12 第十二讲 DNA文库的构建
12 第十二讲 DNA文库的构建
基因重组
体外包装不同的基因， 但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，有 15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同 的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克 隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得 多。
转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序
列的结构与功能。基因组DNA与cDNA的比较基因组DNA的重组cDNA分子反映来源细胞 中表达信息的完整性。 3.2 重组cDNmRNA； ⑶ cDNA的合成； ⑷ 黏性末端片段与载体的连接； ⑸ 离体包装获得重组噬菌体； ⑹ 检测⑴基因组DNA的分离制备 不同来源的DNA制备方法不同。 一般来说，有液相法和固相法两种。 液相法提取的DNA长度一般在100kb左右， 基本可以满足构建各种小插入片段基因组文 库的要求。
大相对分子质量(high molecular weight,HMW) 基因组DNA的提取方法
基因组DNA
限制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因组3.2 基因组信息的可重建性 通过建立叠连群(conti一般来说，DNA片段长，完整基因组文 库所含的克隆数越少。反之，越多。 基因组越大，应包含的克隆数越多， 反之，越少。
4.2 cDNA第一链的合成 ① oligo(dT)引导的DNA合成法 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的 特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的 oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一 链。
7.DNA 文库的构建
cDNA 第二条链的合成在 cDNA 的构建中 非常重要， 非常重要，有：自身引导法，置换合成法，引 自身引导法，置换合成法， 导合成法，引物－ 导合成法，引物－衔接头合成法可以后可以通过表型筛选法、杂交筛 选和 PCR 筛选、免疫筛选法筛选目标基因。 筛程序包括：
1、提取研究对象基因组 DNA ，制备合适大 小的 DNA 片段，或提取组织或器官的 mRNA 片段， 并反转录成 cDNA ； 2、DNA 片段或 cDNA 与经特殊处理的载体 连接形成重组 DNA ； 3、重组 DNA 转化宿主细胞或体外包装后侵 染受体菌； 染受体菌； 4、阳性重组菌落或噬菌斑的选择。 阳性重组菌落或噬菌斑有不同， 构建。 连接产物不用电转化的方法转化宿主，而是采 连接产物不用电转化的方法转化宿主， 用包装蛋白进行包装并侵染宿主。 用对简单， 其需要很多特殊的处理以及必要的仪器设备， 其需要很多特殊的处理以及必因组覆盖倍数的计算方法一般包括两个过程 1.计算法，基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度× 1.计算法，基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度×克 计算法 隆数/ 隆数/基因组 DNA 的长度（一般是约数）； 的长度（一般是约数）； 2.结合基因组覆盖度的检测来进行的。 2.结合基因组覆盖度的检测来进行的。基因组覆盖覆盖倍数又等于 该基因位点的覆盖倍数，因此， 所有探针筛到的阳性克隆的总个数/ 所有探针筛到的阳性克隆的总个数/使用的总探针数的比 值。代表性和随机性 二、代表性和随机性
代表性是指中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可 片段寻找最适的比 例。 在电转化和包装侵染过程中， 在电转化和包装侵染过程中，首先选择转化 效率高的感受态细胞或行脱盐处理也可以明显地提高 其效率。 其效率。 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不 对于电转化而言， 同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同。 的转化效率也有所不同。
怎样构建基因组文库
i. 两菌株分别培养,分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
sa c B
K anr
p a c lo x P
D N A h ea d fu l
+
+ p a c c le a v a g e
p r o te in
C re
R e c o m b ila tio n
DNA
A m p lific a tio n七. 利用YAC载体构建基因组1. 两臂DNA片段的制备:
第四章基因的建立来自基因文全部遗传信息的重组D因组DNA长度之比
S
C o s o r i A pr S
SalI Cos
S
H
S
S1 Cos
H
BamH I 小片段
Cos
H
35-45kb DNA 片 段
T4 DNA ligase
Cos
H
利
构用
建双
COS
基
因
组质
文粒
S
离体包装
S
库载
感 染 E.coli
体六. 利用P1载体构建基因组构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装
