第4章微生物生长

稀释平板计数法—固体培养法
第一步：菌样巧妙稀释
1mL 混合
1mL
混合
无菌水
1 9mL 10mL ： 10-1 10-1 ：
菌样被 无菌水 不同稀 释倍率 -2 10 后平板 培养图 得到不同 稀释度 （10-x） 菌液
10-2
10-3
10-4
10-5
第二步：接种平板
10-2 10
-3
10-4
10 -5
2、对数期（指数期）log phase 细菌生长速度达到最大，数量以几何级数增加。 特点： （1）细菌迅速分裂，菌数按几何级数增加；
（2）世代时间最短，而且恒定； （3）生长速度最高而且恒定； （4）代谢活力强无死亡； （5）菌体整齐，体积恢复到原来大小； （6）对环境敏感，生理性状及菌体成分较一致
度提高1倍；
（2）营养；营养越丰富，代时越短
（3）氧气。好氧菌若能供给充足的氧，可能使对数 期延长。
对数期的实践意义 ① 是代谢、生理研究的良好材料
② 是增殖噬菌体的最适宿主菌龄
③ 是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄 ④ G+染色鉴定时采用此期微生物
3、稳定期（stationary phase） 由于营养消耗，供应不足及代谢产物的积累，这 时一部分菌死亡，细菌进入稳定期。
（6）对环境变化敏感
影响因素： （1）接种量。接种 量大，停滞期可缩短 （2）菌龄。菌种年 轻，对数生长期接种 ，停滞期可能很短甚 至不明显 （3）营养。如果种子培养基与新接种的培养基成分 相同，则对菌生长有利。从丰富培养基转入贫营养 基，停滞时间拉长，反之减少； （4）菌种特性。大肠杆菌停滞期长，分枝杆菌长
膜过滤培养法
当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样 品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形 成的菌落进行统计。
以数量变化对微生物生长情况进行测定 3、菌落计数（平板菌落）计数法

统计－查表－计算 ②查表 根据不同稀释度变黑试管 ①统计出数量指标 三位数及其中最低稀释度
红 血 球
样品溶液与等体积的血液混合
涂片
细 提问：如果平均每个视野中细菌数量/红血球 菌 的数量比例为5.5：1，则细菌数量=？
5.5×400万个/m l =2.2×107个/mL样品
2、薄膜计数法：如果测定量大而含菌浓度很低的样品
（如空气、水）中的活菌数，可将样品用微孔薄膜
（硝化纤维素薄膜）过滤，再与膜一起放到培养基或 浸透培养液支持物表面培养。
4、衰亡期 decline phase 由于营养缺乏和代谢产物积累造成自身中毒， 细胞生长受阻，时间和菌数对数呈反比，生长曲线 直线下降。 特点： （1）生长速率为负值，活菌数减少； （2）细菌发生自溶现象autolysis （3）代谢产物大量积累； （4）形态多变，出现畸形或衰退形。
4.3.2 连续培养 原理：如果在培养器中不断补充新鲜营养 物质并及时不断地以同样速度排出培养物，理论上 讲，对数生长期可以无限延长。 1、恒浊连续培养 不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定 的培养方法。根据培养器内微生物的生长密度，并
各 取 1ml ， 均 匀 涂 布 于 冷固体培养基平板上或 与温热液态固体培养基 混合冷却。 第三步：培养 每一个细菌会生成一个 菌落
稀 释 过 低 菌 落 集 无 计数
度 ， 密 法
可以计数 ，但数量 过多，费 时费力
数量合 适，统 计计算， 作为结 果
数量太少 ，误差因 素太大， 不做计数


表——MPN表
（取变黑的管数最多、稀释度又最低的生长管数，为 第一位数字，后面两个稀释度的生长管数后两位数）
（三） 计算生长量：测细菌重量
（1） 测细胞干重：一般干重为湿重的20-25%。收集 单位体积培养液中菌体，干燥器内加热或减压干燥， 直接用仪器测定。
（2） 测细胞含N量确定细胞浓度： 凯氏定氮法测N，总蛋白含量=含N量%×6.25 （3） 通过DNA测定计算浓度： 荧光法，每个菌平均含DNA 8.4×10-5ng （4） 生理指标： 测定微生物对氧的吸收、发酵糖产酸量或二氧化碳 产量。
微 生 物 生 长 测 量 方 法
个体计数法 重 量 法
生理指标法
一、测微生 物总数 1、计数器直 接计数 利用血球计 数板，在显
微镜下计算
一定容积里 样品中微生 缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度；
物的数量。
个体小的细菌在显微镜下难以观察；
2、电子计数器计数（略） 3、染色涂片计数
稀释液体计数法


