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铅污染土壤的生物修复
实验室进行了利用培养好的白腐菌和秸秆对被铅污染的土壤进行生物修复模拟。

监测了土壤的pH值，铅浓度，土壤微生物，微生物代谢商，微生物商和微生物生物量C和N的比值。

以上指标用来学习土壤中铅的强度和微生物在生物修复过程中的影响。

研究表明被施以白腐菌和秸秆的土壤含有更低的可溶性交换铅，更低的生物商和生物量C和N的比值（0 mg /kg 干土，1.9 mg CH2-C，生物量C 和4.9 在60天时），和更高的微生物生物量和微生物代谢商（2258 mg /kg 干土和7.86% 在第60天）。

另外，在logistic 等式中的动力参数是用BIOLOG数据进行计算。

对动力参数进行分析后，就能得到一些微生物群的微生物量的信息。

所有数据显示含铅土壤的生物利用度被减少，这样潜在铅的强度被缓解，并且土壤微生物影响和微生物群的微生物量有所提高。

1.简介
土壤中的重金属是最常见的环境污染。

铅被认定是所有重金属中危害最为严重的。

铅污染的主要来源是采矿、冶炼、含铅汽油、污水污泥、废弃电池以及其他含铅产品。

这些种类繁多的铅来源导致土壤中含铅量偏高。

Linet al的报道指出在瑞典Falun西南部大量工厂废物聚集地，土壤含铅量超1000 mg /kg。

Buatier et al.指出在法国一个污染地，地表铅浓度达到460–2670 mg/kg。

铅的毒性和生物利用度受土壤pH、氧化还原和铅种类的影响。

土壤中的含铅化合物主要通过可交换物、碳酸盐类、Fe/Mn 氧化物有机物和残留态流失。

可溶性可交换状态铅的最大危害是铅非常容易浸入地下水，地表以及农作物。

然而铅在有机物和残留状态却无害，这是由于有机健的强度和硫化物，特别是在重污染土壤中。

因此，相对其他状态下的铅，铅在可溶状态时对环境，生态和人类更加有害。

这样怎样减小土壤中铅变为可溶状态是值得关注的。

相比传统的物理化学方法，生物修复是一种既不会加剧其他污染又能有效修复污染甚至还原土壤原先状态的技术。

之前的研究着重于物理方法研究含重金属土壤的微生物。

然而没有可用的信息用于向含稳定金属污染的土壤
微生物接种。

但是重金属是非降解性污染并且很难在一些情况下用一般方法移除，因此总金属量很难大量减少。

为了阻止金属离子从土壤进入食物链或地下水，要添加微生物吸附和积累金属离子作用于土壤中的固定污染金属。

之前的研究表明白腐菌能够很好地吸收来自他稀释的金属和少量铅离子的转移。

白腐菌中能够积累在其细胞内的金属离子摄取。

正如大多数研究者所说，也可以与活跃细胞（包括死细胞）壁表面的官能团羧基，基或其他金属离子结合。

同时，白腐菌能够在固体和液体环境中以及营养不足的环境中成长。

所以它能适应各种复杂的污染环境并且比其他微生物成长更好。

此研究的目标是种白腐菌和秸秆在含铅土壤中去减少可溶的铅并提高生物活性。

系统分析了生物修复过程中的铅含量和微生物指标的变化，数据用来评估由孵化和无接种白腐菌中的铅污染土壤的修复效果。

这些结果预计对减轻金属污染土壤接种白腐菌和秸秆对环境的影响提供有益的参考。

2. 材料和方法
2.1 微生物准备
采用白腐担子菌和含有BKM-F-1767的白腐菌。

备用种在4℃的条件下被保存在麦芽分解琼脂斜面上。

在无菌蒸馏水中制备孢子悬浮液。

测量真菌浓度并将其调整至2.0 × 106 CFU• ml−1。

2.2 土壤性质和孵育
在中国长沙岳麓山人迹罕至的山坡上，大量砾石和有机肥料被移除的地下100cm处收集未受污染的土壤。

土壤是自然风干并通过2mm尼龙网，它的主要物理化学性质如下：39%的粘土，含有0.83%有机碳，N总量为0.059%，PH值为4.9，总的Cu，Cd，Pb分别为11.5，0和17.9 mg/ kg。

