炭疽检验技术

（五）炭疽病原学检查—— PCR鉴定试验
引物序列：
cap外F：CCTGGTTGTTCTTTTCGTTGC cap外R：CGGATTGTATATGGAGTGGG 产物大： 1242bp rpoB普1F：GTACGCCAATCGATATCATG rpoB普1R：GATCATCGTCATCTTCCGTA 产物大 小：618bp pagA普F: ATTTGCGGTAACACTTCACT pagA普R: AGACCGTGACAATGATGGAA 产物大 小：923bp
处理的可溶性 热沉淀抗原 白色沉淀环
炭疽菌沉淀血清
（四）炭疽病原学检查—— 鉴定试验
3、动力试验
在盖玻片周围涂凡士林，将待检菌的液体
培养物或固体培养物用生理盐水制成的均匀悬
液滴于中央，再将凹玻片盖于其上。迅速翻过
来使盖玻片在上，菌悬液悬成滴。置高倍镜下 观察，细菌不应有运动。
（四）炭疽病原学检查—— 鉴定试验
（一）炭疽病原学检查——
标本采集和样品处理
1、血液标本 所有的疑似病例和病畜，都应采取 血液标本5-10ml，标本量至少应满足下列检查的 需要：
涂片进行显微镜检查； 接种培养基进行细菌分离培养； 分离血清检查抗体； 常规血液检查。 荧光定量PCR检测
2、皮肤溃疡标本 在皮肤炭疽病人溃疡边缘用 棉拭子擦拭，沾取分泌物。
4、噬菌体裂解和青霉素敏感性 将挑取的可疑菌落密集划线接种于平板 上，在划线区内一处滴一诊断用炭疽噬 菌体，另一处贴一片青霉素纸片。37 ℃孵育8～24h后，在滴噬菌体处有透 明噬菌体斑，青霉素纸片周围有明显的 抑菌环，便宜可断定接种物为炭疽芽胞 杆菌。
（四）炭疽病原学检查—— 鉴定试验 4、噬菌体裂解和青霉素敏感性
四、抵抗力
芽胞抵抗力强
煮沸40min或干热140º 3h灭活； C 在干燥土壤或皮毛中能存活数年至20年； 对化学消毒剂抵抗力强(5%石炭酸5d杀死）； 对碘及氧化剂较敏感； 繁殖体的抵抗力弱 对青霉素、红霉素、氯霉素敏感
五、炭疽实验室检查
炭疽病原学检查
炭疽血清学检查
五、炭疽实验室检查
炭疽病原学检查 标本采集和样品处理
A：炭疽芽孢薄片（透射电镜）有致密的胞膜 B：炭疽芽孢（扫描电镜）收缩成椭圆形 C：炭疽繁殖体薄片（透射电镜）
二、培养特性
炭疽杆菌为兼性需氧菌，在12～44℃都 能生长，最适生长温度为37℃。最适pH为 7.3～7.6。 在普通琼脂平皿培养基上生长成不透明、 灰白色、扁平、表面粗糙的菌落，边缘不整 齐，能形成几个或数十个菌体相连的长链， 低倍显微镜观察呈卷发状。在血液琼脂平皿 培养基上，生长出湿润粘稠的菌落，菌落周 围不溶血。
（四）炭疽病原学检查—— 鉴定试验
2、Ascoli试验
取一玻璃沉淀管（直径 2-4 mm，高20-40 mm），将 0.3 ml炭疽菌沉淀血清加于 小玻璃管底部，再缓缓加入 采集处理的可溶性热沉淀抗 原约0.3ml于血清上层，注意 勿使液面混合。置37℃ 5 min，于两液面间出现白色沉 淀环为阳性。 本实验应有炭疽菌诊断 抗原作阳性对照。
光镜下炭疽杆菌菌落边缘呈卷发状
在血液琼脂平皿培养基上不溶血或微溶血
三、致病性与免疫性
致病物质:主要有二种
• •
荚膜:由质粒编码,具有抗吞噬作用 炭疽毒素:由质粒编码（致死主要因素） 保护性抗原（protective antigen ，
PA） 水肿因子 （edema factor ， EF） 致死因子 (lethal factor ， LF)
炭疽杆菌在病人、病畜体内 荚膜染色 多散在或呈2～3个短链排列， 在碳酸盐培养基中、 有荚膜（红色） 厌氧环境下生成荚膜。
一、病原——炭疽杆菌（Bacillus anthracis）

在活炭疽病畜体或死亡后未经 解剖的尸体内，不形成芽胞。 一旦体内炭疽杆菌暴露于空气 中，接触了游离氧，在一定温 度下(12--42℃)就会形成芽胞。 芽胞呈卵圆形或圆形，位于菌 体中央或稍偏向一端。
（三）炭疽病原学检查—— 细菌分离培养
在血平皿上为白 色菌落，较粘， 不溶血或微溶血 。