特点：液体培养、统计学查表计数
又称MPN法 （或最可能数法） Most Probable Number 例如测定SRB（硫酸盐还原菌，厌氧）的数量 提问：能用稀释平板法计数吗？为什么？
一般不能，厌氧菌暴露在空气中不能生长（除非厌氧培 养箱） 对这类菌可以利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征进 行深层隔氧液体培养，按MPN法进行计数。
4.1 微生物生长的概念

2.微生物个体生长 表现为个体质量和体积的增加。
3.微生物群体生长 以微生物细胞的数量或微生物群体细胞物质量的增 加作为生长的指标。

个体生长→个体繁殖→群体生长 群体生长＝个体生长＋个体繁殖
4.1 微生物生长的概念
因而要了解微生物的生长规律，就要了解
微生物的个体生长和群体生长两个方面。
世代时间的计算：
x2=x1· 2n
以对数表示：lgx2=lgx1+nlg2
生长速率常数
平均世代时间
世代：由1个细胞分裂成为2个细胞的间隔被
称为世代。
代时：就是一个世代所需的时间，因而也就
是群体细胞数目扩大1倍所需的时间，有时也 被称为倍增时间。
影响因素： （ 1 ）温度。在适温范围内，每增加 10℃，生长速
第 4 章 微生物的生长
内容提要

微生物生长的概念 微生物生长量的测定 微生物的群体生长规律 环境因素对微生物生长的影响
4.1 微生物生长的概念



1.微生物的生长 一个微生物细胞在合适的外界环境条件下，不断地吸收营养 物质，并按其自身的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用 的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量、体积、 大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是 一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达 到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这 时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体 的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其重量、 体积、密度或浓度作指标来衡量。 微生物的生长表现在微生物的个体生长与群体生长两个水平 上。
成正比，因此测定悬液的光密度就可以反映细胞浓度。 将未知细胞数的悬液与已知细胞数悬液相比来计数。 5、比例计数法 将菌液与等体积血液混合后涂片，计算细菌数与红
细胞比例。根据比例来计数
比浊计数法

浊——细菌悬浮液的浊度
细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量 成正比
以生物量为指标测定微生物的生长 比浊法
借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密 度高、生长速度恒定的微生物细胞 。
恒浊连续培养 可以不断提供具 有一定生理状态 的细胞，可以得 到以最高生长速 率进行生长的培 养物，在微生物 工业上运用此法 可得到大量菌体 及相应的代谢产 物如乳酸、乙醇。
在一定波长下，测定菌悬液的光密 度，以光密度(optical density, 即 O.D.) 表示菌量。
实验测量时应控制在菌浓度与 光密度 成正比的线性范围内，否则不 准确。
5.比浊法
（二） 测定活菌数
1、液体稀释培养基计数：
将待测样品作连续10倍稀释，一直稀释到稀释液的少量接种到 新鲜培养基中没有或极少生长。记录每个稀释度出现生长的 试 管 数 ， 再 用 最 大 或 然 率 理 论 ， 查 MPN （ most probable number，最大可能数量）表，根据样品的稀释倍数就可计算 出其中的活菌含量。
主要适用于只能进行液体培养的微生 物，或采用液体鉴别培养基进行直接 鉴定并计数的微生物。
对未知样品进行十倍稀释，然后根据估算取三个连续的稀释度 平行接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况进行统 计，长菌的为阳性，未长菌的为阴性，然后根据数学统计计算 出样品中的微生物数目。
比例计数法

比例——样品菌液与等体积的血液混合，观测二者比例 红血球数已知 (男性 400~500万个／ml，女性 350~450 万个／ ml)， 平均400万个/ml
将已知体积的待测材料均匀涂布在载玻片的已
知面积内，染色后显微镜下计数。一般 1cm2 均匀 涂片 0.01ml 样品。选择几个至十几个视野计数细 胞数量。借助镜台测微尺测直径可计算出视野的 直径： 每 ml 总数 = 视野平均菌数×1 cm2/ 视野面积 ×100×稀释倍数
涂片染色法
0．01ml 菌液均匀涂布，染色
稳定期到来的原因主要是： ①营养物尤其是生长限制因子的耗尽；
②营养物的比例失调，例如C／N比值不合适等；
③酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积；
④pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。
特点： （1）菌数达到最高峰；
（2）活菌数达到动态平衡； （3）生长速率为零； （4）开始积累贮存物质
影响因素： （1）前期主要是营养，补充营养可延长静止期； （2）后期主要是代谢产物的积累； （3）离子、pH等物化条件失去平衡
一般计数平板的细菌生长菌落数以30~300个为 宜。 平


第四步：均
计数
细菌数量=？ 细菌数量=数出的菌落数/稀释度 例如：10-5稀释度时菌落数为125个 细菌数量=125/10-5=1.25×107个/mL 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法 如国标法水中细菌总数的测定 。 注意：作空白及取平行样（2～3组）均值减小误差