第四讲 蛋白质的化学修饰
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其同位素标记量或光谱强度或顺磁共振谱或荧光标 记量等来确定反应程度。
一般认为：测定被修饰的氨基酸，要比测定氨基酸 的减少量更准确。
三、化学修饰数据的分析
⒈化学修饰的时间进程曲线
以修饰时间对蛋白质活性作图
可以了解修饰残基的性质和数目，修饰残基与蛋白质活性的 关系，实际上是蛋白质失活速度常数的测定
探索性研究时，对修饰对象的了解不多，所以选择修饰剂
和修饰条件至关重要，选择的正确性直接影响到修饰反应 的专一性和有效性。
⒈试剂选择
不同实验，对修饰的专一性要求也不同，因此选择试剂在 很大程度上要依赖修饰目的。
例如，对氨基的修饰，仅修饰氨基；仅修饰α-氨基；修 饰暴露的或反应性高的氨基。
一般通过选择试剂和反应条件来控制修饰的部位和程度
度不相同，可获得多相修饰半对数图
斜率=-K失活 /2.3 logE1/E0
min
⒉确定必需基团的性质和数目
蛋白质分子中某些侧链基团在功能上虽有必需和非 必需之分，但它们往往都能与某一试剂起反应。
1961年Ray等提出用比较一级反应动力学常数来确
定必需基团的性质和数目的方法，但是该法的局限
性大，现基本被放弃。
第四讲 蛋白质的化学修饰
一、概述
指在温和条件下，蛋白质侧链基团与化学试剂形成专一性
共价键的反应。
涉及蛋白质侧链及修饰剂的反应性两个方面
化学修饰的意义
改造蛋白质，改善其功能性质，使适用于更广泛领域；科 学研究，例如酶的活性中心，致病性，药物生物大分子相 互作用、药物设计等。
⒈蛋白质功能基的反应性
例如，α-溴代丁酸可烷化核糖核酸酶His12，而且反
应很快；若用α-溴代戊酸修饰，则很难进行反应；
α-溴代己酸则不能发生反应，这显然与位阻有关。
⑷催化因素
修饰部位附近的其它功能基，若有酸碱催化作用，也 能影响修饰反应。
例如，对硝基苯乙酸盐和苯乙酸盐以同一机理对胰凝
乳蛋白酶的活性丝氨酸进行乙酰化，但苯乙酸盐反应
蛋白质-His（N-CH2COO-）+H++I-(pH6)
⑶利用某些产物的不稳定性
高pH下，用氰酸、二硫化碳、O-甲基异脲和亚氨基酸等可转
变氨基成脲和胍的衍生物。虽然巯基也能与上述试剂作用， 但因pH高，形成的产物迅速被分解。
⑷亲和标记
亲和试剂先以非共价键结合到蛋白质的活性部位，再发生化
学作用。因此亲和标记试剂必须与蛋白质作用的底物或抑制 剂相似，可顺利到达修饰位点，而且还能与特定活性基团反 应。例如，利用对甲基苯磺酸氯（CH3-C6H4-SO2Cl），就能 作用于胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸上。
通过X射线分析蛋白质所得的数据显示，多数非 极性侧链位于蛋白质分子的内部，而大部分极性
侧链则位于其表面。蛋白质分子表面不规则，极
性也不相同。 蛋白质功能基所处的微环境强烈影响它的物理和 化学性质，同时也影响参与修饰的化学试剂接近， 从而显著影响对该功能基的化学修饰。
•就目前的研究成果来看，蛋白质的修饰反应
例如2-氯酚pK比2-溴酚pK值高0.7pH单位，这是由于
氯与酚基形成氢键的能力比溴强。水杨酸的羧基可
与其酚基形成氢键，结果使其羧基的pK值比正常值 小1个pH单位，同时使酚基的正常pK10改变到pK13， 因此，在蛋白质的酚基-羧基相互作用中，羧基的pK 值应比正常值低，而酚基的pK值高于正常值。
例如，枯草杆菌蛋白酶的所有10个Tyr残基均在分子表面， 而且其酚羟基几乎都不形成氢键。对它进行彻底硝化和碘 化，10个Tyr中也只有8个被修饰，这很可能是空间障碍所 引起的。
