宏基因组功能基因筛选
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
宏基因组功能基因的筛选
WCX 2019年3月17日
目录
❖ 宏基因组简介 ❖ 宏基因组的常用研究方法
➢ 16S (18S) rDNA测序 ➢ 宏基因组文库
—功能基因筛选（策略一）
❖ 宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
宏基因组（Metagenome）
• Metagenome作为一个新名词最初由美国科学家 Handelsman 及其研究组于2019年提出，定义为 “the Genomes of the Total Microbiota Found in Nature”， 即指任何特定环境样品中全部微生物 遗传物质的总和, 并且目前主要是指环境样品中细 菌和真菌基因组的总和。
ORFeome的用途
得到生物体的ORFeome后，通过高通量诱导ORF 表达，利用“功能驱动筛选”，筛选得到相应的功能基因
高通量检测、筛选
功能基因、新型酶
✓16S rDNA指的是细菌基因组中编码核糖体16S rRNA 分子的对 应的DNA序列，也就是16S rRNA 的编码基因。其长度大约为 1500 bp
✓通过16S rDNA的测序，可以分析环境的群落构成，以及进行细 菌的分类和进化分析。
细菌16S rRNA的V3或V6区的测序分析
Ashelford 等（2019）通过对4383个细菌16S rDNA的序列 进行比对分析，表明16S rDNA 全长序列中包含9个可变区 （V1-V9）和10个保守区。其中保守区反映生物物种间的亲 缘关系，可变区则表明物种间的差异。
Metagenomic library
sequence
Screen for specific sequences by PCR or hybridisation
SIGEX
Functional screening for expression of particular phenotype
细菌16S rRNA的测序分析
三种筛选方法的比较
目录
❖ 宏基因组简介 ❖ 宏基因组的常用研究方法
➢ 16S (18S) rDNA测序
➢ 宏基因组文库
—功能基因筛选（策略一）
❖ 宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
宏基因组测序
宏基因组DNA提取 Illumina 高通量测序
组学系统分析
高通量基因克隆
利用测序结果，经序列比对分析， PCR直接扩增、克隆相关功能基因
➢ 异位裂解法：采用物理方法将微生物细胞从土壤中分离出来, 然后采 用较温和的方法抽提DNA, 如先采用尼可登介质密度梯度离心分离微 生物细胞, 然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解, 脉冲场凝胶电泳回收 DNA。 可获得大片段DNA (20～500 kb) 且纯度高, 但操作繁琐, 成本高, 有 些微生物在分离过程中可能丢失, 温和条件下一些细胞壁较厚的微生 物DNA难以抽提出来。
此方法的优点是可能筛选获得某一类结构或功能的蛋白 质中的新分子，且能利用基因芯片技术大大提高筛选效率， 缺点是必须对相关基因序列有一定的预先了解，较难发现全 新的活性物质及其功能编码基因。
功能驱动筛选
生物活性水平的筛选，即根据重组克隆产生的新活性进行 功能筛选。采用各种活性检测手段检测筛选分离阳性克隆子， 结合生化分析和插入片段序列分析，进而对其进行深入研究。
高通量筛选 High Throughput
Screening
宿主Host
环境样品DNA制备
➢ 原位裂解法：将土壤样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理, 继而抽提纯 化。 此法操作容易、成本低、DNA提取率高、偏差小, 但由于强烈的 机械剪切作用, 所提取的DNA片段较小(1-50 kb)，且腐殖酸类物质也 难以完全去除。
高通量克隆ORF ——The Gateway® system
Gateway技术原理
Gateway克隆技术是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染 色体之间发生的λ嗜菌体位点特异重组系统的重组整合 与切出反应（attB x attP →attL x attR）BP和LR两个 反应构成的。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克 隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门 克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载 体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转 移目的序列到一个或更多个目的载体。