基因组文库构建
构 建 基 因 组 D N A 和 cD N A 文 库 的 流 程 示 意 图
第一节 DNA克隆片段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化 1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体 连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach) 存在的问题： ①所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段 的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算， 基因库至少含10～30万个重组质粒。从中筛出目的基 因工作量是很大的。 ②目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个 基因分载在 几个重组质粒上，完整筛出更不容易。
H in d I I I C os N otI Z T7 P a rC CM SP6 N otI
r
H in d III 部 分 酶 切
P a rB P a rA
BAC o r iS PFG L re p E H in d I I I C IP
P u lse d -fie ld g e l e le c tro 使其成为一定大小的片段连接到适当载体常为噬菌体上经体外包装转染细菌得到一群含不同dna片全部基因的随酶切使其成为一定大小的片段，连 接到适当载体(常为噬菌体)上，经体外包装 转染细菌，得到一群含不同DNA片段的重组 噬菌体颗粒。此即是基因。这群DNA片 段含盖基因组全部基因。
但应注意： (1) 细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的 mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。 (2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得 其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或DNA。不能用于基因结构和调节的研 究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部 分重叠的cDNA克隆。
真 核 基 因 组 DNA
λ 取 代 型 λ 噬 菌 体 载 体
12第十二讲 无终卡农与卡农模进
第十二讲、无终卡农与卡农模进 一、无终卡农
无终卡农是卡农式模仿的一种。如果卡农式模仿结束部 分的旋律，能与其开始部分连接贯通，并作不间断的反复， 即构成无终卡农。如：
例2
无终卡农的写作举例
二、卡农式模进
卡农式模进是复调模仿手法与音乐材料模进展开手法 的结合。它是由一个包括起句、应句、对句在内的原始音 组所作的周期性重复，而每次重复又在一个新的高度上。
例3 卡农式模进
卡农式模进的写作方法与无终卡农相近，通常也需借 助第三辅助声部来完成。第三辅助声部位置和高度的确 定与无终卡农确定辅助声部的方法完全相同。即：辅助 声部的位置及其首音与新音组首音出现时的位置，在距 离和高度上与起句首音到应句首音的距离和音程反方向 相等。如图所示：
例1 无终卡农《两只老虎》
无终卡农的写作，开始部位和主体部份与卡农式模仿相 同，但在其结尾靠近回头处，则需运用纵向移动或纵横移动 的技术加以处理，才能使其首尾贯通。具体地说，需要借助 于第三辅助声部来完成。确定第三辅助声部位置和高度的原 则是： 1、辅助声部出现的部位在主题回头前，视主题单独呈 示的长短(即起句与应句的距离)而定。若主题单独呈示的长 度是2小节(如上例)，辅助声部则在反复记号两小节前设置。 如果主题单独呈示的长度只有1小节，辅助声部就在反复记 号1小节前设置。 2、辅助声部的高度以主题返回时第一个音(首音)的高 度为基准，辅助声部首音与主题返回时首音的距离，与起句 首音到应句首音的距离反方向相等。图示如下：
例4
卡农模进
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选
(3) 引导合成法
Okayama-Berg方法
（4）引物-衔接头合成法
4、双链 cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入 大肠杆菌中繁殖的分子克隆
1.同聚100dA/dT, 20dG/dC) • 同聚尾结合的质粒： cDNA杂合分子转化 E.coli的效率随宿主不 同而不同。
该法聪明地利用了反转录过程中用接头锚定的方法， 与传统法相比，全长cDNA的比例得到大幅提高
2. G
1. 抑制性扣除杂交 suppression subtractive hybridization, SSH
含目的基因的cDNA：供体 tester 不含目的基因的cDNA：驱动 driver
• RsaI消化tester和driver • 将tester一分为二，分别加上接头1和接头2R • 第一轮杂交中，用过量的driver cDNA分别与带两种 接头的tester cDNA杂交 • 第二轮杂交中，将第一轮杂交的两个体系混合，再 加入过量的driver cDNA • 补平第二轮杂交产物的末端，进行两轮PCR扩增 • 巢式引物进行第二轮PCR扩增，富集差异表达基因 • T/A克length cDN因： • cDNA第二链合成工程中聚合酶的外切酶活性； • mRNA降解； • 反转录酶合成特性，从转录复合体上anism at 5' end of RNA • 指导合成高分子量蛋白质的能力 无细胞翻译体系（源于网织红细胞） 哺乳动物总mRNA可编码 10～100kDa蛋白
