凝胶测试方法

当利用半透膜把两种不同浓度的溶液隔开时，浓度较低的溶液中的溶剂(如水)自动地透过半透膜流向浓度较高的溶液，直到化学位平衡为止的现象。

让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径有粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。当聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子被排除在粒子的小孔之外，只能从粒子间的间隙通过，速率较快；而较小的分子可以进入粒子中的小孔，通过的速率要慢得多。经过一定长度的色谱柱，分子根据相对分子质量被分开，相对分子质量大的在前面（即淋洗时间短），相对分子质量小的在后面（即淋洗时间长）。自试样进柱到被淋洗出来，所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分子量有关，分子量愈大，其淋出体积愈小。

凝胶渗透层析就是按照溶质分子的大小不同而进行分离的一种层析技术。当溶质分子大小不同的样品溶液通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛效应，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。分子量大的因不易渗入网络，被排阻在颗粒之外，因而所受到的阻滞作用小，1.凝胶颗粒2.中分子3.小分子4.大分子先流出层析床，分子量小的因能渗透到网络图1、凝胶渗透层析原理示意图内部洗脱流程长，因而所受到的阻滞作用大，后流出层析床，这样就可以达到分离的目的。

凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。

凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

GPC是液相色谱的一个分支，其分离部件是一个以多孔性凝胶作为载体的色谱柱，凝胶的表面与内部含有大量彼此贯穿的大小不等的空洞。色谱柱总面积Vt由载体骨架体积Vg、载体内部孔洞体积Vi和载体粒间体积V0组成。GPC的分离机理通常用“空间排斥效应”解释。待测聚合物试样以一定速度流经充满溶剂的色谱柱，溶质分子向填料孔洞渗透，渗透几率与分子尺寸有关，分为以下三种情况：（1）高分子尺寸大于填料所有孔洞孔径，高分子只能存在于凝胶颗粒之间的空隙中，淋洗体积Ve=V0为定值；（2）高分子尺寸小于填料所有孔洞孔径，高分子可在所有凝胶孔洞之间填充，淋洗体积Ve=V0+Vi为定值；（3）高分子尺寸介于前两种之间，较大分子渗入孔洞的几率比较小分子渗入的几率要小，在柱内流经的路程要短，因而在柱中停留的时间也短，从而达到了分离的目的。当聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子被排除在粒子的小孔之外，只能从粒子间的间隙通过，速率较快；而较小的分子可以进入粒子中的小孔，通过的速率要慢得多。经过一定长度的色谱柱，分子根据相对分子质量被分开，相对分子质量大的在前面（即淋洗时间短），相对分子质量小的在后面（即淋洗时间长）。自试样进柱到被淋洗出来，所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分子量有关，分子量愈大，其淋出体积愈小。分子的淋出体积为：

Ve=V0+KVi (K为分配系数0≦K≦1，分子量越大越趋于1) (1)

对于上述第（1）种情况K=0，第（2）种情况K=1，第（3）种情况0

3.体积排除色谱法（SES）（也称凝胶渗透色谱法（GPC））

当高分子溶液通过填充有特种多孔性填料的柱子时，溶液中高分子因其分子量的不同，而呈现不同大小的流体力学体积。柱子的填充料表面和内部存在着各种大小不同的孔洞和通道，当被检测的高分子溶液随着淋洗液引入柱子后，高分子溶质即向填料内部孔洞渗透，渗透的程度和高分子体积的大小有关。大于填料孔洞直径的高分子只能穿行于填料的颗粒之间，因此将首先被淋洗液带出柱子，而其他分子体积小于填料孔洞的高分子，则可以在填料孔洞内滞留，分子体积越小，则在填料内可滞留的孔洞越多，因此被淋洗出来的时间越长。按此原理，用相关凝胶渗透色谱仪，可以得到聚合物中分子量分布曲线。配合不同组分高分子的质谱分析，可得到不同组分高分子的绝对分子量。用已知分子量的高分子对上述分子量分布曲线进行分子量标定，可得到各组分的相对分子量。由于不同高分子在溶剂中的溶解温度不同，有时需在较高温度下才能制成高分子溶液，这时GPC柱子需在较高温度下工作。

GPC/SEC的分离机理比较复杂!目前有体积

排除理论’扩散理论和构象熵理论等几种解释!其中最有影响力的是体积排除理论(*)"GPC/SEC的固定相是表面和内部有着各种各样’大小不同的孔洞和通道的微球!可由交联度很高的聚苯乙烯’聚丙

烯酰胺’葡萄糖和琼脂糖的凝胶以及多孔硅胶’多孔玻璃等来制备"当被分析的聚合物试样随着溶剂引入柱子后!由于浓度的差别!所用溶质分子都力图向填料内部孔洞渗透"较小的分子除了能进入较大的孔外!还能进入较小的孔*较大的分子就只能进入较大的孔*而比最大的孔还要大的分子就只能停留在填料颗粒之间的空隙中"随着溶剂洗提过程的进行!经过多次渗透&扩散平衡!最大的聚合物分子从

载体的粒间首先流出!依次流出的是尺寸较小的分子!最小的分子最后被洗提出来!从而达到依高分子体积进行分离的目的!得出高分子尺寸大小随保留时间$或保留体积Y O’淋出体积Y D%变化的曲线!即分子量分布的色谱图"高分子在溶液中的体积决定于相对分子量’高分子链的柔顺性’支化’溶剂和温

度!当高分子链的结构’溶剂和温度确定后!高分子的体积主要依赖于相对分子量"基于上述理论!

GPC/SEC的每根色谱柱都是有极限的!即#排阻极限和渗透极限"排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔

穴内部的最小分子的分子量!所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部!直接从凝胶颗粒外流出!不但达不到分离的目的还有堵塞凝胶孔的可能*渗透极限是指能够完全进入凝胶颗粒孔穴内部的最大分子的分子量!如果两种分子都能全部进入凝胶颗粒孔穴内部!即使它们的大小有差别!也不会有好的分离效果"所以!在使用GPC/SEC测定相对分子量时!必须首先选择好与聚合物相对分子量

范围相配的色谱柱"对一般色谱分辨率和分离效率的评定指标!在凝胶渗透色谱中也被沿用"