screening），即底物诱导基因筛选，其基本原理 为：代谢相关基因通常由相应的化合物（如底物或 者代谢）诱导表达。因此，通过建立特定的宏基因 组文库，利用流式细胞仪，筛选受一定底物诱导、 与载体中的特定标签（如GFP）共表达的克隆子， 就能够筛选到相应的代谢基因。
利用特殊载体，建立宏基因组文库，通过流式细
胞术，实现功能基因的高通量筛选
Uchiyama et al.,Nature,2009
SIGEX载体特点
➢一种操作子捕获 (operon trap) 载体 ➢多拷贝，稳定性好 ➢含有一个标记基因（如gfp），能够与受底物诱导的操作子
基因片段共表达 ➢标记基因前有自身可诱导启动子，能够检测自连的载体； ➢标记基因前有RBS位点和起始密码子，避免形成融合蛋白
入 门载体后，可以很容易将它转移到任何目的载体， 创建各种各种各样的表达克隆
The Gateway® system 克隆ORFeome
利用The Gateway® system 的高通量、快捷、方便等特点，可以克 隆得到生物体的ORFeome，即全部编码蛋白质的ORF组成
Brandner et al., BMC Genomics,2019
载体
➢ 一般选用质粒、粘粒或者Fosmid 载体来构建文库，其插入片 断小于40kb, 对生物合成比较复杂的化合物，因其基因簇较大 ，则无法完整克隆。
➢ 细菌人工染色体（BAC）载体能克隆100 kb以上的大插入片断 ，完全有可能克隆到完整的代谢基因簇途径，但是其拷贝数目 和表达量低。因而可选择和改进已有的穿梭 BAC 载体来构建 文库，达到其拷贝数量可以诱导控制的目的，在必要时可诱导 增加载体拷贝数以获得大量DNA进行亚克隆和序列分析。
缺点
➢不能筛选组成型表达的基因 ➢仅针对能进入细胞质的底物 ➢仅适用于插入片段带有自身启动子的情况 ➢出发菌株须与宿主菌株近缘 ➢T载体容量有限，>10kb的基因或操纵子难以克隆 ➢与GFP反向插入的目的基因将漏检 ➢目的基因与GFP之间有转录终止子的情况将漏检
Yun and Ryu，Microbial Cell Factories，2019
通过设计特异的PCR引物，扩增得到ITS序列，然后两端加上接头，便可利 用Illumilla的高通量测序技术对ITS进行测序分析，以获得环境样品中真菌 等的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。
宏基因组文库
环境样品
宏基因组文库的构建 抽提DNA 克隆(多种载体) 转化适宜宿主细菌(如大肠杆菌)
BP和BL反应
Matsuyama and Yoshida，2009
Gateway 技术优点
不需要传统的酶切、连接方法 利用位点特异性重组，省时省力,可以实现高通量克隆 利用了ccdB选择方法，以确保高效率的分离重组克隆,
典型的效率是>95% 在目的基因（或者开放阅读框(ORF)克隆进Gateway®
如可在各种选择性平板上通过可见性状筛选产生脂酶、淀 粉酶等活性克隆子。本策略能够直接发现全新的活性物质和功 能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子，但工作量大 ，效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。
SIGEX
SIGEX（Substrate-induced gene-expression
Chakravorty 等（2019）总结16S rDNA 的序列，及其中 九个9个可变区和10Leabharlann Baidu保守区的位置和长度，并指出不同的 可变区适合不同菌群的鉴定分析。其中V3（约60 bp）和V6 区（约70 bp）可以分别用来鉴定大多数细菌。
16S rDNA
➢通过设计特异的PCR引物，扩增得到V3或V6区的序列，然 后两端加上接头，便可利用Illumilla的高通量测序技术对V3或 V6区进行测序分析，以获得环境样品中细菌等物种分类、物 种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。
Metagenome VS Genome
目录
❖ 宏基因组简介 ❖ 宏基因组的常用研究方法
➢ 16S (18S) rDNA测序
➢ 宏基因组文库
—功能基因筛选（策略一）
❖ 宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
Metagenomics involves constructing DNA libraries from environmental DNA
Uchiyama et al.,Nature,2009
SIGEX筛选流程