DNA文库的构建
真核生物mRNA的结构
2、提取RNA基本步骤
总步骤：裂解细胞、沉淀蛋白、去除DNA、质量分析等； 裂解细胞： 强离液剂：胍盐, SDS, N-laurylsarcosine
(sarcosyl), 尿素, 苯酚 ； 破坏质膜，保持细胞核或细 胞器的完整性 ：如Nonidet P-40 (NP-40)，研磨、蛋白 酶K、蜗牛酶(含纤维素酶、甘露聚糖酶、葡糖酸酶和几丁 质酶等，可破坏酵母菌细胞壁)、SDS等处理； 沉淀蛋白：SDS、β -巯基乙醇、氯仿、苯酚、盐酸胍、异 硫氰酸胍等； 沉淀RNA：乙醇、异丙醇、氯化锂等； RNA质量分析； 从总RNA中纯化分离mRNA； RNA的长期保存。
制备基因组DNA的常用试剂
破碎细胞（液氮研磨、匀浆、超声波破碎） 除去蛋白杂质：（蛋白酶K、SDS、 CTAB、苯
酚）； 除去RNA(RNase A) 除去黏多糖(CTAB); 沉淀DNA（乙醇、异丙醇）； 抑制DNase（EDTA，可以螯合Mg++等）； 脱盐（70%乙醇漂洗）。
关键是对付RNase：措施
为了保证mRNA的完整性，必须使用最新鲜的生物材料， 最好是培养的活细胞，或从活体即刻采集的样品进行制备， 或者置于液氮、超低温冰箱保存的样品；
DEPC处理配置溶液用水：用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯 ，一种很强的RNA酶抑制剂）浸泡处理和高压灭菌；
烘烤玻璃器皿：200-300℃烘烤4小时；塑料器皿：在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底清洗，灭菌，即可去除 RNase；
基因文库的构建
5. 重组 重组cDNA分子的转移和的建立 分子的转移和的建立选用载体为质粒，可直接转化 载体， 选用载体为质粒，可直接转化E.coli；若为 载体，则 ；若为λ载体 需进行体外包装、感染等。 需进行体外包装、感染等。
ds-DNA合成 与SalI匹配 接头相连 NotI酶切
cDNA的段或条件的某种细胞分 定义：
离到的全部mRNA经反转录成 cDNA后再重 经反转录成 离到的全部 后再重 组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。 组和增殖所性
常来自结构基因， 常来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信 且只代表那些正在表达的基因的遗传信息： 息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：1—5% mRNA，80—85% rRNA，10—n(1―p) ln(1―f)
f为某一特定 为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部 为某一特定 （ ） cDNA (mRN1. 载体 载体DNA片段的制备 片段的制备 2. 多聚（A）RNA的分离与纯化 多聚（ ） 的分离与纯化 3. 双链 双链cDNA 的合成
2. 器官特异性
不同器官或组织的功能不一样， 不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的 表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所 表达就具有器官特异性. 代谢或发育特异性
处于不同代谢阶段（或发育阶段） 处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结 构基因表达亦不相同
4. 不均匀性在同一个cDNA中，不同类型的cDNA分 中，不同类是大不相同的，尽管它们都是由单拷 贝基因转 贝基因均有相同的克隆数相较，这是两种文 库的另一差别。 库的另一差别。
NotI primer/adaptor
载体
1)SalI/NotI 2)T4 DNA ligase
SalI adaptor
基因文库构建的过程、原理及方法
基因⽂库构建的过程、原理及⽅法基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤ RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
为此，必须克服仅⽤ mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作⽤特点所导致的局限性。
基因文库的构建
（2）cDNA与载体相连
cDNA与一个载体在T4连接酶作用下以粘末端 互相连接，即为重组DNA 分子。
（3）导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞培
养或保存。 宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆
体的寡核苷酸链为探针）
2. mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特 定功能基因工作量较小。
3. mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利 于获得较多的模板。（转录特征）
4. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白