此外，电荷转移，共价键形成，金属鳌合等都会改变蛋白
质功能基的反应性。
⒉蛋白质功能基的超反应性
超反应性是指蛋白质中的某侧链基团与某试剂发
蛋白质构象改变会导致微区极性的局部改
变，这种改变对
Trp，Met和Cys的反应性影响最小;
对氨基和咪唑基的反应性影响较大;
而对Tyr，Hcys和COOH的反应性影响最大。 此外，极性的变化也影响到反应类型。
⑵氢键效应
氢键对维持天然蛋白质及其离子稳定性有重要影响，
氢键的变化也可能导致pK发生改变。
生反应的能力。
超反应性基团一般与蛋白质的某种功能性有关。
超反应基团并不一定在酶的活性中心。
例如，木瓜蛋白酶中的19个Tyr残基中只有一个能
与二异丙基氟磷酸反应，该残基被修饰后并不一
定使酶活性发生改变。
•影响超反应性的因素很复杂
•包括；⑴功能基的pKa；⑵功能基的亲核性；⑶
吸引试剂并使其适当取向的能力；⑷功能基所在
性差，这与酶的酸碱催化有关。硝基苯乙酸盐对丝氨 酸酶的反应性较高，这与Ser附近的路易斯碱与羧酸羟 基氢作用，削弱该氧原子对羧基碳的吸电子相互作用 有关。
O Ser OH HO C CH2 CH2 NO2
⑸局部环境的极性
溶剂极性可能与反应速度有关，如下表：
反应类型
⒈RSR+ICH2CONH2 ⒉RSR+H2O2 ⒊RS-+ ICH2CONH2 ⒋RN+H3+OCN-
例如，在结晶状态下修饰，可提高修饰的专一性。核糖核
酸酶在晶体状态下进行羧甲基化时，反应主要集中在 His119，而对His12的修饰则很少，两者之比为60∶1；在 溶液中该反应的比例为15∶1。
二、确定修饰程度和修饰部位
通过对被修饰蛋白质的降解和氨基酸分析后鉴定修 饰部位。
通过纯化被修饰蛋白质的氨基酸及其衍生物，测定
⑴选择专一性试剂
蛋白质分子的特殊空间结构能影响其某些基团的活性。 例如DFP能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸作用，导致 酶迅速失活。
CH3 H3 C CH
O P F +
CH3 CH CH3
HO
Ser
Enzyme
CH3 H 3C CH
O P O + HF
CH3 CH Ser CH3 Enzyme
⑵选择不同的反应pH
反电荷的某一残基定位。
•例如，用碘乙酸和碘乙酰胺对His咪唑基烷基化的速
度和烷基化部位的差异就是由于静电作用造成的。 （His的N-1或N-3的烷基化）
CH N C H ICH2
C NH
CH2
CH N +H 3
COO-
COOH
ICH2
CONH2
⑶位阻因素
蛋白质表面的位阻，或底物、辅助因子、抑制剂产 生的位阻都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。
降低极性对速度的影响
[R2S+CH2CONH2]IR2SO+H2O R2SCH2CONH2+IRNHCONH2 适当或大大降低 没有影响 没有影响 适当或大大增加
疏水环境能阻止产物电荷分离的反应（反应1），
并能加速电荷中和的反应（反应4）；
对于反应2（没有电荷分离）和反应3，电荷只是 从一个离子转移到另一个离子，则介质是的极性 是不重要的。
O
H Cl
O
H Br
NH2
Pro
O-
C
O
H
O
⑶静电效应
蛋白质中组氨酸残基的pK值是不同的。例如，碳酸
酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基，pK值分
别是：
碳酸酐酶：
葡萄球菌核酸酶：
5.91
5.37
6.04 7.00 7.23