Yun and Ryu，Microbial Cell Factories，2019
SIGEX的优点和缺点
优点
➢能够筛选到新的代谢相关基因 ➢诱导底物不需要经过特殊修饰 ➢避免了引入酶切位点的麻烦和切断目的基因的可能 ➢ 结合流式细胞术，适于高通量克隆和筛选
Environmental sample
Extract metagenomic DNA
Construct 16S (18S) rRNA gene library using PCR
Clone into vector
eg plasmid, cosmid
phosmid, BAC
Introduce into host eg E. coli
宏基因组文库的分析
宏基因组文 库
Metagenomic Library
通过PCR 或者杂 交筛选特定序列
SIGEX
通过功能筛选特 定表型的阳性克
隆
基于宏基因组分离筛选功能基因 的四个技术要素
载体 Vector
环境样品DNA制备 DNA Preparation
自然产品筛选平台
Natural Product Discovery Platform
宿主
已报道的宏基因文库构建绝大多数采用cosmid、BAC或 fosmid为载体，其功能筛选宿主局限于大肠杆菌，但大肠 杆菌并不是一个很理想的高效表达外源基因的宿主细菌, 因而构建广宿主或穿梭宏基因组文库在充分挖掘和筛选功 能新基因的研究中尤为重要。
序列驱动筛选
基于DNA序列水平的筛选。根据某些已知的相关功能基 因的保守序列或相似序列设计杂交探针或PCR引物，通过杂交 或PCR扩增筛选阳性克隆子。
真菌ITS的高通量测序分析
➢ITS(Internal Transcribed Spacers )，即核糖体内转录间隔 区 ，是位于 28S rDNA的3’端与 18S rDNA的 5’端之间的序列 ➢ITS常用于真菌的分类研究，其长度一般为650-750 bp ➢ITS包含ITS1和ITS2两个区域。其中ITS1 位于 18S rDNA和 5.8S rDNA之间，ITS2位于 5.8S rDNA和 28S rDNA之间
ITS 1 和ITS 2 是中度保守区域, 其保守性基本上表现为种内相对一 致,种间差异比较明显。IT S 的序列分析能实质性地反映出属间、 种 间以及菌株间的碱基对差异,此外ITS 序列片段较小、 易于分析, 目 前已被广泛应用于这种特点使ITS 适合于真菌物种的分子鉴定以及属 内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。
WCX 2019年3月17日
目录
❖ 宏基因组简介 ❖ 宏基因组的常用研究方法
➢ 16S (18S) rDNA测序 ➢ 宏基因组文库
—功能基因筛选（策略一）
❖ 宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
宏基因组（Metagenome）
• Metagenome作为一个新名词最初由美国科学家 Handelsman 及其研究组于2019年提出，定义为 “the Genomes of the Total Microbiota Found in Nature”， 即指任何特定环境样品中全部微生物 遗传物质的总和, 并且目前主要是指环境样品中细 菌和真菌基因组的总和。
ORFeome的用途
得到生物体的ORFeome后，通过高通量诱导ORF 表达，利用“功能驱动筛选”，筛选得到相应的功能基因
高通量检测、筛选
功能基因、新型酶
✓16S rDNA指的是细菌基因组中编码核糖体16S rRNA 分子的对 应的DNA序列，也就是16S rRNA 的编码基因。其长度大约为 1500 bp
✓通过16S rDNA的测序，可以分析环境的群落构成，以及进行细 菌的分类和进化分析。
细菌16S rRNA的V3或V6区的测序分析
Ashelford 等（2019）通过对4383个细菌16S rDNA的序列 进行比对分析，表明16S rDNA 全长序列中包含9个可变区 （V1-V9）和10个保守区。其中保守区反映生物物种间的亲 缘关系，可变区则表明物种间的差异。
Metagenomic library
sequence
Screen for specific sequences by PCR or hybridisation
SIGEX
Functional screening for expression of particular phenotype
细菌16S rRNA的测序分析
三种筛选方法的比较
目录
❖ 宏基因组简介 ❖ 宏基因组的常用研究方法
➢ 16S (18S) rDNA测序
➢ 宏基因组文库
—功能基因筛选（策略一）
❖ 宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
宏基因组测序
宏基因组DNA提取 Illumina 高通量测序
组学系统分析
高通量基因克隆