（四）炭疽病原学检查—— 鉴定试验
1、肉汤生长
在静止液体 培养基中生长在 上层和底部，培 养基透明，拿起 则呈丝絮状下垂， 摇之均匀混浊， 无菌膜和壁环 。
（四）炭疽病原学检查—— 鉴定试验
2、Ascoli试验 诊断炭疽简便而快速的方法，其优点是培养 失效时，仍可用于诊断，因而适宜于腐败病料及 动物皮张或风干、淹浸过肉品的检验。但此法缺 乏高度特异性，因为炭疽杆菌耐热抗原在其他腐 生芽胞杆菌也共有。 新鲜、陈旧和外环境标本都可采样20-50g， 加水5-10倍，煮沸10分钟，用双层滤纸过滤后制 成可溶性热沉淀抗原，用于热沉淀反应（Ascoli 试验。
（四）炭疽病原学检查—— 鉴定试验
5、串珠试验 制备有牛肉消化液琼 脂培养基的载玻片，涂 种待检菌，在一端加青 霉素纸片或纸条。置平 皿中于37℃培养4 ～ 6 小时后，在低倍镜下观 察。在有菌生长和抑菌 区的临界线处，应有明 显典型串珠形态。
串珠试验时炭疽杆菌的形态： 串珠状或长链状
（四）炭疽病原学检查—— 鉴定试验
Burkholderi 鼻疽伯 a mallei 克菌
4
Coxiella burnetii
伯氏考 克斯体
第二类
BSL-3
ABSL-3
BSL-2
BSL-1
• 大量活菌操作：实验操作涉及“大量”病原菌的制备，或易产生气溶胶的实验操
作（如病原菌离心、冻干等）。 • 动物感染实验：特指以活菌感染的动物实验。 • 样本检测：包括样本的病原菌分离纯化、药物敏感性实验、生化鉴定、免疫学实 验、PCR核酸提取、涂片、显微观察等初步检测活动。 • 非感染性材料的实验：如不含致病性活菌材料的分子生物学、免疫学等实验。
炭疽检验技术
辽宁省cdc
炭疽（Anthrax）
炭疽是由炭疽杆菌引起的人兽共患急性、热 性、败血性传染病。其病理变化的特点是脾脏显 著肿大，皮下及浆膜下结缔组织出血浸润，血液 凝固不良，呈煤焦油样。人感染后多表现为皮肤 炭疽、肺炭疽及肠炭疽，偶有伴发败血症。
通过直接接触、 消化道、呼吸道等途径 感染人类
炭疽病原检验程序
标本 处理（方法根据标本情况选择） 直接涂片、 革兰染色、 荚膜染色、 光镜检查 接种培养 （可用选择性培养基、血培养基） 37℃，16~48 h 基因检测
Ascoli试验
可疑菌落（形态） 初检 培养性鉴定试验 深入鉴定
涂片、革兰 染色、荚膜 染色、 光镜检查
动 力 检 查
液 体 培 养
食草动物
经口 食入
发病、 死亡
食肉动物 偶尔感染
污染环境 形成芽胞
一、病原——炭疽杆菌（Bacillus anthracis）
革兰氏染色阳性； 长而直的大杆菌，菌体两端平直；
5um×3～5um，致病菌中最大的； 无鞭毛，不能运动。
大小为1.0～1.
一、病原——炭疽杆菌（Bacillus anthracis）
（一）炭疽病原学检查——
标本采集和样品处理
5、脑脊液标本 表现为脑膜刺激症状的病人，腰 椎穿刺获取脑脊液。
6、尸体标本 食草动物死于炭疽时，通常会从口、 鼻、肛门等腔道开口流出血液，这种血液应是首 先采取的标本。如果血液已渗入土壤，则应收集 混有血液的土壤作为标本。没有血液流出，或已 不可能获取血液标本时，可通过穿刺心脏获得血 液或穿刺肝脏等实质性脏器获得组织标本。
污染或陈旧的标本，均应首先制成悬液。 根据标本中含菌量的多少，可将悬液适当稀释， 或经自然沉淀除去粗大沉淀物后，再10000rpm 离心1分钟，取富集的沉淀物。将所得的悬液沸 水浴15min，冷却后涂布上述两种平板，每平 板0.1ml。
（三）炭疽病原学检查—— 细菌分离培养
以上的平皿在37℃孵育 过夜或24小时后，观察培 养情况。 粗糙不发光，比较扁平， 有点儿象蜡样杆菌的菌落 但较小，卷发状。有的菌 体形态不规则，有彗星状 拖尾，白或灰白色。
（一）炭疽病原学检查——
标本采集和样品处理
7、肉类标本 如果怀疑罹患炭疽的牲畜已被宰杀， 或对商品肉类进行常规检查时，可剪取小块肉类 标本。如有可能，特别应剪取肝脏、脾脏等富含 血以及含有淋巴组织的标本。