5.71 5.74 6.50
组氨酸在这两个蛋白质中的pK值范围是5.37～7.23，
•如果希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，应该选择能引入
最大电荷量的试剂。
•例如用顺丁烯二酸酐可将中性的巯基和酸性条件下带正电荷
的氨基转变成在中性pH下带负电荷的衍生物。
O CH2 CH2 C O C O + H2 N Pro CH2 CH2 C C O NH OO Pro
修饰对有机溶剂不稳定的蛋白质，必须在水介质中进行，
都是亲核反应。即与参与修饰的化学试剂是富
电子的，进攻蛋白质侧链基团的缺电子部分，
反之亦然。
特别注意：被修饰蛋白质侧链基团的亲核性与其pK值 相关。
影响蛋白质侧链基团pK值的因素有：
⑴微区极性 决定基团解离状态的关键因素之一。例如，溶菌酶中 第Glu35的γ-羧基在水溶液中的pKa=5.9；当其与抑制 剂三-N-乙酰氨基葡萄糖结合后，此时Glu35的γ-羧基 pKa=6.4，上升了0.5。可能是由于抑制剂的加入，改 变了该酶的构象，使该残基微区极性降低之故。
二、化学修饰的方法学
进行蛋白质修饰时，首先是选择修饰剂和修饰条件， 以期提高修饰反应的专一性，获得满意的修饰结果。 其次，在修饰反应过程中，要建立适当的方法追踪反
应进程，以获得与修饰有关的数据。
然后分析获得的数据，确定修饰部位和修饰程度，提 出对修饰结果的合理解释。
一、控制修饰反应的专一性
ICH2COOH+蛋白质-SH ICH2COOH+蛋白质-S-CH3 ICH2COOH+蛋白质-NH2
蛋白质-S-CH2COO-+H++I- (pH＞7) 蛋白质-S（-CH3）-CH2COO-+I- (pH3) 蛋白质-NH-CH2COO-+H++I- (pH＞8)
wenku.baidu.com
ICH2COOH+蛋白质-His
区域与修饰剂的立体化学适应性。
•⒊修饰剂的反应性
•蛋白质的构象和表面特性既影响氨基酸侧链的反
应性，也可能对接近功能基的修饰剂产生影响。
修饰剂修饰蛋白质反应的活性由以下因素所决定： ⑴选择吸附 修饰剂与蛋白质功能基之间的选择性吸附越强，反应 性越大。
⑵静电相互作用
带电荷的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相
均受pH的影响，控制反应pH值，可调控蛋白质分子各
功能基的解离程度，从而控制修饰反应的专一性。
例如，用碘乙酸或其酰胺可与半胱氨酸、甲硫氨酸、 组氨酸的侧链及α-氨基、ε-氨基发生作用；pH6时， 它只专一的与组氨酸的咪唑基作用；pH值为3时，专 一与Met作用（在酸性下，巯基和氨基都呈正离子， 不活泼）。
应选择在水中有一定溶解度的试剂。
在选择试剂时，应考虑反应生成物容易进行定量测定，即
有特殊的光吸收或同位素标记等。
选择试剂时，应注意其体积，体积过大，引起的空间障碍 大,而不能或不易与作用的基团接近。一般而言，试剂体 积较小为宜。
选择试剂时，应该考虑修饰反应要达到的程度；修饰后蛋
白质构象是否基本保持不变；是否需要分离修饰后的衍生
1962年，邹承鲁提出更具普遍应用意义的统计学方法，即邹
氏作图法
该法认为：当试剂仅作用于蛋白质分子中一种基团，而且必 需基团和非必需基团与试剂作用的速度相同时，活力变化与 修饰残基之间有如下关系： α1/i=X；[x=（n-m）/ n] α为实验测得的平均活力剩余分数，x是基团的保留分数，n 为蛋白质分子中可被修饰的基团总数，m为已被修饰的基团数。
⒉选择反应条件
修饰蛋白质的反应条件，除允许修饰反应能顺利进行外， 还必须满足：