利用测序结果，经序列比对分析， PCR直接扩增、克隆相关功能基因
➢ 异位裂解法：采用物理方法将微生物细胞从土壤中分离出来, 然后采 用较温和的方法抽提DNA, 如先采用尼可登介质密度梯度离心分离微 生物细胞, 然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解, 脉冲场凝胶电泳回收 DNA。 可获得大片段DNA (20～500 kb) 且纯度高, 但操作繁琐, 成本高, 有 些微生物在分离过程中可能丢失, 温和条件下一些细胞壁较厚的微生 物DNA难以抽提出来。
此方法的优点是可能筛选获得某一类结构或功能的蛋白 质中的新分子，且能利用基因芯片技术大大提高筛选效率， 缺点是必须对相关基因序列有一定的预先了解，较难发现全 新的活性物质及其功能编码基因。
功能驱动筛选
生物活性水平的筛选，即根据重组克隆产生的新活性进行 功能筛选。采用各种活性检测手段检测筛选分离阳性克隆子， 结合生化分析和插入片段序列分析，进而对其进行深入研究。
高通量筛选 High Throughput
Screening
宿主Host
环境样品DNA制备
➢ 原位裂解法：将土壤样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理, 继而抽提纯 化。 此法操作容易、成本低、DNA提取率高、偏差小, 但由于强烈的 机械剪切作用, 所提取的DNA片段较小(1-50 kb)，且腐殖酸类物质也 难以完全去除。
高通量克隆ORF ——The Gateway® system
Gateway技术原理
Gateway克隆技术是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染 色体之间发生的λ嗜菌体位点特异重组系统的重组整合 与切出反应（attB x attP →attL x attR）BP和LR两个 反应构成的。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克 隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门 克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载 体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转 移目的序列到一个或更多个目的载体。
screening），即底物诱导基因筛选，其基本原理 为：代谢相关基因通常由相应的化合物（如底物或 者代谢）诱导表达。因此，通过建立特定的宏基因 组文库，利用流式细胞仪，筛选受一定底物诱导、 与载体中的特定标签（如GFP）共表达的克隆子， 就能够筛选到相应的代谢基因。
利用特殊载体，建立宏基因组文库，通过流式细
胞术，实现功能基因的高通量筛选
Uchiyama et al.,Nature,2009
SIGEX载体特点
➢一种操作子捕获 (operon trap) 载体 ➢多拷贝，稳定性好 ➢含有一个标记基因（如gfp），能够与受底物诱导的操作子
基因片段共表达 ➢标记基因前有自身可诱导启动子，能够检测自连的载体； ➢标记基因前有RBS位点和起始密码子，避免形成融合蛋白
入 门载体后，可以很容易将它转移到任何目的载体， 创建各种各种各样的表达克隆
The Gateway® system 克隆ORFeome
利用The Gateway® system 的高通量、快捷、方便等特点，可以克 隆得到生物体的ORFeome，即全部编码蛋白质的ORF组成
Brandner et al., BMC Genomics,2019
载体
➢ 一般选用质粒、粘粒或者Fosmid 载体来构建文库，其插入片 断小于40kb, 对生物合成比较复杂的化合物，因其基因簇较大 ，则无法完整克隆。
➢ 细菌人工染色体（BAC）载体能克隆100 kb以上的大插入片断 ，完全有可能克隆到完整的代谢基因簇途径，但是其拷贝数目 和表达量低。因而可选择和改进已有的穿梭 BAC 载体来构建 文库，达到其拷贝数量可以诱导控制的目的，在必要时可诱导 增加载体拷贝数以获得大量DNA进行亚克隆和序列分析。
缺点
➢不能筛选组成型表达的基因 ➢仅针对能进入细胞质的底物 ➢仅适用于插入片段带有自身启动子的情况 ➢出发菌株须与宿主菌株近缘 ➢T载体容量有限，>10kb的基因或操纵子难以克隆 ➢与GFP反向插入的目的基因将漏检 ➢目的基因与GFP之间有转录终止子的情况将漏检
Yun and Ryu，Microbial Cell Factories，2019
通过设计特异的PCR引物，扩增得到ITS序列，然后两端加上接头，便可利 用Illumilla的高通量测序技术对ITS进行测序分析，以获得环境样品中真菌 等的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。