5. 不同种类不同状态的细胞的cDNA不同 6. 不能研究基因组的结构功能
构建cDNA1.制备mRNA凝胶阻滞法
DNase Ⅰ足迹法
4.7.1 凝胶阻滞实验
又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于 在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊 的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点， 也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质定长度的DNA片段克隆到某种载体上发育时期所转录的mRNA 经逆转录形成的cDNA片段与某种载体ene pool)：某一生物群体所拥有的全部基因。
4. 筛选目的基因
原核细胞不可用来作为基因的表达系统 （无转录后加工）。
原核细胞基因库——只能用核酸探针杂 交筛选目反转录酶的作 用下将点：
1. cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸 纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显 示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。 确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性 酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。（如图）
溶菌、使DNA 暴露
基因组文库构建的程序
基因组文库构建的程序基因组文库构建程序基因组文库构建是基因组学研究中的重要步骤之一，它是将DNA 分子切割成小片段，并将这些小片段插入到载体DNA中，形成文库。
文库构建的成功与否直接影响到后续的测序结果和分析结果。
因此，开发高效、准确的基因组文库构建程序对于基因组学研究具有重要意义。
基因组文库构建程序的主要步骤包括DNA片段切割、文库构建、文库质量控制等。
其中，DNA片段切割是文库构建的关键步骤之一。
DNA片段切割的方法有多种，如限制性内切酶切割、超声波切割、化学切割等。
不同的切割方法适用于不同的样品类型和研究目的。
例如，限制性内切酶切割适用于较小的基因组，而超声波切割适用于大型基因组。
文库构建是基因组文库构建程序的核心步骤之一。
文库构建的方法有多种，如插入式文库构建、接头式文库构建等。
插入式文库构建是将DNA片段直接插入到载体DNA中，而接头式文库构建则是在DNA片段的两端加上接头序列，再将其插入到载体DNA中。
接头式文库构建相对于插入式文库构建具有更高的文库构建效率和更低的文库构建偏差。
文库质量控制是基因组文库构建程序的最后一步。
文库质量控制的目的是检测文库的质量和纯度，以保证后续的测序结果和分析结果的准确性。
文库质量控制的方法有多种，如琼脂糖凝胶电泳、荧光定量、质量评估等。
其中，质量评估是文库质量控制的重要步骤之一，它可以评估文库的质量和纯度，并确定文库的适用范围和测序深度。
基因组文库构建程序是基因组学研究中不可或缺的步骤之一。
开发高效、准确的基因组文库构建程序对于基因组学研究具有重要意义。
未来，随着基因组学研究的不断深入，基因组文库构建程序的研究和开发将会越来越重要。
第三章基因文库的构建
频率和6Kb
★
G
Chemically synthesized
oligonucleotide
★
Anneal
TCAGGCT
T
★
Wild-type
(1) (1) DNA polymerase + 4 dNTPs
(2) T4 DNA ligase + ATP
正链DNA的合成
按照体外
DNA重组技术,将待突变的DNA片
G
段插入到M13噬菌体上. 然后制备
平末端 连接
加接头造成 粘性末端
细菌转化
重组噬菌体 DNA转染
重组质粒 的转化
体外包装 进行转导
重组体 的鉴定
表型鉴定
核酸杂交
免疫学分析
酶切A，把 所得到的大量基因组DNA片段与载体连接， 然后转化到细胞中去，让宿主菌长成克隆。 是某个生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体。
SI核酸酶处理 Klenow 酶， 连接酶处理
16
一、缺失诱变 2、通过酶切图谱完成中间缺失
17
第三节：克隆DNA序列的体外诱变
二、盒式突变 1、原理：利用一段人工合成的具有突变序
列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的 相应序列。 2、人工合成的突变序列的特征
由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按 设计要求产生出克隆需要的粘性末端, 由于不存在 异源双链的中间体,因此重组质粒全部是突变体。
(1) Screen plaques with 32P-labelled oligonucleotide as hybridization probe; (2) Isolate mutant
2_二代测序DNA文库构建概述