不造成蛋白质的不可逆变性;
有利于专一性修饰蛋白质。
为此，应尽量控制反应的温度、pH值、反应介质和缓冲液
等，以保证蛋白质特定空间构象尽量不变。
⒊反应的专一性
专一性对蛋白质的化学修饰至关重要，用以下途径可 以保证修饰的专一性：
几乎相差2个pH单位，可能是邻近带电基团相互影响 所致。
总之
影响蛋白质可解离氨基酸侧链pKa值、可影响 这些侧链基团的反应性。
蛋白质功能基的微区状态不同，反应性不同。 功能基反应性差异可通过竞争标记法来测定。
⑷位阻效应
蛋白质表面的侧链基团旁有烷基等较大基团时，有基团空 间位阻，影响与修饰剂接近及反应。
物，反应是否需要可逆等因素。
总之理想的修饰酶活性部位氨基酸残基的试剂应该
具备以下特征:
即选择性地与一个氨基酸残基反应；
反应须在酶蛋白不变性的条件下进行；
标记的残基在肽中稳定，易通过降解分离并进行鉴 定；
反应程度可用简单的技术测定。 但是，一种试剂往往不能同时满足上述所有条件， 所以必须根据具体实验要求进行取舍。
⑸差别标记
以底物或抑制剂保护蛋白质的活性部位基团，使其
不能与修饰试剂作用，可修饰非必需基团。然后将
过量的底物或抑制剂除去，获得部分修饰的蛋白质。 将其与同位素标记的同样试剂作用，则获得带有放 射性同位素标记的蛋白质活性中心基团。
⑹利用蛋白质状态的差异
在不同状态下，蛋白质的构象有差异，暴露的基团也不同， 因此在不同状态下修饰，可获得相关信息。
若蛋白质活性仅与某个残基有关，则可用公式（后面）表示 Log E1/E0 = - K失活· t E1为时间t时的活力，E0为初始活力， E1/E0为时间t时的残余 活力
用残余活力的对数对时间作图，即可求出失活的速度常数
斜率=-K失活 /2.3 logE1/E0
min
若蛋白质活力与两个以上的残基有关，而且与修饰剂反应速
一般认为：测定被修饰的氨基酸，要比测定氨基酸 的减少量更准确。
三、化学修饰数据的分析
⒈化学修饰的时间进程曲线
以修饰时间对蛋白质活性作图
可以了解修饰残基的性质和数目，修饰残基与蛋白质活性的 关系，实际上是蛋白质失活速度常数的测定
探索性研究时，对修饰对象的了解不多，所以选择修饰剂
和修饰条件至关重要，选择的正确性直接影响到修饰反应 的专一性和有效性。
⒈试剂选择
不同实验，对修饰的专一性要求也不同，因此选择试剂在 很大程度上要依赖修饰目的。
例如，对氨基的修饰，仅修饰氨基；仅修饰α-氨基；修 饰暴露的或反应性高的氨基。
一般通过选择试剂和反应条件来控制修饰的部位和程度
度不相同，可获得多相修饰半对数图
斜率=-K失活 /2.3 logE1/E0
min
⒉确定必需基团的性质和数目
蛋白质分子中某些侧链基团在功能上虽有必需和非 必需之分，但它们往往都能与某一试剂起反应。
1961年Ray等提出用比较一级反应动力学常数来确
定必需基团的性质和数目的方法，但是该法的局限
性大，现基本被放弃。
第四讲 蛋白质的化学修饰
一、概述
指在温和条件下，蛋白质侧链基团与化学试剂形成专一性
共价键的反应。
涉及蛋白质侧链及修饰剂的反应性两个方面
化学修饰的意义
改造蛋白质，改善其功能性质，使适用于更广泛领域；科 学研究，例如酶的活性中心，致病性，药物生物大分子相 互作用、药物设计等。
⒈蛋白质功能基的反应性
例如，α-溴代丁酸可烷化核糖核酸酶His12，而且反
应很快；若用α-溴代戊酸修饰，则很难进行反应；
α-溴代己酸则不能发生反应，这显然与位阻有关。
⑷催化因素
修饰部位附近的其它功能基，若有酸碱催化作用，也 能影响修饰反应。
例如，对硝基苯乙酸盐和苯乙酸盐以同一机理对胰凝
乳蛋白酶的活性丝氨酸进行乙酰化，但苯乙酸盐反应