然后土壤和Pb(NO3)2溶液混合，为了增加含400mg Pb2+的孵育5周的干土，这样刺激含铅土壤成为相对稳定的状态。

2.3 实验设计
实验仪器包括试验用反应堆，二氧化碳移除器，加湿器，和降解产生的二氧化碳收集器。

吹风机用于空气流动，空气流动由流量计控制在0.1 m3/h。

空气流过2M的氢氧化钠时二氧化碳被移除。

含纯净水的加湿器被用来阻止任何碱性溶液进入反应器，并能够增加进入空气的湿度。

反应器是5L的玻璃密闭瓶。

被加湿无二氧化碳的空气从底部的塑料孔进入反应器。

氢氧化钠中的二氧化碳每三天更新一次。

准备两组相同的实验仪器并标明A和B。

每组反应器加入1.5Kg之前准备的土壤。

每组反应器放入等量的秸秆，其和土壤的比值为1:6,此混合物要被调整至60%的含水量。

上述准备的孢子悬浮液要按1:2的重量比接种在B反应器中，A不需要接种。

A中不含白腐菌污染的土壤被添加的秸秆孵育，而B中含白腐菌接种污染的土壤菌和秸秆被孵育。

剩余的秸秆提高了土壤孔隙度使其有更好的通风并提供必要的代谢底物营养物质的微生物。

多余的反应控制器中有土壤和白腐菌，并标为C。

在准备一个反应器D，其中放入不接种也无秸秆的受污染的土壤。

这样两组可以更好地看出内在固定土壤中铅的指标。

两种土壤都要培养60天。

2.4 土壤pH和铅的确定
土壤pH用摇晃30分钟1:10的水进行测量。

铅的5个分数用一下表示：（i）可溶性交换：1g干土和8ml的1 M MgCl2 (pH=7.0)分解1小时。

（ii）碳酸类：（i）中的残留物和pH为5的1 M 的NaOAc分解5小时。

（iii）Fe-Mn 氧化物: (ii)中的残留物和0.04 M NH2OH•HCl分解6小时。

（iv）有机物：（iii）中残留物被加入0.02M HNO3和30% H2O2，用HNO3将pH调为2，混合液加热至85°C并保持两小时。

再加入3ml 过氧化氢。

（v）残留态：减去其他四步所有的铅就是残留的铅。

2.5 微生物生理指标分析
这部分可以提供土壤中微生物化学的信息。

和微生物C(Cmic)的测量是用样品的熏蒸。

土壤qCO2是土壤产生二氧化碳和Cmic的比值。

二氧化碳的产量是用测量的。

样品置于80度烤箱中烘干，然后移至550°C排气管5小时。

碳键可以通过在点火时失去的重量被估测。

微生物商是Cmic与Corg 的比值。

2.6 BIOLOG菌落生理分析
Kell和Tate评估土壤微生物群落代谢多样性的潜在使用结构BIOLOG。

这表明碳的唯一土壤生物源利用率。

5g新鲜的土壤增加100瓶的无菌水和动摇摇床为硝酸混合物加热至85℃ 2小时10分钟，10倍系列稀释这种土壤。

10-3稀释（150μL），然后到每一个结构BIOLOG GN板以及用于接种。

这些板块在25℃的156h培养。

展色在590 nm处测定光密度（OD），OD590为每12小时的间隔读取。

其他各井OD590减去OD590控制以及不含碳源。

平均吸光度（平均颜色的发展，AWCD），然后计算出每个板块，每个阅读时间，对时间AWCD曲线绘制。

用动力学模型参数和曲线拟合时间评估AWCD每个土壤样品。

2.7 数据分析
每次试验，分3组平行实验反应堆运行。

取三个反应堆的平均值，用标准偏差来总结实验数据。

BIOLOG分析，SPSS 12.0软件用于Windows（SPSS 德国）的软件包，从获得的动力学参数进行统计分析。

这些测试包括：（1）非线性回归分析动力学参数值，并提出了密度依赖的Logistic生长曲线来描述每个土壤样品的AWCD；（2）单向方差分析（ANOVA）单一的时间点OD 值和动力学模型参数。