二代测序DNA文库构建概述杂交捕获流程➢探针根据感兴趣的目标序列设计➢探针与目标序列互补，因而可进行特异性杂交➢实验的关键是探针和基因组DNA或cDNA的杂交，其特异性决定了靶向富集的效率检测变异类型：•Single nucleotide polymorphism (SNP) •Insertion/deletion (indel)•Copy number variation (CNV)•Gene Fusion二代测序文库构建流程DNA 样品*片段化核心步骤：➢末端修复➢加A尾➢接头连接*文库扩增文库产出测序文库构建概述（Illumina平台）Y 形测序接头原始DNA片段化DNA接头连接PCR 扩增DNA 插入片段文库构建步骤概述DNA 样本投入DNA片段化片段末端补平&加“A”尾测序接头连接片段大小筛选（可选）PCR文库富集DNA 文库产出建库时需要加入多少的DNA量呢？需要根据实际的应用及样本情况进行选择优化如何对DNA进行片段化？1、物理打断：通常使用超声来打断，如Covaris2、酶切打断：如KapaHyperplus文库构建试剂盒DNA片段末端补平、5`端磷酸化、3`端加“A”尾补平及磷酸化末端加“A”尾测序接头与DNA片段的连接通过磁珠纯化、文库片段大小选择（可选步骤）通过调节结合buffer的浓度，实现磁珠选择吸附不同大小的片段对两端都加上接头的文库通过PCR扩增？Primer 1Primer 2AA最终得到的文库起始DNA片段最终文库。
基因组DNA测序文库构建
基因组DNA测序文库构建1.对收到的DNA样品进行检测，取2-3ul样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含RNA或蛋白）的DNA样品需要柱纯化后重新检测。
对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。
对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无目的条带则无细菌基因组污染，若出现目的条带则存在污染，需要去除后建库。
2.用Qubit检测DNA样品浓度。
3.吸取部分DNA样品，用TE或Elution Buffer稀释，终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间，体积为130ul。
用Covaris破碎，破碎时请根据需要片段大小，按标准操作流程操作。
4.样品足够多的情况下，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。
5.对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul异丙醇）浓缩回收，加入50-100ulTE或Elution Buffer洗脱。
回收产物用Qubit测值。
6.修平和磷酸化100ul体系DNA 1ug5 X T4 polymerase buffer 20ulBSA (5mg/ml) 2ulATP (100mm) 1uldNTP（10mm）10ulT4 DNA Polymerase (5U/ul) 1ulKlenow（10U/ul）1ulT4 PNK (10U/ ul) 1.5ul22°C反应20min，柱式法纯化,50-100ul TE洗脱。
纯化后Qubit测值。
7.加‘A’100ul体系DNA 0.5-2.5ug10 X klenow buffer 10uldATP(10mm) 1-3ulKlenow(exon-)（5U/ul）1-3ul37°反应20min，柱式法纯化，50-100ul TE洗脱。
纯化后Qubit测值。
8.连接头200ul体系10 X T4 DNA ligase buffer 20ulPEG4000 30ulATP(100mm) 2ulDNA X接头 YT4 DNA ligase 1.5-2ul加水至 200ulDNA与接头的摩尔比约在1:3至1:10之间。
12-第十二讲--伦理艺术短片
例４：前苏联《狼爹牛仔》与《猫和老鼠》都表现了两种在 正常情 况下不可能成为朋友或能友好相处的双方便成了朋友，打成一伙 的朋友与父子关系，并且双方在 建立起同盟关系的 同时并肩作 战，对付“敌人” 表现了一种敌对关系的颠覆反传统观念。 以上整体表现了一种具体关系的变化，从原有的敌对关系 改变为现有的友好关系． 例５：美国《钢牙小鸡兵团》讲述一般弱小的小鸡变成了具有暴力 的钢牙小鸡，比一般所谓的小鸡更为强大一些，新观念的产生． 表现了认为弱小的对象他们也有可怕的一面，从过去的弱小 者走出来，不用再怜悯，不在是可怜的对象． 例６：日本《爱》讲述了女性地位的上升，男性地位的降低，而且 反差很大，把本是男性占统治地位的 社会改变了。 表现女性的解放，权利的上升趋势，新的男女关系产生。 以上所整体表现的是原来弱小，地位低的人群或动物开始 强大起来，不再受到怜悯与歧视。
㈠利己主义的批判（个人利益的表现，最后给他人所 造成的影响） 从利己主义的艺术短片中可以看出对利己的人 与所产生的后果进行批判，有些人可以控制自私一面， 在不影响他人的情况下生活，但不能控制的自私的的 人会对其他周围造成影响，用这样题材的影片反映对 利己主义的反感．
例1：加拿大的影片《弃婴》所讲述一个被抛弃的婴儿像传接 力棒一样，从 一家传到另一家，没有人收养他，哪怕只是 为了自己家的狗也不会收养，最后是两个流浪汉收养，有 能力抚养的人群没有收养，而被没有能力的 人收养。 批评没有社会责任，道义感，同情心的人群，宠物高于 人的思想。 例2：前苏联作品《一件罪案的发生》所讲述一个中年会计忙 碌后，回到家中想休息一下，但四方邻居由于自己的生活， 不理会他人的感受，任意去活动，有玩牌的，有跳舞的， 有吵架的，在不同的时间段都给这位已经很疲倦的人造成 了影响，直到清晨终于安静下来，没想到他刚要入睡时， 清洁女工又在窗外大声交谈，使他无法控制自己的情绪， 一气之下用铁锅大死了他们． 表现对损人利己的批判，只顾自己的生活，忽略了他 人的生活．