8、毛皮或其他可疑污染物品标本 剪取小块毛皮 或其他可疑物品，剪碎置无菌试管内，加适量的 无菌生理盐水浸泡。
细菌培养 涂片、革兰染色、荚膜染色、光镜检查 Ascoli试验 动力检查 噬菌体裂解和青霉素敏感性试验 串珠试验 生化试验
炭疽PCR基因检测
五、炭疽实验室检查
炭疽血清学检查
标本采集和样品处理
血清中抗炭疽芽胞和毒素IgG水平检测
（酶联免疫吸附实验ELISA） 血清中抗炭疽荚膜抗体胶体金检测
6、生化试验
葡 萄 糖 + 麦 芽 糖 + 蔗 糖 + 乳 糖 — 甘 露 醇 — 水 杨 素 — M R V P 石蕊牛乳
— —
产酸，液 化迟缓 不产生靛 基质和 H2S
产酸不产气
API 50CH/E鉴定条可以进行炭疽生化鉴定
（五）炭疽病原学检查—— PCR鉴定试验
待测模板的制备：
模板制备可直接从标本样品，也可从培养 物制。标本将炭疽杆菌接种于固体培养基平 板上，37℃培养18h，取培养物悬浮于1ml生 理盐水，离心，弃上清，沉淀用ph7.8TE溶液 洗起悬浮，于沸水浴中煮15min。离心，上清 用0.22um的滤器除菌过滤。滤液即为模板， 可置4℃备用于PCR扩增。
《人间传染的病原微生物名录》
序 号
1 2 3
病原菌名称
学名 Bacillus anthracis Brucella spp 中文名 炭疽芽 孢杆菌 布鲁氏 菌属
危害程 度分类
第二类 第二类 第二类
实验活动所需生物安全实验室级别
大量活菌 操作 BSL-3 BSL-3 BSL-3 动物感染 实验 ABSL-3 ABSL-3 ABSL-3 样本检 测 BSL-2 BSL-2 BSL-2 非感染性材料 的实验 BSL-1 BSL-1 BSL-1
（一）炭疽病原学检查——
标本采集和样品处理
9、水标本 检查水体污染时，用广口瓶收集水样。 10、土壤标本 在牲畜死亡或宰杀的地点，应取土 壤标本以供检查。一般要采集表层土壤（10cm 内），每份150g左右。
（二）炭疽病原学检查—— 显微镜检查
所有来自病人、病畜、尸体的标本都应首先 进行直接涂片镜检。 步骤： 涂片、革兰染色及荚膜染色、显微镜检查 镜检：取末稍血液或其他材料制成涂片后， 染色镜检，发现有多量单在、成对或2～4个 菌体相连的短链排列、竹节状有荚膜的粗大 杆菌，即可确诊。
噬菌体裂解 和青霉素敏 感性试验
产荚膜培 养及光镜 检查
串 珠 试 验
生 化 试 验
基 因 检 测
酶免疫 法测外 毒素
动物 毒性 测定
（一）炭疽病原学检查——
标本采集和样品处理 采取标本时必须遵循的两条原则
1、尽可能的在抗生素治疗前采取标本； 2、除必要时并在具备条件的实验室内，不得用 解剖的方式获取标本，所需的血液与组织标本， 均应以穿刺方式取得。
（二）炭疽病原学检查—— 显微镜检查
革兰染色
（二）炭疽病原学检查wk.baidu.com— 显微镜检查
荚膜染色
（三）炭疽病原学检查—— 细菌分离培养
采集到的标本均应进行细菌分离培养。 培养基选用血琼脂平板、营养琼脂平板和选 择性平板。
（三）炭疽病原学检查—— 细菌分离培养
标本处理：
无菌的标本，如血液或脑脊液，直接涂布上 述两种平板，每平板0.1ml，组织标本应先以无 菌剪刀剪开一断面，在培养基表面压印，然后 以白金耳涂开。
（一）炭疽病原学检查——
标本采集和样品处理
3、粪便与呕吐物标本 表现消化道症状的可疑病 人收集粪便或呕吐物标本，特别注意选取其中混 有血液的部分，置无菌的容器中。 4、痰与咳碟标本 表现为呼吸道症状的可疑病人 应收集其痰液标本，无痰液者，应取供细菌分离 培养用的培养基，打开平皿盖置病人口鼻10cm 处；令病人对平皿咳嗽，然后迅速盖上平皿。
（五）炭疽病原学检查—— PCR鉴定试验
反应体系
10×反应缓冲液
(50µl)
5µl 4×dNTP混合物（每种2.5mM） 4µl 引物（上游） 1µl 引物（下游） 1µl 待测模板 1µl 无菌去离子水 37µl Taq DNA 聚合酶 1µl