3. 结果
3.1 土壤PH值随孵化的变化
在土壤培养的早期阶段，样品从反应器A和B的pH值略有下降。

9天之后，两个样品的pH值显著增加，然后趋于稳定。

pH值上60天，A变为6.7，B变为7.3。

在B土壤的pH值呈中性，高于在A的土壤。

3.2 土壤铅浓度和扩散系数（γi）
所有土壤在孵化过程中的铅浓度变化。

最高值在A-Ç土壤铅含量的可溶性交换显示的第6天，然后显著下降。

经过60天的潜伏期，在B土壤铅可溶性交换浓度甚至下降到0 mg/Kg，仍分别为100.5和77.0mg/Kg，而在C 土壤。

结果表明，其他四个PB的分数在D土壤对可溶性交换铅含量略有下降。

经过6天的潜伏期，碳酸盐结合铅，有机结合铅和A至C土壤中的残留铅明显增加，而铁锰氧化物限制的铅18天后增加。

与对照土壤相比碳酸
盐结合铅，有机绑定铅和铅残留，和交换可溶性铅的最低浓度最高浓度，发现乙孵化后的土壤，它提供了B土壤中铅的最低的流动性和铅的生物利用度。

3.3 微生物生理指标
微生物生物量，土壤有机质的生活的一部分，可以是一个很好土壤中铅的毒性的指标比较。

在培养期间Cmic发生了显著的变化。

qCO2，CO2-C-Cmic比例计算，高于乙土壤在整个孵化后12天。

经过6天的潜伏期，Cmic土壤有机碳的比例，远低于在B土壤。

在B土壤Cmic/ Corg第24天的最高值。

Cmic/ Corg在A和B土壤的变化是相似的，这表明对整个孵化期间的跌势。

发现在土壤B 中的Cmic/ Nmic整个孵化过程中的比例要低得多。

3.4 动力模型和参数
样品AWCD由BIOLOG和非线性与土壤样品接种的微孔板孵育时间决定，色彩的发展曲线的形状一般是S型，可以通过描述基于密度依赖的Logistic生长方程的动力学模型。

我们用特罗姆修改公式。

4. 讨论
以往的研究表明，重金属总量，不能反映金属的流动性和生物利用度，而有效浓度的金属与金属的毒性和工厂的可用性有显着关系。

同一种重金属，可溶性盐，在交换阶段最容易被植物吸收，因此可以通过观察在哪个阶段对存在的金属进行评估。

重金属的生物利用度和转移能力的降低与提取。

经过60天的生物修复主要在B土壤铅的残留态和有机较少的流动性和活动性，而在土壤中的铅主要是铁锰氧化物和可溶性交换分数。

我们的研究结果表明生物体的铅毒性，从铅合作孵化白腐菌中添加秸秆的土壤相比在B土壤铅的显著减少对环境的压力。

另一个可以解释为低铅后在B土壤活性生物修复的机制，是在B土壤较高的pH值。

原土的pH值只有4.9。

pH值是影响离子的形式和化学的流动性。

高pH值可能有助于减少金属在介质中的溶解度，这也是在我们的研究结果的证实，少的水溶性可交换铅浓度的两种土壤中的pH值上升较低，土壤中活跃
的铅浓度具有较高的pH值。

可能是由于日益增加的pH值有利于阳离子重金属保留土壤表面通过内部球体表面络合，吸附，沉淀和多核型反应。

guttormsen等人发现，土壤pH值影响金属水解，离子对的形成，有机物的溶解度，以及表面电荷的铁和铝的氧化物，有机质，粘土边缘。

阿佩尔和马报道了pH值，土壤中重金属的吸附的重要作用，因为它直接控制金属氢氧化物，以及金属碳酸盐和磷酸盐的溶解度，因此较高的pH值有利于降水和固定金属。

所形成的氨溶液导致有机氮氨化铵的形成和在土壤中的pH值的增加。

这也许可以解释在A和B的土壤pH值在孵化时间的观察。

在B土壤的pH 值上升比在土壤A中快，其原因可能是，在B土壤菌体育促进有机物降解和氨或有机挥发溶酸。

在B土壤有效的铅浓度低于对照组，这有利于减少毒性。

布鲁克斯建议，可以通过比较微生物参数评价重金属污染土壤生态系统功能的相对影响，越来越多的证据表明，土壤菌群起着生态等级养分循环过程，微生物的一个重要的角色比土壤生长在同一土壤重金属动物或植物都更为敏感。