蛋白质-His（N-CH2COO-）+H++I-(pH6)
⑶利用某些产物的不稳定性
高pH下，用氰酸、二硫化碳、O-甲基异脲和亚氨基酸等可转
变氨基成脲和胍的衍生物。虽然巯基也能与上述试剂作用， 但因pH高，形成的产物迅速被分解。
⑷亲和标记
亲和试剂先以非共价键结合到蛋白质的活性部位，再发生化
学作用。因此亲和标记试剂必须与蛋白质作用的底物或抑制 剂相似，可顺利到达修饰位点，而且还能与特定活性基团反 应。例如，利用对甲基苯磺酸氯（CH3-C6H4-SO2Cl），就能 作用于胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸上。
通过X射线分析蛋白质所得的数据显示，多数非 极性侧链位于蛋白质分子的内部，而大部分极性
侧链则位于其表面。蛋白质分子表面不规则，极
性也不相同。 蛋白质功能基所处的微环境强烈影响它的物理和 化学性质，同时也影响参与修饰的化学试剂接近， 从而显著影响对该功能基的化学修饰。
•就目前的研究成果来看，蛋白质的修饰反应
例如2-氯酚pK比2-溴酚pK值高0.7pH单位，这是由于
氯与酚基形成氢键的能力比溴强。水杨酸的羧基可
与其酚基形成氢键，结果使其羧基的pK值比正常值 小1个pH单位，同时使酚基的正常pK10改变到pK13， 因此，在蛋白质的酚基-羧基相互作用中，羧基的pK 值应比正常值低，而酚基的pK值高于正常值。
例如，枯草杆菌蛋白酶的所有10个Tyr残基均在分子表面， 而且其酚羟基几乎都不形成氢键。对它进行彻底硝化和碘 化，10个Tyr中也只有8个被修饰，这很可能是空间障碍所 引起的。
此外，电荷转移，共价键形成，金属鳌合等都会改变蛋白
质功能基的反应性。
⒉蛋白质功能基的超反应性
超反应性是指蛋白质中的某侧链基团与某试剂发
蛋白质构象改变会导致微区极性的局部改
变，这种改变对
Trp，Met和Cys的反应性影响最小;
对氨基和咪唑基的反应性影响较大;
而对Tyr，Hcys和COOH的反应性影响最大。 此外，极性的变化也影响到反应类型。
⑵氢键效应
氢键对维持天然蛋白质及其离子稳定性有重要影响，
氢键的变化也可能导致pK发生改变。
生反应的能力。
超反应性基团一般与蛋白质的某种功能性有关。
超反应基团并不一定在酶的活性中心。
例如，木瓜蛋白酶中的19个Tyr残基中只有一个能
与二异丙基氟磷酸反应，该残基被修饰后并不一
定使酶活性发生改变。
•影响超反应性的因素很复杂
•包括；⑴功能基的pKa；⑵功能基的亲核性；⑶
吸引试剂并使其适当取向的能力；⑷功能基所在
性差，这与酶的酸碱催化有关。硝基苯乙酸盐对丝氨 酸酶的反应性较高，这与Ser附近的路易斯碱与羧酸羟 基氢作用，削弱该氧原子对羧基碳的吸电子相互作用 有关。
O Ser OH HO C CH2 CH2 NO2
⑸局部环境的极性
溶剂极性可能与反应速度有关，如下表：
反应类型
⒈RSR+ICH2CONH2 ⒉RSR+H2O2 ⒊RS-+ ICH2CONH2 ⒋RN+H3+OCN-
例如，在结晶状态下修饰，可提高修饰的专一性。核糖核
酸酶在晶体状态下进行羧甲基化时，反应主要集中在 His119，而对His12的修饰则很少，两者之比为60∶1；在 溶液中该反应的比例为15∶1。
二、确定修饰程度和修饰部位
通过对被修饰蛋白质的降解和氨基酸分析后鉴定修 饰部位。
通过纯化被修饰蛋白质的氨基酸及其衍生物，测定
⑴选择专一性试剂
蛋白质分子的特殊空间结构能影响其某些基团的活性。 例如DFP能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸作用，导致 酶迅速失活。
