，气味芳香浓郁，味辛辣而苦，有小毒；具有温中散寒、降逆止呕、助阳止泻之功效。吴茱萸自古以来就是我国常用中药，《本草纲目》中记载该中药有“开郁化滞、治吞酸、厥阴痰涎头痛、阴毒腹痛、疝气血痢、喉舌口疮”等作用。近代研究表明，该植物还具有镇痛、镇静、抗菌、降压、抗缺氧等药理作用[3]。吴茱萸挥发油作为天然防腐剂，有抗菌性强、安全无毒、作用范围广等化学防腐剂无法比拟的优点，其研究和开发利用成了食品科学研究的热点。抗菌作用是吴茱萸挥发油多种生理活性中最重要的活性之一，作为天然的抗菌药物开发的来源，研究挥发油的抗菌作用意义重大。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试样品吴茱萸于2011年10月初采自贵州铜仁。用水蒸气蒸馏法提取吴茱萸挥发油，收集的挥发油用无水Na2SO4干燥，密封，4℃保存备用[4]。

1.1.2 菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylocous aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）均由湖南农业大学生物科学技术学院菌种保藏中心提供。

1.1.3 培养基细菌培养基为牛肉膏蛋白胨培养基；真菌培养基为PDA培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 空气抑菌试验采取平板沉降法（平板暴露法）进行空气抑菌试验[5]。称取100 g吴茱萸粉末放于1 m3密闭空间，让吴茱萸挥发油挥发，分别于施用前和施用后12 h在采样区放置平板，采样点选择实验空间四角和中央，平板在空气中暴露60 min后密封，置于30℃恒温箱培养24 h，记录每个平板的菌落数。

1.2.2 平板抑菌试验采用滤纸片法进行平板抑菌试验[6]。供试菌种活化后，用无菌水（约5 mL）冲洗菌落，置旋涡混合器混匀。无菌操作下取0.l mL菌悬液注入平板，放置5 min左右后涂布均匀，每个菌种做3次重复。滤纸片（直径0.6 cm）灭菌，两张为一贴，浸润样品后贴在培养基平板上，轻压使滤纸片牢固。放入培养箱中30℃恒温培养，24～48 h后观察培养结果，测量抑菌圈直径。对抑菌圈直径数据进行统计分析，计算平均值和标准差s[7]，其中s=，根据±s判

断抑菌效果。

1.2.3 吴茱萸挥发油作用于金黄色葡萄球菌后的形态观察将对数期的金黄色葡萄球菌接种至含4.5%（体积分数）挥发油的液体培养基中，使培养基菌数达107个/mL，于37℃下120 r/min振荡培养；24 h后取样，离心去上清液，用硫酸缓冲液洗涤沉淀3次；按照电镜样品制备方法[8-9]，将沉淀制成标本，在扫描电镜（JSM-6380LV）下观察；以正常培养24 h的金黄色葡萄球菌作对照。

1.2.4 GC-MS仪器及分析条件试验采用GC6890N / MSD5973N 型 GC-MS 联用仪（美国J&W ）进行测定。色谱柱为DB-5（30.0 m×0.25 mm×0.25 um）；柱温50℃；柱流量0.70

mL/min；采取分裂进样，分流比为5︰1。质谱条件：离子源温度200.00℃，接口温度

220.00℃，质核比扫描范围为45～200 m/z。

2 结果与分析

2.1 吴茱萸挥发油对空气中微生物的抑制作用

在1 m3的密闭空间中，未处理的空气中细菌和真菌含量分别为84.20±60.5和

121.00±13.03 cfu/m3；而使用吴茱萸挥发油处理后的细菌和真菌含量分别为1.80±0.58和

0.60±0.40 cfu/m3，抑菌率分别达到97.86%和99.50%。

2.2 吴茱萸挥发油对不同细菌的抑制效果

试验结果显示，吴茱萸挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌圈分别为1.83±0.03、1.98±0.08和1.18±0.05 cm。由此可知，吴茱萸挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及大肠杆菌均有抑制效果，但抑菌强度有一定差异。大肠杆菌（革兰氏阴性菌）的抑菌圈最小（图1A），而枯草芽孢杆菌（革兰氏阳性菌）的抑菌圈最大（图1B），这说明吴茱萸挥发油对革兰氏阳性菌的抑制效果强于革兰氏阴性菌。

2.3 吴茱萸挥发油对金黄色葡萄球菌结构的影响

如图2所示，正常条件下，金黄色葡萄球菌细胞表面光滑、圆润，呈球状，细胞与细胞间界限分明，细胞排列呈明显的葡萄串状。经4.5%的挥发油作用24 h后，金黄色葡萄球菌细胞与细胞间界限模糊，菌体结成团块，并且有不规则凸起或凹陷，结构破坏严重，菌内物质外漏，最后裂解成碎片。

2.4 吴茱萸中的挥发油成分

从图3中看出，吴茱萸的挥发油中含有丰富的有机成分，共检测出100种以上化合物。根据图谱面积得知，9号、15号和18号3种成分占了总成分的78.66%；其中，9号波峰主要是月桂烯和β-蒎烯，15号波峰主要是柠檬烯，18号波峰主要是罗勒烯。这4种物质的分子式均为C10H16，分子量为136.234，结构式见图4。

3 结论与讨论

试验结果表明，吴茱萸挥发油对空气中微生物有较为明显的抑制作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌都有抑制效果，但抑菌强度存在一定差异，例如对革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）的抑制效果较弱，而对革兰氏阳性菌的抑制效果较强（如金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌）；这与Yanga等[10]的研究结果相吻合。但是，由于吴茱萸挥发油的成分复杂，不是单一组分，所以其抑制效果差异的原因还有待进一步研究。

通过气相色谱-质谱联用仪对吴茱萸挥发油成分进行分析鉴定，结合质谱数据库和文献参考，共分离出100种以上化合物，鉴定出其主要成分为月桂烯、β-蒎烯、柠檬烯、罗勒烯等，占挥发油总成分的78.66%。

β-蒎烯与月桂烯常用于生产香料。柠檬烯有良好的抑菌作用，是光谱性抑菌化合物；研究表明，柠檬烯主要通过改变细胞膜结构以及降低细胞膜总脂肪酸含量来抑制细菌生长[11]，其抑菌作用能否发挥是由细菌膜结构能否快速改变来决定的[12]。研究表明：罗勒烯对多种真菌都有抑制作用，但其抑菌机理尚不明确，可以确定的是罗勒烯能导致细胞膜损伤甚至细胞死亡[13]。电镜观察结果显示，吴茱萸挥发油处理后的金黄色葡萄球菌结构破坏严重，这与柠檬烯及罗勒烯的抑菌机制相吻合。这说明吴茱萸挥发油中主要抑菌物质为柠檬烯和罗勒烯。

试验中用于进行抑菌活性研究的挥发油样品是粗制品，有效成分含量常随季节和地理环境等因素的变化而改变，作用机理、抗菌谱和可应用的范围等研究还不全面，有待于进一步的研究。

参考文献：

[1] 周云波，熊梅，韩俊，等. 吴茱萸的研究进展[J]. 文山师范高等专科学校学报，2008，21（1）：102-105.