宏基因组文库
环境样品
宏基因组文库的构建 抽提DNA 克隆(多种载体) 转化适宜宿主细菌(如大肠杆菌)
BP和BL反应
Matsuyama and Yoshida，2009
Gateway 技术优点
不需要传统的酶切、连接方法 利用位点特异性重组，省时省力,可以实现高通量克隆 利用了ccdB选择方法，以确保高效率的分离重组克隆,
典型的效率是>95% 在目的基因（或者开放阅读框(ORF)克隆进Gateway®
如可在各种选择性平板上通过可见性状筛选产生脂酶、淀 粉酶等活性克隆子。本策略能够直接发现全新的活性物质和功 能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子，但工作量大 ，效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。
SIGEX
SIGEX（Substrate-induced gene-expression
Chakravorty 等（2019）总结16S rDNA 的序列，及其中 九个9个可变区和10Leabharlann Baidu保守区的位置和长度，并指出不同的 可变区适合不同菌群的鉴定分析。其中V3（约60 bp）和V6 区（约70 bp）可以分别用来鉴定大多数细菌。
16S rDNA
➢通过设计特异的PCR引物，扩增得到V3或V6区的序列，然 后两端加上接头，便可利用Illumilla的高通量测序技术对V3或 V6区进行测序分析，以获得环境样品中细菌等物种分类、物 种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。
Metagenome VS Genome
目录
❖ 宏基因组简介 ❖ 宏基因组的常用研究方法
➢ 16S (18S) rDNA测序
➢ 宏基因组文库
—功能基因筛选（策略一）
❖ 宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
Metagenomics involves constructing DNA libraries from environmental DNA
Uchiyama et al.,Nature,2009
SIGEX筛选流程
Yun and Ryu，Microbial Cell Factories，2019
SIGEX的优点和缺点
优点
➢能够筛选到新的代谢相关基因 ➢诱导底物不需要经过特殊修饰 ➢避免了引入酶切位点的麻烦和切断目的基因的可能 ➢ 结合流式细胞术，适于高通量克隆和筛选
Environmental sample
Extract metagenomic DNA
Construct 16S (18S) rRNA gene library using PCR
Clone into vector
eg plasmid, cosmid
phosmid, BAC
Introduce into host eg E. coli
宏基因组文库的分析
宏基因组文 库
Metagenomic Library
通过PCR 或者杂 交筛选特定序列
SIGEX
通过功能筛选特 定表型的阳性克
隆
基于宏基因组分离筛选功能基因 的四个技术要素
载体 Vector
环境样品DNA制备 DNA Preparation
自然产品筛选平台
Natural Product Discovery Platform
宿主
已报道的宏基因文库构建绝大多数采用cosmid、BAC或 fosmid为载体，其功能筛选宿主局限于大肠杆菌，但大肠 杆菌并不是一个很理想的高效表达外源基因的宿主细菌, 因而构建广宿主或穿梭宏基因组文库在充分挖掘和筛选功 能新基因的研究中尤为重要。
序列驱动筛选
基于DNA序列水平的筛选。根据某些已知的相关功能基 因的保守序列或相似序列设计杂交探针或PCR引物，通过杂交 或PCR扩增筛选阳性克隆子。
真菌ITS的高通量测序分析
➢ITS(Internal Transcribed Spacers )，即核糖体内转录间隔 区 ，是位于 28S rDNA的3’端与 18S rDNA的 5’端之间的序列 ➢ITS常用于真菌的分类研究，其长度一般为650-750 bp ➢ITS包含ITS1和ITS2两个区域。其中ITS1 位于 18S rDNA和 5.8S rDNA之间，ITS2位于 5.8S rDNA和 28S rDNA之间
ITS 1 和ITS 2 是中度保守区域, 其保守性基本上表现为种内相对一 致,种间差异比较明显。IT S 的序列分析能实质性地反映出属间、 种 间以及菌株间的碱基对差异,此外ITS 序列片段较小、 易于分析, 目 前已被广泛应用于这种特点使ITS 适合于真菌物种的分子鉴定以及属 内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。