基因组文库构建的程序
基因组文库构建的程序
基因组文库构建的程序通常包括以下步骤：
1. DNA提取：从样品（比如细胞、组织、血液等）中提取DNA，并对其进行质量控制。
2. DNA片段化：将DNA样品通过不同的方式（比如随机切割、酶切等）分解成小片段，一般为200-800bp。
3. 处理DNA片段：对DNA片段进行多个步骤的处理，包括末端修复、加上适配器、文库大小筛选等。
4. PCR扩增：使用PCR技术通过适配器扩增DNA片段，以获得足够多的文库。
5. 纯化文库：对PCR扩增产生的文库进行纯化，以去除杂质。
6. 测序：利用高通量测序技术对文库进行测序，生成原始测序数据。
7. 数据处理：对原始测序数据进行序列质控、序列拼接、比对等处理，最终生成基因组序列。
常用的基因组文库构建程序有：TruSeq DNA Sample Preparation Kit（Illumina）、Nextera DNA Flex Library Prep Kit（Illumina）、KAPA HyperPlus Library Preparation Kit （Roche）等。
基因组文库的构建培训讲学
3) 保存单个克隆子于含有甘油的培养基 中
方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合 适的含抗生素的培养基中，菌体生 长到一定浓度后，加入终浓度为25% 的甘油，于-70 oC或-25 oC下保存。
缺点：需保存的列合成引物， 扩增特异性片段
结束语
谢谢大家聆听！！！
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• 对于高等真核生物而言，基因组DNA十 分庞大,基因可达数万个，且基因组成结 构复杂，除编码序列，还有非编码序列 及调控序列，基因间还存在大量的间隔 序列和重复序列，因此，单个目的基因 在整个基因组中所占的比例极其微小， 除少数例外，绝大多数基因难以克隆子的保存与筛选1、基因组DNA的保存1) 影印膜滤保存法
2）在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆 子转入含适当的抗生素培加的序列过多或过少。
（一）生物基因组DNA的提取 染色体DNA
（二）基因组DNA的不完全酶切
1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 a) 四个识别位点的限制酶出现的几率: 1/256 b) 六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/1024
2、分离目的酶切片段大小的确定 a) 克隆单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb
①载体DNA的制备； ②高纯度大相对分子质量基因组DNA的
提取和大片段的制备； ③高纯度大相对分子质量基因组DNA的
部分酶切与脉冲电泳分级分离； ④载体与外源片段的连接与转化或侵染
宿主细胞； ⑤重
基因重组
体外包装
转化细菌四、生物基因组DNA的构建一个理想的基因组DNA应具备下列条件： • 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力 • 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆 • 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆
第八章 DNA文库的构建
S1 核酸酶将连接处（仅该位点处为单链结构）切断 形成平端结构可以进行连接。
获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失
自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失
G 5‘ppp’5 G
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp NaOH 煮沸 5’
TTTTTTTTTTTTTTp
很多特殊的处理以及必要的仪器设备，尤其是构建插入片段较大的如 PAC 、 BAC 和 YAC 文
库，其成功的关键都体现载体的制备
② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取 ③ 高质量大相对分子质量 DNA 的部分酶切与脉 冲电泳分级分离（PFGE size selection）
2. mRNA 的丰度
高丰度 mRNA （abundant mRNA） 约有几十种, 5000拷贝/cell 珠蛋白 免疫球蛋白（immune globulin） 卵清蛋 白（egg albumin）
在特定细胞中占50-90%
中等丰度mRNA 1000-2000, 200-300拷贝/cell
实践表明，提取的基因组 DNA 分子量越大，所得 找最适的比例
在电转化和包装侵染过程中：
最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价 高且质量稳定的包装蛋白 研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显 地提高其效率 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同 插入片段的 DNA 的全部或部分基因的集合， 某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体 在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择 机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体）所有 阳性菌落（或噬菌