因此，我们分析了一些微生物参数，以评估微生物的生长和微生物活动。

微生物生物量是更为敏感的指标，比总有机质含量变化的土壤条件和微生物生物合成的抑制。

长期土壤菌群暴露于高重金属含量将减少Cmic / Corg，因为金属的毒性降低土壤微生物生物量和代谢效率。

因此，减少铅胁迫对土壤菌群可以促进微生物的生长，可能是负责在A土壤和B土壤。

Cmic 和Cmic / Corg增加，在孵化期间两种土壤的表示，在碳基板转换成生物代谢效率提高。

更高的qCO2在大部分金属污染土壤和qCO2大于未被污染的土壤中约2.0倍。

傣族等也发现，qCO2缓解金属毒性并降低。

12天的生物修复，这可能表明，两种土壤中的铅毒性缓解后，在两种土壤qCO2显著下降。

在A土壤中的qCO2比B土壤整治后大1.6倍。

微生物代谢效率，抑制金属的存在，微生物合成需要更多的能量。

主要是利用土壤中有机碳，为维护能源金属污染的条件下生长的微生物，所以二氧化碳的释放增加，并转换成生物有机碳下降。

相反，微生物可以转换成生物基板，有效地减少或无金属污染。

这些发现也许可以解释qCO2在我们的研究中观察到的变化。

不同C / N比的微生物（如真菌和细菌）土壤生物量C / N比贡献。

一般来说，有污染土壤和未被污染的土壤中的细菌，真菌，因真菌耐受金属的主导地位。

由于微生物C / N比值（如真菌，细菌等）之间的差异，在土壤中的
生物量，C / N比变化与不同的微生物的不平等的增长。

Cmic/ Nmic显示减少CMIC增加，这可能是样品，因为低C / N比的微生物的增长速度比那些高C / N比的快。

约根森等人也证实，是大量的微生物生物量C / N比值增加真菌重金属污染下土壤微生物生物量比率造成的，他们报道的C / N为3.5:1和真菌，细菌的比率低，从10到15:1。

虽然B土壤比在孵化过程中的一个土壤Cmic / Nmic下降，我们的研究结果表明具有较高的污染水平和更高的的Cmic / Nmic土壤在B土壤60天的污染水平较低（低Cmic在土壤/ Nmic表1和2），这是以往的研究和我们上面得到的结论相反。

Cmic/ Nmic是不适合用来作为估计污染土壤中金属毒性和污染程度与微生物的接Cmic种，这可能是因为Cmic / Nmic接种的微生物会影响这个估计指数。

上面提到的微生物指标下铅污染的土壤中的微生物和微生物活动的增长反映的差异，但不表明微生物群落状态的变化。

结构BIOLOG程序可以表明土壤微生物群落代谢能力。

微生物群落的代谢活动之间的差异可以通过分析对Biolog板碳源的利用进行评估。

整治后，观察B土壤表明在我们的研究通过共同培养法提高土壤中的微生物利用碳源的高K和低S。

有人还指出，有动力学参数K和S 之间的显著性差异，符合Logistic生长曲线在土壤和那些在B土壤，在A土壤中AWCD和显著性差异，而没有在B土被发现。

上述结果表明，动力学参数比AWCD，是用来评估微生物群落的活动和土壤生态状况，按照以前的报告中的微生物群落的代谢能力的变化更加敏感。

5. 结论
总之，我们的研究结果表明，孵化污染土壤接种白腐菌中，作为营养补充的秸秆在一起，可以减少活动的铅，减轻铅应力，并稳定铅污染的土壤。

此外，治疗比较对照组改善土壤的整治。

所有这些结果可能是因为铅离子被吸收白腐菌中的菌丝体，并在孵化过程中形成的腐殖质螯合。

然而，进一步的研究需要进行调查和确认铅的固定机制的机制。

依靠传统的生物修复技术对植物可能很难修复一些瘦肉与重金属污染的土壤，因为土壤条件不利于植物的生长。

此外，当土壤中的微生物已经恶化，传统的物理化学方法不能有效改善土壤中微生物活动，但只从污染土壤中的金属。

在我们的研究中所使
用的方法，不仅可以固定在土壤中的铅离子，而且还有效地提高土壤中微生物活动和微生物群落的代谢能力。

然而，只是固定金属离子络合，而不是从我们的研究土壤中移除，这样的方法需要改进且值得进一步研究。