CH3 H3 C CH
O P F +
CH3 CH CH3
HO
Ser
Enzyme
CH3 H 3C CH
O P O + HF
CH3 CH Ser CH3 Enzyme
⑵选择不同的反应pH
反电荷的某一残基定位。
•例如，用碘乙酸和碘乙酰胺对His咪唑基烷基化的速
度和烷基化部位的差异就是由于静电作用造成的。 （His的N-1或N-3的烷基化）
CH N C H ICH2
C NH
CH2
CH N +H 3
COO-
COOH
ICH2
CONH2
⑶位阻因素
蛋白质表面的位阻，或底物、辅助因子、抑制剂产 生的位阻都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。
降低极性对速度的影响
[R2S+CH2CONH2]IR2SO+H2O R2SCH2CONH2+IRNHCONH2 适当或大大降低 没有影响 没有影响 适当或大大增加
疏水环境能阻止产物电荷分离的反应（反应1），
并能加速电荷中和的反应（反应4）；
对于反应2（没有电荷分离）和反应3，电荷只是 从一个离子转移到另一个离子，则介质是的极性 是不重要的。
O
H Cl
O
H Br
NH2
Pro
O-
C
O
H
O
⑶静电效应
蛋白质中组氨酸残基的pK值是不同的。例如，碳酸
酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基，pK值分
别是：
碳酸酐酶：
葡萄球菌核酸酶：
5.91
5.37
6.04 7.00 7.23
5.71 5.74 6.50
组氨酸在这两个蛋白质中的pK值范围是5.37～7.23，
•如果希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，应该选择能引入
最大电荷量的试剂。
•例如用顺丁烯二酸酐可将中性的巯基和酸性条件下带正电荷
的氨基转变成在中性pH下带负电荷的衍生物。
O CH2 CH2 C O C O + H2 N Pro CH2 CH2 C C O NH OO Pro
修饰对有机溶剂不稳定的蛋白质，必须在水介质中进行，
都是亲核反应。即与参与修饰的化学试剂是富
电子的，进攻蛋白质侧链基团的缺电子部分，
反之亦然。
特别注意：被修饰蛋白质侧链基团的亲核性与其pK值 相关。
影响蛋白质侧链基团pK值的因素有：
⑴微区极性 决定基团解离状态的关键因素之一。例如，溶菌酶中 第Glu35的γ-羧基在水溶液中的pKa=5.9；当其与抑制 剂三-N-乙酰氨基葡萄糖结合后，此时Glu35的γ-羧基 pKa=6.4，上升了0.5。可能是由于抑制剂的加入，改 变了该酶的构象，使该残基微区极性降低之故。
二、化学修饰的方法学
进行蛋白质修饰时，首先是选择修饰剂和修饰条件， 以期提高修饰反应的专一性，获得满意的修饰结果。 其次，在修饰反应过程中，要建立适当的方法追踪反
应进程，以获得与修饰有关的数据。
然后分析获得的数据，确定修饰部位和修饰程度，提 出对修饰结果的合理解释。
一、控制修饰反应的专一性
ICH2COOH+蛋白质-SH ICH2COOH+蛋白质-S-CH3 ICH2COOH+蛋白质-NH2
蛋白质-S-CH2COO-+H++I- (pH＞7) 蛋白质-S（-CH3）-CH2COO-+I- (pH3) 蛋白质-NH-CH2COO-+H++I- (pH＞8)
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ICH2COOH+蛋白质-His
区域与修饰剂的立体化学适应性。
•⒊修饰剂的反应性