遗留在 5'-末端的一段很小的 mRNA 也被大肠杆 菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 5'--3' 核酸外切酶和 RNA 酶 H 降解，暴露出与第一链 cDNA 对应的 3'-端 部分序列。同时，大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 3'--5' 核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链 cDNA 的 3'-端部分消化掉，形成平端或差不多 的平端。这种方法合成的 cDNA 在 5'-端存在几 个核苷酸缺失，但 complementary DNA , cDNA）。 cDNA 是由生物的 某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体 外反转录后形成的双链 cDNA胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该 生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很 大差异。
如东县马塘中学高二生物 第十二讲 DNA是主要的遗传物质和DNA的结构
第十二讲 DNA 是主要的遗传物质和DNA 的结构一、考纲导读:1. 人类对遗传物质的探索过程。
B2. DNA 分子结构的主要特点。
B二、问题导思1．格里菲思、艾弗里的实验过程和结论分别是什么？艾弗里与赫尔希等人的实验设计思路有何共同之处？2．噬菌体侵染细菌实验分别用什么元素标记哪些化合物？实验过程？结果？结论分别是什么？噬菌体繁殖的原料、模板分别来自谁？3．生物的主要遗传物质是什么？为什么？病毒的遗传物质是什么？具有细胞结构的生物的遗传物质是什么？4．DNA 分子的化学组成是怎样的？结构的主要特点是什么？三、例题导练1.下列关于赫尔希和蔡斯用噬菌体侵染细菌的实验叙述，正确的是A.分别用含有32P 的噬菌体和含有的35S 噬菌体进行侵染实验B.用32P 标记噬菌体的蛋白质，用35S 标记噬菌体的DNAC.用含有充足有机物的完全培养基培养噬菌体D.该实验证明了DNA 是主要的遗传物质2．在噬菌体侵染大肠杆菌的实验中，分别用同位素31P 、32P 和32S 、35S 作如右标记：此实验得到的结果是子代噬菌体和亲代噬菌体的外形及侵染大肠杆菌的特性均相同，请分析：(1)子代噬菌体的DNA 分子中含有的上述同位素是___________________，原因是_______ __________________________ _________。
(2)子代噬菌体的蛋白质外壳中含有的上述同位素是_________________________，原因是__________________________________ ____。
(3)此实验结果证明了___________________________。
3．大肠杆菌DNA 分子结构示意图(片段)如图所示。
请据图回答问题：(1)图中1表示________，2表示______，1、2、3结合在一起的结构叫________。
(2)3有________种，中文名称分别是________。
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基因组DNA
限制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因组Hale Waihona Puk过建立叠连群(conti一般来说，DNA片段长，完整基因组文 库所含的克隆数越少。反之，越多。 基因组越大，应包含的克隆数越多， 反之，越少。
oligo(dG)引导合成全长dscDNA
载体引导合成全长dscDNA
置换法合成某种生物体特定组织、特 定发育阶一个基因都存在于完全的基因组文 库中，并不受生物组织或发育时期的影响。
根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷 酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成 第一链cDNA的引物。
在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合 成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而 不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。
4.3 第二链cDNA的合成 • cDNA第二链的合成就是将上一步形成的 mRNA:cDNA杂合双链变成互补双链cDNA 的过程。 • cDNA第二链的合成的方法大致4种： 自身引导合成法 置换合成法 引导合成法 引物－衔接头合成法
转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序
列的结构与功能。基因组DNA与cDNA的比较基因组DNA
cDNA
基因重组
4.1 细胞总RNA的提取和mRNA的分离 RNA： tRNA、rRNA、mRNA(1%—5%）