•蛋白质的构象和表面特性既影响氨基酸侧链的反
应性，也可能对接近功能基的修饰剂产生影响。
修饰剂修饰蛋白质反应的活性由以下因素所决定： ⑴选择吸附 修饰剂与蛋白质功能基之间的选择性吸附越强，反应 性越大。
⑵静电相互作用
带电荷的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相
均受pH的影响，控制反应pH值，可调控蛋白质分子各
功能基的解离程度，从而控制修饰反应的专一性。
例如，用碘乙酸或其酰胺可与半胱氨酸、甲硫氨酸、 组氨酸的侧链及α-氨基、ε-氨基发生作用；pH6时， 它只专一的与组氨酸的咪唑基作用；pH值为3时，专 一与Met作用（在酸性下，巯基和氨基都呈正离子， 不活泼）。
应选择在水中有一定溶解度的试剂。
在选择试剂时，应考虑反应生成物容易进行定量测定，即
有特殊的光吸收或同位素标记等。
选择试剂时，应注意其体积，体积过大，引起的空间障碍 大,而不能或不易与作用的基团接近。一般而言，试剂体 积较小为宜。
选择试剂时，应该考虑修饰反应要达到的程度；修饰后蛋
白质构象是否基本保持不变；是否需要分离修饰后的衍生
1962年，邹承鲁提出更具普遍应用意义的统计学方法，即邹
氏作图法
该法认为：当试剂仅作用于蛋白质分子中一种基团，而且必 需基团和非必需基团与试剂作用的速度相同时，活力变化与 修饰残基之间有如下关系： α1/i=X；[x=（n-m）/ n] α为实验测得的平均活力剩余分数，x是基团的保留分数，n 为蛋白质分子中可被修饰的基团总数，m为已被修饰的基团数。
⒉选择反应条件
修饰蛋白质的反应条件，除允许修饰反应能顺利进行外， 还必须满足：
不造成蛋白质的不可逆变性;
有利于专一性修饰蛋白质。
为此，应尽量控制反应的温度、pH值、反应介质和缓冲液
等，以保证蛋白质特定空间构象尽量不变。
⒊反应的专一性
专一性对蛋白质的化学修饰至关重要，用以下途径可 以保证修饰的专一性：
几乎相差2个pH单位，可能是邻近带电基团相互影响 所致。
总之
影响蛋白质可解离氨基酸侧链pKa值、可影响 这些侧链基团的反应性。
蛋白质功能基的微区状态不同，反应性不同。 功能基反应性差异可通过竞争标记法来测定。
⑷位阻效应
蛋白质表面的侧链基团旁有烷基等较大基团时，有基团空 间位阻，影响与修饰剂接近及反应。
物，反应是否需要可逆等因素。
总之理想的修饰酶活性部位氨基酸残基的试剂应该
具备以下特征:
即选择性地与一个氨基酸残基反应；
反应须在酶蛋白不变性的条件下进行；
标记的残基在肽中稳定，易通过降解分离并进行鉴 定；
反应程度可用简单的技术测定。 但是，一种试剂往往不能同时满足上述所有条件， 所以必须根据具体实验要求进行取舍。
⑸差别标记
以底物或抑制剂保护蛋白质的活性部位基团，使其
不能与修饰试剂作用，可修饰非必需基团。然后将
过量的底物或抑制剂除去，获得部分修饰的蛋白质。 将其与同位素标记的同样试剂作用，则获得带有放 射性同位素标记的蛋白质活性中心基团。
⑹利用蛋白质状态的差异
在不同状态下，蛋白质的构象有差异，暴露的基团也不同， 因此在不同状态下修饰，可获得相关信息。
若蛋白质活性仅与某个残基有关，则可用公式（后面）表示 Log E1/E0 = - K失活· t E1为时间t时的活力，E0为初始活力， E1/E0为时间t时的残余 活力
用残余活力的对数对时间作图，即可求出失活的速度常数
斜率=-K失活 /2.3 logE1/E0
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若蛋白质活力与两个以上的残基有关，而且与修饰剂反应速