真核生物的mRNA具有一个polyA的3’末端， 可以被用于mRNA的分离；
oligo(dT):polyA 杂交链在高盐离子浓度下可 以保持，在低盐离子浓度下或较高温度下就会 分开，利用这一性质从RNA中分离纯化mRNA。
⑵基因组DNA的片段化 ①酶切 部分酶切的主要目的小孔喷射 超声波处理 高速搅拌
⑶载体的制备 要求： 载体的去磷酸化处理 载体的纯度
⑷重组连接 按照连接酶催化反应的最适条件设置反 应体系，同时还应通过预备性实验确立反 应体系具体的参数。
4.2 cDNA第一链的合成 ① oligo(dT)引导的DNA合成法 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的 特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的 oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一 链。
②随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis)
RNase H ：特异水解与DNA 杂交的RNA上的磷酸 二酯键，产生带有3‘—OH和5’—P的产物
③引导合成法
library
导致cDNA不完整的原因： ①cDNA第二链合成中聚合酶的外切核酸酶活性
)
② mRNA的降解，它容易从5‘端降解。起始生物材 料、抽提和纯化过程中RNase的污染、机械断裂. ③反转录酶的合成特性 与mRNA的分子结构有关 与反转录酶从转录复合体上脱离有关
cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有A的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆， 所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的 cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难； 从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非
⑸噬菌体离体包装 ⑹中复制增殖造成有些克隆丢失，有的 增加，有的减少。⑵的筛选 噬菌斑原位杂交 PCR筛选
5 基因组DNA构建的程序 (噬菌体基因组的构建) ⑴基因组DNA的分离制备 不同来源的DNA制备方法不同。 一般来说，有液相法和固相法两种。 液相法提取的DNA长度一般在100kb左右， 基本可以满足构建各种小插入片段基因组文 库的要求。
大相对分子质量(high molecular weight,HMW) 基因组D部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子， 在该重组子群集中包含了其全部特别适合某些病毒 基因组结构克隆对应一种mRNA序列，这样在 目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较 低，因此阳性的杂交信号一般都是有意义的， 由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因序 列。 ⑷可以在原核中表达。
①自身引导合成法
获得的单链cDNA3’端会形成发夹结构的能力， 以此作为第二链合成的引物，在大肠杆菌聚合 酶I Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的 第二链。
②置换合成法 以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作 为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA 链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物， 在大肠杆菌DNA聚合酶I 的作用下合数不宜过大，以减轻筛选工作的压力
• 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克 隆； • 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克 隆排序；
• 克隆片段易于从载体分子上完整卸下；
• 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。基因组和cDNA的构 建第一节
基因组的构建1 基因组(genomielibrary):
将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后 所获得的重组子群体的总称。过产 生一系列一定大小、覆盖全基因组的DNA 片段的重组cDNA分子反映来源细胞 中表达信息的完整性。 3.2 重组cDNmRNA； ⑶ cDNA的合成； ⑷ 黏性末端片段与载体的连接； ⑸ 离体包装获得重组噬菌体； ⑹
基因重组
体外包装不同的基因， 但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，有 15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同 的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克 隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得 多。